專利名稱：一種應(yīng)用于吡蟲啉農(nóng)藥殘留檢測的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗農(nóng)藥吡蟲啉單克隆抗體及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。專用于 農(nóng)產(chǎn)品和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中吡蟲啉殘留的靈敏、快速檢測，特別適用于大批量樣品檢測。
背景技術(shù)：
吡蟲啉(imidacloprid)，1_(6_氯_3_吡啶甲基)_N_硝基_2_咪唑啉亞胺，屬于 新型煙堿類殺蟲劑，中等毒性，通過作用于昆蟲體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶受體而使害蟲麻痹，最 終死亡。吡蟲啉可以有效的防治蚜蟲，飛虱，葉蟬等農(nóng)業(yè)害蟲，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛的 使用。由于近年來該農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的大量使用不僅對環(huán)境造成了污染，而且對人體健 康和一些非靶標(biāo)生物帶來了嚴重的威脅，有相關(guān)報道表明，吡蟲啉對蜜蜂和家蠶有較強的 毒害作用，人若不慎誤食含有吡蟲啉農(nóng)藥殘留的食品后也會出現(xiàn)頭暈、嘔吐等中毒癥狀。因 此，建立吡蟲啉殘留的檢測方法刻不容緩。目前對吡蟲啉農(nóng)藥的殘留分析大多采用氣相色譜法(GC)和高效液相色譜法 (HPLC)，這些方法必須使用昂貴的儀器設(shè)備，對樣品前處理復(fù)雜，操作人員必須經(jīng)過專業(yè)培 訓(xùn)，所以這些方法并不適合樣品的批量篩選，這樣就給食品安全監(jiān)管部門對農(nóng)產(chǎn)品安全監(jiān) 督工作帶來了諸多的不便。自從上個世紀(jì)70年代開創(chuàng)了農(nóng)藥免疫定量分析技術(shù)以來，農(nóng)藥殘留免疫分析技 術(shù)得到了快速的發(fā)展，美國化學(xué)學(xué)會已經(jīng)將免疫分析方法與氣相色譜法、高效液相色譜法 一起列為化學(xué)農(nóng)藥殘留分析的三大支柱，是21世紀(jì)最具競爭性和挑戰(zhàn)性的超微量檢測技 術(shù)。農(nóng)藥殘留的免疫分析技術(shù)是基于抗體與待測小分子農(nóng)藥特異性結(jié)合的分析技術(shù)，這種 分析技術(shù)具有靈敏度高，特異性強，易于標(biāo)準(zhǔn)化，適合大容量樣品分析等優(yōu)點，并且該方法 不需要昂貴的實驗儀器，操作簡便，一般不需要對檢測樣品做復(fù)雜的前處理。國外研究者在 上個世紀(jì)90年代已經(jīng)陸續(xù)報道了多種農(nóng)藥的免疫殘留檢測方法，國內(nèi)這方面的研究較晚， 近幾年才開始有相關(guān)研究人員重視并從事相關(guān)的研究，對于吡蟲啉農(nóng)藥單克隆抗體制備方 法國內(nèi)并未見相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種可用于吡蟲啉農(nóng)藥殘留檢測的單克隆抗體 及其制備方法，通過合成免疫抗原，免疫BALB/c鼠，通過雜交瘤技術(shù)制備能特異性識別吡 蟲啉農(nóng)藥的單克隆抗體，可用于農(nóng)產(chǎn)品和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中吡蟲啉殘留的靈敏快速檢測。技術(shù)方案1、抗吡蟲啉農(nóng)藥特異性單克隆抗體，是由雜交瘤細胞株2F11/A9產(chǎn)生的，為IgG3 型抗體。