專利名稱：用于純化粘菌素的方法和純化的粘菌素組分的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種純化抗生素的方法。
背景技術(shù)：
在革蘭氏陰性細菌，尤其是綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、鮑氏不動桿菌 (Acinetobacter baumannii)禾ロ肺炎克雷イ白菌(Klebsiella pneumoniae),中提高的多藥耐藥性提出了一個關(guān)鍵性問題。有限的治療備選方案已經(jīng)迫使傳染病臨床醫(yī)師和微生物學家重新評估粘菌素(也稱作多粘菌素幻的臨床應(yīng)用，粘菌素是一種與多粘菌素B相似但又不完全相同的多粘菌素抗生素。由于粘菌素具有更寬的治療指數(shù)，因此其可具有優(yōu)于多粘菌素B的明顯優(yōu)勢。粘菌素于1947年首次從多粘芽孢桿菌變種粘菌素(Bacillus polymyxa var. colistinus)中被分離，并且由發(fā)酵產(chǎn)生的多肽的混合物組成。主要組分是多粘菌素E1,E2、 も和 E1-Ile (圖 1)。商業(yè)上，粘菌素作為硫酸粘菌素出現(xiàn)，其ロ服用于腸道去污，并且局部施用作為用于皮膚感染的粉劑，以及作為粘菌素甲磺酸鈉(colistimethate sodium)，其被腸胃外施用以及通過吸入劑使用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與粘菌素相比，粘菌素甲磺酸鈉的毒性更小且具有更少的不良副作用，但是藥效仍然較低(參見Critical Care 2006，10 :R27 (doi :10. 1186/ cc3995)，作者為 Falagas 和 Kasiokou)。硫酸粘菌素通常被配制成軟膏劑、滴耳混懸劑以及耳用溶液和眼用溶液。硫酸粘菌素也作為混懸劑或片劑被ロ服給予以治療腸道感染，或用于抑制結(jié)腸菌群。粘菌素甲磺酸鈉是可被用于治療囊性纖維變性患者中的綠膿桿菌感染的粘菌素的半合成前藥，并且其最近已被用于治療多藥耐藥性不動桿菌感染。粘菌素甲磺酸鈉在鮑氏不動桿菌和綠膿桿菌腦膜炎/室炎中也已經(jīng)被鞘內(nèi)給藥和室內(nèi)給藥。粘菌素甲磺酸鈉在水溶液中容易被水解為各種甲烷磺酸衍生物，并且難以進行分析。因為粘菌素是在50多年之前被引入臨床實踐的，因此它的性質(zhì)從未像現(xiàn)代藥物那樣被詳細記錄，例如，涉及藥理學、毒理學、雜質(zhì)含量等的具體要求。由于這個原因，可商購的粘菌素產(chǎn)品除了含有主要組分多粘菌素E1之外，還含有很多相關(guān)的活性和非活性物質(zhì)/雜質(zhì)，大部分來源于發(fā)酵過程。圖2中示出了粘菌素的典型HPLC色譜圖。商品化粘菌素的主要組分，多粘菌素E1 (Polymyxin E1)，通常構(gòu)成了干產(chǎn)品的大約 60%。粘菌素產(chǎn)品中一些相關(guān)的物質(zhì)已經(jīng)被表征(圖1)，但是大多數(shù)雜質(zhì)仍是未知的。由 USP (United States Wiarmacopoeia，美國藥典)指定的硫酸粘菌素的最小效價為“不小于 500 μ g/mg”，但是每種組分的具體抗菌活性在很大程度上還是未知的。盡管該產(chǎn)品已經(jīng)被使用超過50年，但是沒有粘菌素的標準化定量，而且也沒有人公開關(guān)于藥理學和藥代動力學的詳細試驗。因而，用于大多數(shù)感染的粘菌素最佳劑量是未知的。同樣地，每種制劑的推薦“最大”劑量也是不同的。各國具有不同的粘菌素一般制備方法，而推薦劑量則取決于制造商。硫酸粘菌素和粘菌素甲磺酸鈉兩者均可被靜脈注射給予，以及作為氣溶膠給予， 但是劑量是復雜的。來自一些制造商的粘菌素甲磺酸鈉處方以國際單位計，而來自其他制造商的相同產(chǎn)品處方以粘菌素基質(zhì)(base)的毫克數(shù)計。這種完全沒有任何規(guī)則或標準化的劑量使得靜脈粘菌素給藥對于任何內(nèi)科醫(yī)師來說都是ー個可怕的經(jīng)歷。