2、抗吡蟲啉農(nóng)藥單克隆抗體的制備方法，包括(1)吡蟲啉農(nóng)藥人工抗原的合成將免疫半抗原1-[6-(2_羧乙硫基-3-吡啶)甲基]-N-硝基-2-咪唑啉亞胺，簡稱H1，與牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)，獲得吡蟲啉人工免疫原Hl-BSA ；將包被半抗原 1-(6-氯-3-吡啶甲基)-3_羧丙基-N-硝基-2-咪唑啉亞胺，簡稱H2，與卵清蛋白OVA偶 聯(lián)，獲得包被抗原H2-0VA ；(2)小鼠免疫將制備好的Hl-BSA作為免疫原免疫6-8周齡雌性BALB/c鼠，每次每只小鼠的免 疫原用量lOOyg，共免疫四次，首次免疫由等體積的免疫原和弗氏完全佐劑乳化，腹腔注 射，以后四次免疫用等體積的弗氏不完全佐劑和免疫原乳化；第一次和第二次免疫間隔3 周，以后間隔2周；從第三次開始，每次免疫后一周，鼠尾靜脈采血，以H2-0VA作為包被原，用非競爭 間接ELISA法檢測抗體的效價用碳酸鹽包被緩沖液稀釋包被H2-0VA，96孔酶標(biāo)板中每孔 加入50 μ L，于37°C孵育2小時，將酶標(biāo)板中包被液倒盡，并用含體積比0. 05%吐溫20的磷 酸鹽緩沖液洗滌5次；將明膠用磷酸鹽緩沖液溶解配制成的封閉液，96孔酶標(biāo)板中每孔加入 100 μ L，37°C孵育1. 5小時，將酶標(biāo)板中封閉液倒盡，并用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液 洗滌5次；將小鼠血清用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液稀釋，96孔酶標(biāo)板中每孔加入 50 μ L，同時用未經(jīng)免疫的小鼠血清設(shè)置陰性對照，37°C孵育0. 5小時，將酶標(biāo)板中反應(yīng)液 倒盡，并用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，96 孔酶標(biāo)板中每孔加入50μ L，37°C孵育0. 5小時，將酶標(biāo)板中反應(yīng)液倒盡，并用含0. 05%吐 溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；用底物緩沖液現(xiàn)配四甲基聯(lián)苯胺顯色液，96孔酶標(biāo)板中每孔加入50μ L，37°C暗 處反應(yīng)IOmin ；96孔酶標(biāo)板中每孔加入2mol/L硫酸25 μ L，終止反應(yīng)；終止顯色后的酶標(biāo)板立即在450nm下測定各孔單波長吸光值；(3)細胞融合選擇經(jīng)間接非競爭ELISA法檢測效價最高的BALB/c小鼠，取脾臟，將脾細胞與對 數(shù)生長期的Sp2/0骨髓瘤細胞通過雜交瘤技術(shù)制備雜交瘤細胞，37°C，體積比5%二氧化碳 培養(yǎng)箱培養(yǎng)7-10天后，通過檢測融合孔上清篩選雜交瘤細胞；(4)雜交瘤篩選融合孔上清，采用間接非競爭ELISA法進行初步篩選，其方法為用碳酸鹽包被緩沖液稀釋包被原H2-0VA，96孔酶標(biāo)板中每孔加入50 μ L，于37°C 孵育2小時，將酶標(biāo)板中包被液倒盡，并用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；將明膠用磷酸鹽緩沖液溶解配制成的封閉液，96孔酶標(biāo)板中每孔加入 100 μ L，37°C孵育1. 5小時，將酶標(biāo)板中封閉液倒盡，并用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液 洗滌5次；將免疫小鼠血清用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液稀釋，96孔酶標(biāo)板中每孔 加入50μ L，以未融合細胞的上清作為陰性對照，以免疫小鼠的血清為陽性對照，37°C孵育 0. 5小時，將酶標(biāo)板中反應(yīng)液倒盡，并用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；