與靜脈注射治療一起被描述的主要毒性是腎毒性(對腎臟造成損害)和神經(jīng)毒性 (對神經(jīng)造成損害)，但是這可以反映在早期被給予了非常高的劑量，其比任何制造商目前推薦的劑量要高得多，并且對于腎臟疾病未對其進行調(diào)整。與霧化治療一起被描述的主要毒性是支氣管痙攣。在缺少數(shù)據(jù)支持的情況下，可以推測粘菌素的ー些毒性可能歸因于存在于目前商品化產(chǎn)品中的相關(guān)物質(zhì)和雜質(zhì)。而且，當使用“不純的”粘菌素作為起始原料來合成粘菌素甲磺酸(colistimethate)前藥時，每ー種相關(guān)物質(zhì)和雜質(zhì)都會形成幾種甲磺酸鹽衍生物的基質(zhì)，從而產(chǎn)生非常復雜的終產(chǎn)物一其中每ー種個別物質(zhì)的毒理學性質(zhì)都是使未知的?；谏鲜龅亩纠韺W和藥理學考慮，可以看出，使用“單組份”的各種粘菌素用于醫(yī)療目的具有很大的優(yōu)勢。這樣的單組份粘菌素將含有非常高比例的主要組分多粘菌素 E1 (> 90%，與目前60%相比)，所有的主要雜質(zhì)都被鑒別出并且被表征。單組分粘菌素提供了一些優(yōu)點1)闡明主要組分(PE1).相關(guān)物質(zhì)和雜質(zhì)的毒理學貢獻的可能性2)經(jīng)得起新的和更精確的藥理學和藥代動力學研究檢驗的產(chǎn)品3)合成定義明確的(well-defined)衍生物的可能性，例如，不產(chǎn)生大量不明確 (ill-defined)物質(zhì)的粘菌素甲磺酸4)對粘菌素和粘菌素甲磺酸二者開發(fā)更好的和更精確的分析方法的可能性，并簡化調(diào)控程序5)基于清楚的藥理學和毒理學數(shù)據(jù)的明確用藥劑量建議6)粘菌素到需求量大的“現(xiàn)代”抗生素的升級由于專利文獻或公共領(lǐng)域中均未描述用于制備單組分粘菌素的エ業(yè)規(guī)模的方法， 因此開發(fā)此類產(chǎn)品的制造方法是發(fā)明人的目的。其次，更長期的目的是對純化的進行體外和體內(nèi)效果的重新研究以及毒理學研究，以便與多粘菌素組(group)的之前的研究進行比較。迫切地需要這樣的隨機和對照試驗以便進ー步闡明關(guān)于多粘菌素的效果和安全性的各種問題(Crit Care Clin. 2008 Apr ；24 (2) :377-91，作者為 Micholopoulos 和 Falagas)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種用于純化粘菌素組分，并且尤其是主要組分，多粘菌素E1的方法。本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)粘菌素主要組分的幾乎純制劑的方法，該主要組分是多粘菌素E1 (90-98%純度)，其被稱為粘菌素單組分。該方法是ー種使用低毒性溶劑的簡單的色譜方法。該方法涉及反相(RP)色譜法， 其使得能夠?qū)⒍嗾尘谽1純化達到超過90%的純度，隨后是疏水作用色譜法(HIC)。該方法的特征是
·粘菌素基質(zhì)在乙酸和高(4M)乙醇濃度中上RP柱·用低(1. 6-2M)乙醇濃度洗脫。出人意料的是，該方法能夠被用來從其它主要粘菌素組分中有效地分離多粘菌素
し1 ο涉及合適的RP-材料的鑒定工作在10X250mm的鋼柱上以實驗室規(guī)模進行。Merck LiChrospher 60 RP-選擇B，15 μ πι(ω)被證明是用于以實驗室規(guī)模從粘菌素基質(zhì)純化PE1的合適樹脂，并且該實驗室方法在50 X 850mm鋼柱上從1克按比例放大到 50克的水平。開發(fā)了ー種將粘菌素基質(zhì)溶解于(4M)乙醇和0. IM乙酸并被分成多粘菌素E 片段的方法。該主要組分PE1以60%的典型回收率和94-98%的相對色譜純度被分離。在歐洲藥典(European Pharmacopoeia, EP)中，ー批/ ー批次硫酸粘菌素的效價被定義為多粘菌素因子PE1, PE2, PE3 > PE1-Ile-PE1-TMOA的總和的％含量，在“原樣(as is)”的基礎(chǔ)上由HPLC測定。這些因子的總效價應(yīng)當構(gòu)成不少于77.0%。此外，EP規(guī)定特定因子的最大限值(匪T ；不多于)，例如PE1-Ile(匪T 10%),PEr7M0A(NMT 10%),PE3(NMT 10% )和主要雜質(zhì)NMT 4%。通過利用所描述的純化方法，終產(chǎn)物具有如下的典型組成=PE1^tgsw )、 PE2 (0-0. 1)、PE3 (0. 0)、PE1-Ile (0. 2-1. 0 % ), ΡΕ「7Μ0Α(0· 5-2. 0 % )禾Π 總剩余雜質(zhì) 0. 5-2. 0%。