用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，96 孔酶標(biāo)板中每孔加入50μ L，37°C孵育0. 5小時，將酶標(biāo)板中反應(yīng)液倒盡，并用含0. 05%吐 溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；用底物緩沖液現(xiàn)配四甲基聯(lián)苯胺顯色液，96孔酶標(biāo)板中每孔加入50μ L，37°C暗 處反應(yīng)IOmin ；96孔酶標(biāo)板中每孔加入2mol/L硫酸25 μ L，終止顯色；終止顯色后的酶標(biāo)板立即在450nm下測定各孔單波長吸光值；有融合細胞的上清的讀數(shù)等于或大于陰性對照讀數(shù)的2. 1倍時，這樣的融合孔即 為陽性孔；為了進一步確定得到陽性孔所分泌抗體是針對吡蟲啉農(nóng)藥，再通過競爭間接 ELISA法篩選。其方法為用碳酸鹽包被緩沖液稀釋包被原H2-0VA，96孔酶標(biāo)板中每孔加入50 μ L，于37°C 孵育2小時，將酶標(biāo)板中包被液倒盡，并用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；將明膠用磷酸鹽緩沖液溶解配制成的封閉液，96孔酶標(biāo)板中每孔加入 100 μ L，37°C孵育1. 5小時，將酶標(biāo)板中封閉液倒盡，并用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液 洗滌5次；配制一系列濃度的吡蟲啉農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，丙酮溶解，用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩 沖液稀釋20倍后，與細胞培養(yǎng)上清等體積充分混合，以每孔50μ L加到酶標(biāo)板中，以未融合 細胞的上清與含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液等體積混合液作為陰性對照，37°C孵育0. 5 小時，將酶標(biāo)板中反應(yīng)液倒盡，并用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，96 孔酶標(biāo)板中每孔加入50μ L，37°C孵育0. 5小時，將酶標(biāo)板中反應(yīng)液倒盡，并用含0. 05%吐 溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；用底物緩沖液現(xiàn)配四甲基聯(lián)苯胺顯色液，96孔酶標(biāo)板中每孔加入50μ L，37°C暗 處反應(yīng)IOmin ；96孔酶標(biāo)板中每孔加入2mol/L硫酸25 μ L，終止顯色，終止顯色后的酶標(biāo)板立即 在450nm下測定各孔單波長吸光值，用只加細胞培養(yǎng)上清而不含農(nóng)藥的孔作陽性對照吸光 值為Btl，加農(nóng)藥的孔吸光值為B，gB < Btl，則說明所制備的抗體能與農(nóng)藥反應(yīng)，這樣的孔即 為陽性孔，陽性孔通過有限稀釋法進行亞克隆，其雜交瘤細胞分泌的上清即為所制的單克 隆抗體。產(chǎn)生上述單克隆抗體的雜交瘤細胞株2F11/A9于2010年5月19日保藏于中國典 型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :C201047。有益效果與現(xiàn)有檢測技術(shù)相比，其優(yōu)點和積極效果表現(xiàn)在實用性好傳統(tǒng)的農(nóng)藥分析主要在實驗室進行，其前處理過程煩瑣，分析速度 慢、成本高，使用的大量有機溶劑易造成環(huán)境污染，且對實驗室的儀器化程度和人員素質(zhì) 要求較高，不能滿足農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中對快速、簡便、準(zhǔn)確、大量檢測的需求。而我們提供的 ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)檢測方法具有操作簡單、快速(以封閉好的微量分析板做檢測 只需要1. 5-2小時即可)、分析成本低、分析容量大、安全可靠等優(yōu)點，一般不需貴重儀器，可大量簡化甚至省去前處理過程，對使用人員的專業(yè)技術(shù)水平要求不高，容易普及和推廣， 特別適用于大批量樣本檢測和現(xiàn)場監(jiān)測?？乖涂贵w穩(wěn)定性好此法合成的免疫原和包被原具有較好的穩(wěn)定性，_20°C冰箱 至少可以存放5年不影響其免疫原性。雜交瘤細胞凍存于液氮至少保持3年，抗體的穩(wěn)定 性也比較好，純化的抗體-20°C冰箱至少可以存放2年。