圖1.硫酸粘菌素、硫酸多粘菌素E1和相關(guān)物質(zhì)的主要組分的分子結(jié)構(gòu)圖2.粘菌素Ph. Eur.化學標準物質(zhì)的HPLC色譜3.該曲線圖說明了在粘菌素基質(zhì)的純化過程中作為流分(fraction)數(shù)的函數(shù)的相對色譜純度；該曲線圖中的fl-El和f2-El在應(yīng)用的說明部分中統(tǒng)稱為も；eEl等于 ei/e2，eeEl等于ち，而eee···是較少的未知雜質(zhì)的總和圖4.該曲線圖說明了在粘菌素基質(zhì)的純化過程中作為流分數(shù)的函數(shù)的各種組分的峰面積；該曲線圖中的fl-El和f2-El在應(yīng)用的說明部分中統(tǒng)稱為；eEl等于ei/e2， eeEl等于e3，而eee···是較少的未知雜質(zhì)的總和圖5.帶有主要雜質(zhì)的粘菌素單組分(P E1)的HPLC色譜圖
具體實施例方式“粘菌素”意指包括抗菌肽組分的任何混合物，其中該主要組分是多粘菌素E1或其
ΠΤ . ο“多粘菌素E/’意指包括之前指定的粘菌素A，以及由化學文摘(Chemical Abstracts)指定的化合物7722-44-3，以及N2_(6_甲基-1_氧代辛基)-L-2，4-ニ氨基丁?；?L-蘇氨酰基-L-2，4- ニ氨基丁?；?L-2，4- ニ氨基丁酰基_L_2，4_ ニ氨基丁酰基-D-亮氨酰-L-亮氨酰-L-2，4- ニ氨基丁?；?L-2，4- ニ氨基丁酰基-L-蘇氨酸環(huán) (10-4)-肽，以及粘菌素IV?！罢尘鼗|(zhì)”意指包括含有30-70%多粘菌素E1的任何粘菌素。
“硫酸粘菌素”意指包括粘菌素的任何硫酸鹽。“粘菌素甲磺酸(colistimethate) ”意指包括粘菌素的任何甲烷磺化衍生物。“組合物”是包含多于兩種不同化合物的任何混合物，例如，兩種活性藥物成分的混合物，或者活性藥物成分與一種或多種藥用賦形劑的混合物。在本申請中使用的術(shù)語“組分”或“多種組分”是指組合物中的特定化合物。相應(yīng)地，“較少組分”是組合物中以相對小的量存在的化合物。“藥物組合物”是適合體內(nèi)使用的任何組合物。因此，這樣的組合物能夠被皮膚、皮下、靜脈注射、腸胃外、ロ服給予等。“分離”是其中將所需化合物與另外的化合物(分析地或制備地)拆分(resolve) 的任何方法?！凹兓笔峭ㄟ^其使所需化合物的濃度增加的任何分離方法?！吧V法”是涉及固定相和流動相的任何純化技木。“固定相”是包含能夠保留化合物的配體(Iigand)的任何表面?！芭潴w”是固定相的基團(moiety)，在該基團處發(fā)生化合物的結(jié)合?！傲鲃酉唷笔悄軌蛟诖_定方向上通過或沿著固定相滲過(percolate)的任何流體、 溶劑、液體或混合物?！胺聪嗌V法”是較強極性或帶電組分在較弱極性組分之前被洗脫的任何色譜法?！笆杷饔蒙V法”基于固定相的非極性配體與非極性化合物或化合物的非極性部分之間的相互作用的任何色譜法。“高乙醇濃度”意指乙醇濃度高于或等于以體積計20%，通常為20% -30%?！暗鸵掖紳舛取币庵敢掖紳舛鹊陀谝泽w積計20%，通常為10-15%?！?% ν/ν"意指體積百分比。商品化粘菌素基質(zhì)是許多密切相關(guān)的十肽-脂肪酸酰胺的混合物，包括多粘菌素 E1、多粘菌素E2、多粘菌素も和多粘菌素E1-異亮氨酸(圖1)。從粘菌素基質(zhì)中分離主要組分多粘菌素E1 (PE1)的愿望引起了人們對反相(RP) HPLC方法是否適合用于其分離，并獲得高相對色譜純度(> 90% )ΡΕ1的調(diào)查研究。文獻中僅提供了非常少的RP分離方法，并且所使用的主要有機溶劑是乙腈和甲醇。這些溶劑是有毒的，并且應(yīng)該在中試規(guī)模(pilot)生產(chǎn)和大規(guī)模生產(chǎn)中避免使用。