特異性好這種方法所得到的抗吡蟲啉的單克隆抗體可以特異性的識別吡蟲啉農(nóng) 藥，對其他農(nóng)藥幾乎沒有識別。靈敏度高檢測限要低于其他常規(guī)的檢測方法，可以達到1. 08μ g/L。本發(fā)明在人工化學(xué)合成抗原、免疫小鼠、細胞融合、篩選等大量前期工作基礎(chǔ)上獲 得了能穩(wěn)定分泌特異性抗吡蟲啉農(nóng)藥單克隆抗體的雜交瘤細胞株。以制備的特異性抗吡蟲 啉農(nóng)藥單克隆抗體為基礎(chǔ)，以偶聯(lián)物H2-0VA作為檢測抗原，通過優(yōu)化檢測體系，建立了一 套更加靈敏的吡蟲啉農(nóng)藥殘留酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測方法，為吡蟲啉農(nóng)藥殘留檢測試劑盒 的開發(fā)提供了基礎(chǔ)，為環(huán)境安全檢測提供了重要的工具。
具體實施例方式1、吡蟲啉農(nóng)藥免疫原Hl-BSA的合成方法為(1)吡蟲啉農(nóng)藥免疫半抗原1-[6-(2-羧乙硫基-3-吡啶)甲基]_N_硝基_2_咪 唑啉亞胺(分子式為=
結(jié)構(gòu)式為的合成采用朱國念
等人發(fā)表在學(xué)術(shù)刊物《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)》上的方法合成化合物1-[6-(2-羧乙硫基-3-吡啶) 甲基]-N-硝基-2-咪唑啉亞胺(Hl)。該化合物被我們用作吡蟲啉農(nóng)藥免疫半抗原。朱國念 等人發(fā)表的含有上述化合物合成方法的研究論文在《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)》上的具體位置為2005 年第38卷第511至515頁。(2)吡蟲啉農(nóng)藥免疫原Hl-BSA的合成反應(yīng)瓶中加入吡蟲啉農(nóng)藥免疫半抗原Hl 0. 026g和N-羥基琥珀酰亞胺0. 018g，再加入N, N- 二甲基甲酰胺0. 3mL溶解；稱取0. 04g 二環(huán)己基碳二亞胺，用0.2mL N, N-二甲基甲酰胺溶解，并緩慢滴加到反應(yīng)瓶中，反應(yīng)在磁 力攪拌下室溫進行12小時。反應(yīng)終液經(jīng)8000r/min離心5分鐘，取上清緩慢地加入到2mL 15mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)中，反應(yīng)在磁力攪拌下室溫攪拌6小時。待反應(yīng)完成后，將 反應(yīng)液置于透析袋內(nèi)，于0.02mol/L，pH 6. 8的磷酸緩沖液中4°C攪拌透析，每四小時換一 次透析液，共透析60小時。透析結(jié)束后，將透析袋中的液體經(jīng)8000r/min離心5分鐘，所得 上清液即為吡蟲啉農(nóng)藥免疫原H1-BSA。將所得免疫原Hl-BSA取出分裝保存于_20°C冰箱 中備用。2、吡蟲啉農(nóng)藥包被抗原H2-0VA的合成方法為(1)吡蟲啉農(nóng)藥包被半抗原1-(6-氯-3-吡啶甲基)-3-羧丙基-N-硝基-2-咪唑 啉亞胺(分子式為=C13H16O4N5Cl,結(jié)構(gòu)式為jQQ^^ )的合成 稱取吡蟲啉1. 03g(4mmol)于IOOml三口燒瓶中，用15mL DMF溶解，在0°C的條件下，邊攪拌邊加入NaH(0. 1032g，4. 3mmol)，反應(yīng)1小時后，向反應(yīng)液中滴加4-溴丁酸乙酯 (2. 23g，lOmmol)，繼續(xù)在室溫下攪拌12小時，然后將反應(yīng)物倒入80mL水中，調(diào)節(jié)溶液的pH 值到6-7之間，混合物用氯仿(2X80mL)萃取，有機層經(jīng)過水洗后用無水硫酸鈉干燥，然后 減壓濃縮得粗品。硅膠柱層析(環(huán)己烷/乙酸乙酯2 7(v/v))得純品。將1.71g(4.6mm0l) 由上述步驟得到的純品在酸性溶液中水解(2mol/L HCl,60-70°C,4h)之后用lmol/L NaOH 溶液調(diào)整PH值至6，用乙酸乙酯萃取(2 X 50mL)，無水硫酸鈉干燥，然后減壓濃縮得粗品。 硅膠柱層析(乙酸乙酯/甲醇4 1 (ν/ν))得1-(6-氯-3-吡啶甲基)-3-羧丙基-N-硝 基-2-咪唑啉亞胺(Η2)純品。(2)吡蟲啉農(nóng)藥免疫原H2-0VA的合成反應(yīng)瓶中加入吡蟲啉農(nóng)藥包被半抗原 Η2 0.026g和N-羥基琥珀酰亞胺0.0115g，再加入N，N-二甲基甲酰胺0. 3mL溶解；稱取 0.0248g 二環(huán)己基碳二亞胺，用0. 2mL N，N-二甲基甲酰胺溶解，并緩慢滴加到反應(yīng)瓶中，反 應(yīng)在磁力攪拌下室溫進行12小時。反應(yīng)終液經(jīng)SOOOr/min離心5分鐘，取上清緩慢地加入 到2mL 10mg/mL的卵清蛋白(OVA)中，反應(yīng)在磁力攪拌下室溫攪拌6小時。待反應(yīng)完成后， 將反應(yīng)液置于透析袋內(nèi)，于0. 02mol/L, pH 6. 8的磷酸緩沖液中4°C攪拌透析，每四小時換 一次透析液，共透析60小時。透析結(jié)束后，將透析袋中的液體經(jīng)8000r/min離心5分鐘，所 得上清液即為吡蟲啉農(nóng)藥免疫原H2-0VA。將所得免疫原H2-0VA取出分裝保存于_20°C冰 箱中備用。3、單克隆抗體有效性驗證通過添加回收實驗驗證抗體在吡蟲啉農(nóng)藥殘留檢測中的有效性。在一定量的樣 品中添加一定量的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，通過添加提取液將樣品中的吡蟲啉萃取出來，經(jīng)過稀釋后 用于ELISA分析，經(jīng)過公式換算后得到樣品中農(nóng)藥的含量，進而計算回收率，若回收率在 80% -120%之間，則認為該抗體可用于此樣品中吡蟲啉殘留檢測。實施例1 自來水樣品中檢測吡蟲啉農(nóng)藥殘留量ELISA反應(yīng)體系主要條件H2-0VA包被物1. 82 μ g/mL在微量分析板中每孔加50 μ L，單克隆抗體稀釋32倍 作為工作濃度，明膠作封閉物，抗原抗體反應(yīng)液(含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液)中 丙酮含量為5%、ρΗ值為7. 5、離子強度為0. 8mol/L，微量分析板中每孔50 μ L。待測樣品準(zhǔn)備自來水樣品將吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品凈重250mg加入到ImL丙酮溶液中溶解，配制成 250mg/mL的吡蟲啉丙酮溶液，量取自來水1L，加入1 μ L 250mg/mL的吡蟲啉丙酮溶液，配制 成250 μ g/L的吡蟲啉自來水樣品。采用ELISA檢測方法對以上樣品進行檢測，操作如下(1)包被H2-0VA作為包被物，1. 82 μ g/mL在微量分析板中每孔加50 μ L，37°C孵育2小時， 倒凈，以含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次并倒置，在吸水紙上拍干；(2)封閉1 %明膠作封閉物，微量分析板每孔100 μ L，37°C孵育1. 5小時，倒凈，以含0. 05%
吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次并倒置，在吸水紙上拍干；(3)加抗體與待測樣品的混合液
取待測樣品100 μ L加到900 μ L反應(yīng)基質(zhì)中配制成待測液，稀釋16倍的細胞培養(yǎng) 上清與待測液和含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液等體積充分混合，以每孔50 μ L加到微量 分析板中，37°C孵育0. 5小時，倒凈，以含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次并倒置， 在吸水紙上拍干；(4)加酶標(biāo)二抗用pH 7. 4,0. 15mol/L的含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液將商品化的辣根過氧化 物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體稀釋20000倍，微量分析板每孔加50μ L，37°C孵育0. 5小時，倒凈， 以含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次并倒置，在吸水紙上拍干。