然而，采用從0至60%乙醇梯度的使用硫酸粘菌素的微克水平C18-HPLC分離試驗出人意料地顯示出，對于多粘菌素E1的エ業(yè)用途的純化方法可以使用相對無毒的溶劑乙醇。通過發(fā)酵和純化生產(chǎn)起始材料(粘菌素基質(zhì))，并且在整裝物質(zhì)(未分裝物質(zhì)， bulk substance)硫酸粘菌素的生產(chǎn)中，該起始材料是中間體。該起始材料含有大約60% 的PE1，批次之間有ー些百分比的不同。初始目標是獲得相對色譜純度> 90%的硫酸多粘菌素Ε”出于作為目標(靶標)的目的，篩選了一系列柱材料用基于乙醇的洗脫系統(tǒng)。多粘菌素E1 (圖1)具有帶有極性十肽部分和非極性脂肪酸部分的離子去污劑特性。該分子由連接到6-甲基-辛烷?；€性三肽的環(huán)七肽組成。由于該分子含有6個1， 4-ニ氨基丁酸(DAB)的部分，其中一個參與三肽成鍵(bond)，5個主要氨基基團與它們相應(yīng)的氨(NH4+)基團平衡，構(gòu)成分子的強極性部分。RP-樹脂和該分子之間的分子間相互作用預期在脂肪酸基團和肽部分的非極性區(qū)域處發(fā)生。為了監(jiān)測HPLC-流分和HPLC-池(pool)，基于標準方法開發(fā)了分析型HPLC-方法。 改進的方法顯示了小量相關(guān)組分(も，ち，ち)在PE1主峰之下，而這在利用傳統(tǒng)HPLC方法時是不可見的。實驗準備型HPLCIOX 250柱為了以毫克量級篩詵柱材料,使用10X250鋼柱。該柱用懸浮在96% 乙醇中的各種測試樹脂填充。50 X 830柱為了以克量級進行制備性純化，如下所述使用50 X 850mm鋼柱。所選擇的柱材料，將約Ikg Merck LiChrosphere 60 RP選擇B (15 μ m)懸浮在96%乙醇中并將其填充入柱中。將其上部法蘭(flange)封上(attach)并以50巴的壓カ降活塞向上推，直到除去所有過量的乙醇。通過施加Iml的0. lmg/ml碘化鉀溶液來測試該柱，并在AUFS = 0. 05且流速為55. 5ml/min，在227nm處測量吸附作用。所記錄的峰是一條具有令人滿意的対稱的窄高斯曲線。該制備型HPLC系統(tǒng)由以下部分組成柱具有由Dan Process A/S制造的動態(tài)軸向壓縮的10 X 250mm不銹鋼Merck柱和50 X 850mm不銹鋼柱泵WatersDeltra Prep 4000，具有 0. 5_150ml/min 的流速間隔，具有 4個不同的溶劑端ロ，在低壓側(cè)有ー個混合閥(mix-valve)檢測器=Waters486 可調(diào)吸光度檢測器(Tunable Absorbance Detector)積分儀Merck-Hitachi D-2000 色譜-積分儀(Chomato-Integrator)流分收集器=Waters流分收集器在230nm處檢測洗脫液的吸光度，乙酸在該處存在截止(cut-off)。在較短波長處，洗脫液顯示太多的干擾。將毫克量級的流分收集于25ml試管中，而將克量級的流動分收集于250ml藍蓋瓶中。為了在每次HPLC-運行后再生10 X 250mm和50 X 850mm柱，使用含有乙醇和 50%在0. IM CH3COOH中的1，2_丙ニ醇的混合物。偶爾會在50X850mm柱上觀察到高反壓， 然后將其重新包裝或用96%乙醇沖洗直至壓カ變得正常。分析型HPLC所使用的柱是Novapak 4. 6X 150，4 μ m，C18，乙腈作為流動相。CH3CN-溶液的濃度在5分鐘的時間間隔內(nèi)從21% (在10分鐘等度運行后)増加到30%。該柱不是恒溫的， 而是在環(huán)境溫度(23士2°C )運行。該分析型HPLC-系統(tǒng)由以下部分組成柱WatersNovapak 4. 6 X 150，4 μ C18 和等價 4· 6 X 250 柱泵2psc.Waters 510，帶有 Waters 泵控制模塊檢測器=Waters 490 E可編程多波長檢測器流分收集器Waters 717，加上自動進樣器該系統(tǒng)由Waters軟件Millenium控制。所測試的樹脂的概況