(5)顯色微量分析板每孔加50 μ L的四甲基聯(lián)苯胺底物溶液，37°C顯色反應(yīng)10分鐘。(6)終止反應(yīng)并讀數(shù)加2mol/L的硫酸，微量分析板每孔加25 μ L終止顯色反應(yīng)，酶聯(lián)儀上450nm處讀 出，吸光值，B0 = 0. 805，待測樣品吸光值B = 0. 193 ；(7)數(shù)據(jù)處理計算出結(jié)合率B/B。= 23. 975%，代入公式1Logit (B/B0) = In[(B/B0)/(l-B/B0)] 公式 1得到Logit (B/B。)= -1. 154代人如下檢測方程Logit (B/B0) +3. 7732LogC_2. 9435 = 0 公式 2其中C為微量分析板孔中測得的吡蟲啉濃度，求得C = 12. 189 μ g/L。待測樣品中 吡蟲啉殘留量(以濃度X表示)可通過公式3求得X= 10X2C 公式 3求得待測樣本吡蟲啉殘留量濃度X = 243. 8 μ g/L，其回收率(以Y表示)可通過 公式4求得回收率)=實際檢測濃度/實際添加濃度X 100% 公式4求得回收率為97. 5%，說明該抗體可用于檢測環(huán)境中水樣的吡蟲啉殘留量。實施例2 大米樣品中檢測吡蟲啉農(nóng)藥殘留量ELISA反應(yīng)體系主要條件同實施例1。待測樣品準(zhǔn)備稱取Ig大米，研磨成粉末，將濃度為250 μ g/L的吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)溶液(丙酮溶解)ImL 添加到Ig的樣品中，則大米樣品中的吡蟲啉含量為250 μ g/kg，震蕩(60r/min) 2小時，震蕩 結(jié)束后靜置幾分鐘，取上清100 μ L加到900 μ L含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液中配制成 待測液。采用ELISA檢測方法對以上樣品進行檢測，操作如下步驟(1)、(2)同實施例1。(3)加抗體與待測樣品的混合液稀釋16倍的細胞培養(yǎng)上清與待測液和含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液等體積充 分混合后，以每孔50μ L加到微量分析板中，37°C孵育0. 5小時，倒凈，以含0. 05%吐溫20 的磷酸鹽緩沖液洗滌5次并倒置，在吸水紙上拍干；
步驟⑷、(5)、(6)同實施例1 ；步驟(6)中讀取吸光值，B0 = 0. 857，待測樣品吸光值B = O. 190 ；(7)數(shù)據(jù)處理計算出結(jié)合率B/B。= 22. 184%，代入公式1Logit (B/B0) = In[(B/B0)/(l-B/B0)]公式 1得到Logit (B/B0) = -1. 255代人如下檢測方程Logit (B/B0) +3. 7732LogC-2. 9435 = O 公式 2其中C為微量分析板孔中測得的吡蟲啉濃度，求得C= 12. 963 μ g/kg。待測樣品 中吡蟲啉殘留量(以濃度X表示)可通過公式3求得X= 10X2C 公式 3求得待測樣本吡蟲啉殘留量濃度X = 259. 3 μ g/kg，其回收率(以Y表示)可通過 公式4求得回收率)=實際檢測濃度/實際添加濃度X 100% 公式4求得回收率為103. 7%，說明該抗體可用于檢測農(nóng)產(chǎn)品大米的吡蟲啉殘留量。
權(quán)利要求
抗吡蟲啉農(nóng)藥特異性單克隆抗體，是由雜交瘤細胞株2F11/A9產(chǎn)生的，為IgG3型抗體。
2.權(quán)利要求1所述抗吡蟲啉農(nóng)藥單克隆抗體的制備方法，包括(1)吡蟲啉農(nóng)藥人工抗原的合成將免疫半抗原1-[6-(2-羧乙硫基-3-吡啶)甲基]-N-硝基-2-咪唑啉亞胺，簡稱Hl， 與牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)，獲得吡蟲啉人工免疫原Hl-BSA ；將包被半抗原1-(6_氯-3-吡 啶甲基)-3-羧丙基-N-硝基-2-咪唑啉亞胺，簡稱H2，與卵清蛋白OVA偶聯(lián)，獲得包被抗原 H2-0VA ；(2)小鼠免疫將制備好的Hl-BSA作為免疫原免疫6-8周齡雌性BALB/c鼠，每次每只小鼠的免疫原 用量lOOyg，共免疫四次，首次免疫由等體積的免疫原和弗氏完全佐劑乳化，腹腔注射，以 后四次免疫用等體積的弗氏不完全佐劑和免疫原乳化；第一次和第二次免疫間隔3周，以 后間隔2周；從第三次開始，每次免疫后一周，鼠尾靜脈采血，以H2-0VA作為包被原，用非競爭間接 ELISA法檢測抗體的效價用碳酸鹽包被緩沖液稀釋包被H2-0VA，96孔酶標(biāo)板中每孔加入 50 μ L，于37°C孵育2小時，將酶標(biāo)板中包被液倒盡，并用含體積比0. 