l)Merck No. 9303 LiChropr 印 RP-18，25-40 μ m，批次L 275703 614。2) Merck No. 9324 LiChropr 印 RP-8，25-40 μ m，批次L 240124 541。3) Merck No. 11023 LiChrospher 60 RP-選擇 B，15 μ m，(C8)，批次L 139923 633。4)Merck No. 150385 Hibar Fertigsaule RT LiChrospher, RP-18, 15 μ m, Cat. 50014。5) Eka Nobel Kromasil-100 A，C8，16 μ m，批次DT0026。6) ToosoHaas Amberchrom CG 71 S，35 μ m，批號 23770319。7) ToosoHaas No. 22227 Toyopearl MD-P 醚，35 μ m,弱疏水性8) ToosoHaas No. 22225 Toyopearl MD-P 丁基，35 μ m,強疏水性用于10X250柱試驗的化學藥品硫酸粘菌素，批次A4660314，Axellia ApS，丹麥哥本哈根粘菌素基質(zhì)，批次A1551701，Axellia ApS，丹麥哥本哈根乙醇，96%，“Danisco 蒸溜器”，Danisco A/S甲醇，Merck LiChrosolv no. 6018ニ 甲亞砜，Merck Uvasol No. 29501，2-丙ニ醇(重蒸，reinst)，Merck no. 74782-丙醇，LiChrosolv 梯度等級，Merck No. 1040乙酸，100% G. R. Merck No. 631-甲基吡咯燒酮-(2) ζ· s. Merck No. 806072三乙胺，PierceNo. 25108四氫呋喃，F(xiàn)luka No. 87367乙酸銨(分析純，p. a. )，Merck No. 1116硫酸銨(分析純，p.a. )，Merck No. 1217硫酸9(分析純，p.a.)氫氧化鈉顆粒，GR,Merck No. 6498超純水，純化實驗室，R&D，TOD，Axellia ApS，丹麥哥本哈根Millipore, HV 型薄膜過濾器，0. 45 μ m用于50X825柱試驗的化學藥品乙醇 96%和 99%，來自 Danisco 蒸溜器，Danisco A/S乙酸，100% G. R. Merck No. 63氫氧化鈉顆粒，GR,Merck No. 6498Na0H，27% 生產(chǎn)部氫氧化鉀，USPXIX, Ferak Berlin No. 2090710X250 柱試驗由于與樹脂的強結(jié)合、明顯的拖尾(tailing)、低色譜純度或低回收率，以下的色譜樹脂被證明不適合用于分離工作ToosoHaas Amberchrom CG 71 S ；ToosoHaas Toyopearl MD-P 35 μ m, ToosoHaas Toyopearl MD-P j-35 μ m ；Merck LiChroprep RP-8, 25-40 μ m ；Merck Hibar Fertigsaule RTLiChrospher, RP-18,15 μ m；Eka NobelKromasil-100 A, C8,16 μ m對于使用LiChropr印C18，25-40 μ m的第一次10 X 250柱試驗，在60分鐘內(nèi)乙醇梯度從0%至60%，pH 3. 5(50mM HAc)，應(yīng)用Ilmg硫酸粘菌素，獲得了約90%良好產(chǎn)率的相對色譜純度(RCP)。然而，當在相同條件下通過試圖在45分鐘內(nèi)施加10-25%乙醇梯度來減小乙醇濃度吋，沒有觀察到分離和明顯拖尾。用5mM NH4HSO4在pH = 2. 5的相似試驗使得化合物在柱上完全結(jié)合。該試驗和相似的試驗強烈表明，粘菌素基質(zhì)而不是硫酸粘菌素應(yīng)當被用于選定條件的PE1純化。如果1，2_丙ニ醇(1，2_PG)作為乙醇的一部分的代替品被加入，例如，在乙醇和20% 1,2-PG的濃度水平下，且乙酸水平(pH = 3)増加至約1 %，這出人意料地得到了一種RCP約為90 %的PE1產(chǎn)品，產(chǎn)率為70 %。在這些初步試驗的基礎(chǔ)上，得出了這樣的結(jié)論，即乙酸對樹脂(LiChropr印C18) 和洗脫液之間的化合物平衡具有積極影響，并且應(yīng)當使用溶解于稀乙酸的粘菌素基質(zhì)而不是硫酸粘菌素。然而，使用1，2_丙ニ醇/乙醇混合物引起該柱材料的明顯壓降，并且因而認為這種特定的樹脂和溶劑混合物不適合按比例放大。顯然，不僅是脂肪酸部分和非-極性氨基酸參與了柱結(jié)合，而且氨基-和銨基基團也參與了柱結(jié)合。上述實驗給出了一些出人意料的結(jié)果，例如，a) EHS-友好的溶劑乙醇作為用于粘菌素反相(RP)HPLC分離的洗脫液是有用的，和b)分離應(yīng)當在乙酸存在下用粘菌素基質(zhì)完成，而不是使用用于進ー步純化的硫酸粘菌素。雖然樹脂LiChropr印C18表現(xiàn)出有希望分離的特性，但是沒有證據(jù)表明其適合用于按比例放大。所列出的可商購色譜介質(zhì)是的范圍很大，但是通過徹底檢查和選擇，我們成功地確定了ー種來自Merck的適合的候選物，即LiChrospher 60 RP-選擇B 15 μ m(C8)。0. IM乙酸中從5至乙醇線性梯度的使用得到了幾乎沒有拖尾的有希望的分離。0. IM乙酸(pH=3)中從5%至15%乙醇梯度取得了很好的效果，但僅具有85-90% PE1 的RCP并且產(chǎn)率低。當嘗試反相乙醇梯度(即在高乙醇濃度施加而在較低乙醇濃度洗脫)吋，出現(xiàn)了重大突破。所進行的具有以下參數(shù)的第一試驗給出了具有90% -95% PE1和約70%產(chǎn)率的池(pool) ο平衡5%乙醇在0. IM乙酸中施加將IlOmg粘菌素基質(zhì)溶解于細1在0. IM乙酸中的30%乙醇洗脫液15%乙醇在0. IM乙酸中，溫度為60°C溫度40°C洗脫液流速2.22ml/min為了在固定相和更快洗脫之間達到粘菌素化合物的平衡，選擇較高的溫度，但試驗顯示較高的溫度對結(jié)果并沒有任何顯著影響。柱箱和流動相二者的溫度均因此而從 40° /60°減小到35° /50°，池純度和產(chǎn)率沒有任何顯著變化。最后，0. IM乙酸中5至 15%乙醇梯度在30° /40°運行具有較好的結(jié)果，這證實了反相梯度實際上是相對色譜純度、產(chǎn)率和拖尾情況出現(xiàn)較大積極變化的原因。應(yīng)注意，在開發(fā)工作中實施了經(jīng)修改的分析型HPLC方法，并且該新方法顯示出了一些相關(guān)物質(zhì)，f和ei/e2，以前它們均被主E1峰掩蓋。相關(guān)物質(zhì)も在PE1峰前面洗脫，而物質(zhì)ei/e2作為在PE1峰的尾部具有兩個左右分裂最大值的雙峰洗脫。這兩種物質(zhì)特別地難以從PE1中分離，并且在將來的制備型HPLC方法的優(yōu)化中構(gòu)成了純化的挑戰(zhàn)。尤其參見圖3和圖4，其中PE1和相關(guān)物質(zhì)的分離用示出了作為HPLC流分的函數(shù)(function)的組分的分布圖來說明。在圖3中，將多粘菌素E1的相對色譜純度與作為流分數(shù)的函數(shù)的相關(guān)物質(zhì)進行比較。最難以從PE1中分離的相關(guān)物質(zhì)是ち/ち，而E1-異亮氨酸、ち和ち(在ち/ち之后洗脫) 較容易去除。圖4示出了從產(chǎn)率角度的結(jié)果，其中組分峰的整合作為流分數(shù)的函數(shù)作圖。主要的池典型地跨越流分7至12，但是可以通過縮小流分選擇來增加純度。實施例-從粘菌素基質(zhì)中純化多粘菌素E1的步驟實施例I-RP-HPLC純化小量制備規(guī)樽設(shè)備鋼柱lOX25Ornrn(0=lOmm)Waters Delta Prep 4000 Prep. Chrom.系統(tǒng)Waters 4000 系統(tǒng)控制器Waters 486可調(diào)吸光度檢測器Waters流分收集器Merck Hitachi D-2000 色譜-積分儀樹脂LiChrospher60 RP-選擇 B Merck No. 11023流速2.22ml/min.(按比例提高至 300X 700mm 2L/min)λ :230nmAUFS :2(檢測器靈敏度 最低水平)A-緩沖液在超純水中12%乙醇(96% )溶解于0. IOM CH3COOH中應(yīng)用溶膠通過加入5酸當量的CH3COOH 2. 