05%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液洗滌5次；將明膠用磷酸鹽緩沖液溶解配制成的封閉液，96孔酶標(biāo)板中每孔加入IOOyL, 37°C孵育1. 5小時，將酶標(biāo)板中封閉液倒盡，并用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5 次；將小鼠血清用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液稀釋，96孔酶標(biāo)板中每孔加入50 μ L， 同時用未經(jīng)免疫的小鼠血清設(shè)置陰性對照，37°C孵育0. 5小時，將酶標(biāo)板中反應(yīng)液倒盡，并 用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，96孔酶 標(biāo)板中每孔加入50μ L，37°C孵育0. 5小時，將酶標(biāo)板中反應(yīng)液倒盡，并用含0. 05%吐溫20 的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；用底物緩沖液現(xiàn)配四甲基聯(lián)苯胺顯色液，96孔酶標(biāo)板中每孔加入50yL，37°C暗處反 應(yīng) IOmin ；96孔酶標(biāo)板中每孔加入2mol/L硫酸25 μ L，終止反應(yīng)；終止顯色后的酶標(biāo)板立即在450nm下測定各孔單波長吸光值；(3)細胞融合選擇經(jīng)間接非競爭ELISA法檢測效價最高的BALB/c小鼠，取脾臟，將脾細胞與對數(shù)生 長期的Sp2/0骨髓瘤細胞通過雜交瘤技術(shù)制備雜交瘤細胞，37°C，體積比5%二氧化碳培養(yǎng) 箱培養(yǎng)7-10天后，通過檢測融合孔上清篩選雜交瘤細胞；(4)雜交瘤篩選融合孔上清，采用間接非競爭ELISA法進行初步篩選，其方法為用碳酸鹽包被緩沖液稀釋包被原H2-0VA，96孔酶標(biāo)板中每孔加入50μ L，于37°C孵育 2小時，將酶標(biāo)板中包被液倒盡，并用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；將明膠用磷酸鹽緩沖液溶解配制成的封閉液，96孔酶標(biāo)板中每孔加入IOOyL,37°C孵育1. 5小時，將酶標(biāo)板中封閉液倒盡，并用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5 次；將免疫小鼠血清用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液稀釋，96孔酶標(biāo)板中每孔加入 50μ L，以未融合細胞的上清作為陰性對照，以免疫小鼠的血清為陽性對照，37°C孵育0. 5 小時，將酶標(biāo)板中反應(yīng)液倒盡，并用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，96孔酶 標(biāo)板中每孔加入50μ L，37°C孵育0. 5小時，將酶標(biāo)板中反應(yīng)液倒盡，并用含0. 05%吐溫20 的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；用底物緩沖液現(xiàn)配四甲基聯(lián)苯胺顯色液，96孔酶標(biāo)板中每孔加入50yL，37°C暗處反 應(yīng) IOmin ；96孔酶標(biāo)板中每孔加入2mol/L硫酸25 μ L，終止顯色； 終止顯色后的酶標(biāo)板立即在450nm下測定各孔單波長吸光值； 有融合細胞的上清的讀數(shù)等于或大于陰性對照讀數(shù)的2. 