5謹ol 0. 15ml 100 % CH3C00H(17M)，將粘菌素基質(zhì)，600mg 0. 5mmol 溶解于 0. IOM CH3COOH 中的 15ml 24% 乙醇 (自96% )中；用2M NaOH調(diào)節(jié)至pH = 7. 5 ；溶液經(jīng)薄膜過濾(0. 45 μ m)1)柱的平衡用A-緩沖液平衡2)施加粘菌素乙酸鹽溶液(40mg/ml)以2. 22ml/min施カロ，隨后施加Iml A-緩沖液通過進料管3)洗脫柱子立即用A-緩沖液洗脫，并且在Iml流分 2. 22ml中收集流出物4)柱的洗滌施加5ml 96%乙醇，隨后施加A-緩沖液直到吸收已減小至零水平^HPLC分析稀釋樣品直到El的面積達到20_30X IO6AU ；高粘菌素標準典型地達到20 X IO6AU ；通過使用粘菌素NovaS (運行30分鐘)來分析樣品實施例2-RP-HPLC純化中試規(guī)模設(shè)備鋼柱50X830mm (0=50 mm)，“Dan-方法，，Waters Delta Prep 4000 Prep. Chrom.系統(tǒng)Waters 4000 系統(tǒng)控制器Waters 486可調(diào)吸光度檢測器Waters流分收集器Merck Hitachi D-2000 色譜-積分儀
樹脂LiChrospher60 RP-選擇 B，Merck No 11023，IKg流速65ml/min.(按比例提高至300 X 700mm 2L/min)λ :230nmAUFS 2 (檢測器靈敏度 最低水平)A-緩沖液在超純水中12%乙醇(96% )溶解于0. IOM CH3COOH中應(yīng)用溶膠通過加入5. 83酸當量的CH3COOH 245mmol 14. 5mll00 % CH3C00H(17M)，將粘菌素基質(zhì)，50g 42mmol (按照原樣(as is))溶解于1000ml 24%乙醇 (96% )中；用2M NaOH調(diào)節(jié)至pH= 7. 5 ；溶液使用硅藻土作為助濾劑經(jīng)薄膜過濾(0. 45 μ m)離子強度4_6mS/cm1)柱的平衡用A-緩沖液平衡2)施加在14分鐘內(nèi)以65ml/min施加粘菌素乙酸鹽溶液(48mg/ml)，隨后在0. 1 分鐘內(nèi)施加 43. 5g A-緩沖液3)洗脫柱子用A-緩沖液洗脫直到吸收已降至漸近線0. OlOV士 10mV，并且在18 種流分 585ml持續(xù)3分鐘收集流出物4)柱的洗滌施加乙醇和50% 1，2丙ニ醇的混合物200mK4分鐘，50ml/ min)，隨后施加A-緩沖液直到吸收已減小至零水平5)HPLC分析稀釋樣品直到E1的面積達到20-30X IO6AU(5X)；高粘菌素標準典型地達到20X IO6AU ；通過使用粘菌素NovaS(運行30分鐘)來分析樣品。實施例3-總純化和最終處理大規(guī)模硫酸粘菌素單組分(多粘菌素E1)是ー種發(fā)酵產(chǎn)品，這意味著它最初的樣子是發(fā)酵液。多粘菌素E1含有各種各樣的雜質(zhì)且從每升含有僅幾克多粘菌素E1和相關(guān)物質(zhì)的發(fā)酵液中被回收和純化。發(fā)酵液的回收物包含粘菌素(多粘菌素E1)的沉淀物和相關(guān)物質(zhì)以及通過離心的初級分離物。二次純化由反相色譜和沉淀構(gòu)成，就多粘菌素E1而言產(chǎn)生更純的產(chǎn)物。硫酸粘菌素單組分產(chǎn)物中存在的相關(guān)物質(zhì)和雜質(zhì)主要是共發(fā)酵物質(zhì)。在粘菌素的發(fā)酵過程中，生成結(jié)構(gòu)上相關(guān)組分的復雜混合物，具有每ー種多芽孢桿菌菌株的比例特征。例子是-脂肪酸鏈的變化，例如生成多粘菌素E1(具有6-甲基辛酸)或多粘菌素E2 (具有7-甲基辛酸)，-分子中氨基酸的取代，例如如果粘菌素中的D-亮氨酸被D-苯基丙氨酸取代，則生成相關(guān)的抗生素多粘菌素B。如果多粘菌素E1中的L-亮氨酸被異亮氨酸取代，則生成多粘菌素E1-異亮氨酸通過制備型HPLC的純化制備以下緩沖液緩沖液I :1. 6-2M乙醇和0. 1-0. 15M乙酸。該緩沖液在使用前通過0. 45 μ m濾膜