1倍時，這樣的融合孔即為陽 性孔；為了進一步確定得到陽性孔所分泌抗體是針對吡蟲啉農(nóng)藥，再通過競爭間接ELISA法 篩選。其方法為用碳酸鹽包被緩沖液稀釋包被原H2-0VA，96孔酶標(biāo)板中每孔加入50 μ L，于37°C孵育 2小時，將酶標(biāo)板中包被液倒盡，并用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；將明膠用磷酸鹽緩沖液溶解配制成的封閉液，96孔酶標(biāo)板中每孔加入100 μ L， 37°C孵育1. 5小時，將酶標(biāo)板中封閉液倒盡，并用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5 次；配制一系列濃度的吡蟲啉農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，丙酮溶解，用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液 稀釋20倍后，與細胞培養(yǎng)上清等體積充分混合，以每孔50 μ L加到酶標(biāo)板中，以未融合細胞 的上清與含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液等體積混合液作為陰性對照，37°C孵育0. 5小 時，將酶標(biāo)板中反應(yīng)液倒盡，并用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，96孔酶 標(biāo)板中每孔加入50μ L，37°C孵育0. 5小時，將酶標(biāo)板中反應(yīng)液倒盡，并用含0. 05%吐溫20 的磷酸鹽緩沖液洗滌5次；用底物緩沖液現(xiàn)配四甲基聯(lián)苯胺顯色液，96孔酶標(biāo)板中每孔加入50yL，37°C暗處反 應(yīng) IOmin ；96孔酶標(biāo)板中每孔加入2mol/L硫酸25 μ L，終止顯色，終止顯色后的酶標(biāo)板立即在 450nm下測定各孔單波長吸光值，用只加細胞培養(yǎng)上清而不含農(nóng)藥的孔作陽性對照吸光值 為Btl，加農(nóng)藥的孔吸光值為B，gB < Btl，則說明所制備的抗體能與農(nóng)藥反應(yīng)，這樣的孔即為 陽性孔，陽性孔通過有限稀釋法進行亞克隆，其雜交瘤細胞分泌的上清即為所制的單克隆 抗體。
3.產(chǎn)生權(quán)利要求1或2所述的雜交瘤細胞株2F11/A9于2010年5月19日保藏于中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :C201047。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗吡蟲啉農(nóng)藥單克隆抗體及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。用免疫半抗原1-[6-(2-羧乙硫基-3-吡啶)甲基]-N-硝基-2-咪唑啉亞胺與牛血清白蛋白的偶聯(lián)物免疫BALB/c鼠，將免疫后的小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞Sp2/0通過雜交瘤技術(shù)制備雜交瘤細胞，獲得了能穩(wěn)定分泌抗吡蟲啉農(nóng)藥單克隆抗體的雜交瘤株2F11/A9。此抗體經(jīng)過有效性驗證證明可用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中吡蟲啉殘留的靈敏快速檢測。本發(fā)明涉及的抗吡蟲啉農(nóng)藥單克隆抗體制備技術(shù)簡便可行，抗體的整個制備過程無需要特別的儀器設(shè)備，容易工廠化規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C07K16/44GK101880325SQ20101020493
公開日2010年11月10日 申請日期2010年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月22日
發(fā)明者劉鳳權(quán), 華修德, 李剛, 秦娜, 錢國良 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)