過 ife、ο緩沖液II 約6. 8M 1,2-丙ニ醇、約4M乙醇和約0. IM乙酸。該緩沖液在使用前通過0. 45 μ m濾膜過濾。用約40升緩沖液I來平衡體積約48升的HPLC柱(直徑30cm)。流速是0. 8-1. 21/min(同樣的流速被用于所有HPLC步驟)。柱子用約8升緩沖液II，隨后用約50升緩沖液 I再生或直到UV-信號回到基線。稱量1000_1500g的ー批真空干燥的粘菌素基質(zhì)，并將其懸浮于20_30升4M乙醇中。該懸浮液通過加入0.3M乙酸攪拌30分鐘而被溶解。用氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)至約7. 5， 并且該溶液通過0. 45 μ m薄膜過濾器進行過濾。該粘菌素乙酸鹽溶液通過HPLC柱并且結(jié)合于樹脂。HPLC柱用約160升緩沖液I洗脫。按流分收集流出物。依照預先設(shè)定的規(guī)則來收集流分，而丟棄其余流分。對于多粘菌素E1而言，從流分中收集純度至少為92%的部分。 多粘菌素E1的濃縮和多余乙醇的去除通過反滲透而完成。該池被濃縮至約50g/l井隨后用DI-水(約8體積)滲折。通過疏水作用餼譜法(HIC)的純化制備以下緩沖液校準緩沖液約200mM(NH4)2SO4 ；用稀釋的氨水將pH調(diào)節(jié)至約7洗脫緩沖液約200mM (NH4)2SO4 ；用乙酸將pH調(diào)節(jié)至約3. 7用250升校準緩沖液來平衡體積約90升的HIC柱(直徑35cm)，流速約1. 71/min, 隨后是約200升洗脫緩沖液，流速約1. 01/min。通過加入(NH4)2SO4將經(jīng)過反滲透的粘菌素乙酸鹽溶液中的鹽含量調(diào)至約200mM， 并用稀釋的氨水將PH調(diào)節(jié)至約7。該粘菌素乙酸鹽溶液的濃度是15-20g/l。該溶液通過 HIC柱，流速為950-1050ml/min。洗脫用10倍床體積(bed volume)進行。流出物流分的收集通過PLC自動完成。從每個流分中取得樣品并進行分析。依照預先設(shè)定規(guī)則來收集流分，產(chǎn)生就多粘菌素E1而言純度為94-98%的批次。多粘菌素E1的濃縮和硫酸銨的去除通過超濾而完成，以達到10-20g/l的濃度。粘菌素基質(zhì)單組分的沉淀溶液用DI-水稀釋至10g/l并攪拌直至它均勻。用氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)至9. 6-9. 8， 并且當粘菌素基質(zhì)單組分沉淀時繼續(xù)攪拌。沉淀物在壓濾機上經(jīng)過濾被回收。當過濾完成吋，用約800升去離子水清洗濾餅，用空氣置換。從壓濾機中取出粘菌素單組分濾餅并儲存于冰箱中。向硫酸粘菌素單組分的轉(zhuǎn)化將粘菌素基質(zhì)單組分懸浮并溶解于DI-水中，同時攪拌。用稀硫酸將pH調(diào)節(jié)至 5.0。該溶液通過0.45 μ m濾膜過濾。冷凍干燥、研磨和儲存將經(jīng)過濾的溶液注入不銹鋼冷凍干燥托盤中，并利用PIC控制溫度分布在-25°Cヰ+45°C的范圍內(nèi)冷凍干燥約70小吋。從冷凍干燥機中取出干燥的產(chǎn)物并研磨以獲得所需的顆粒分布。分析型HPLC方法Tffe 1 用チ從發(fā)酵至Ilfelf素基質(zhì)的過稈控泡丨的HPLC設(shè)備Waters自動HPLC設(shè)備，由以下組成泵型號6000 A/510注射器=WISP712 A檢測器型號441
預過濾器=GuardPak, Resolve C18(可以省略)柱=ResolveC18,10X8. 5 微米或 Nova-Pak,4 微米柱配件RCM8X10方法等度流動相緩沖液十水硫酸鈉16. Ig (0. 05M)、濃乙酸 0. 56ml (0. 01M)，三乙胺 20ml (0. 15M)， 加水至1000ml。用磷酸將pH調(diào)節(jié)至2. 5。替代緩沖液硫酸納0. 04M、甲磺酸0. 56M、三乙胺0. 087M, pH為3. 0。在使用前，將170g乙腈溶解于緩沖液中制備1000ml。該溶液用氦氣除氣15分鐘。分析程序流速1. 5ml/min，或者 1. Oml/min。溫度環(huán)境溫度注射體積20微升，或者25微升。檢測214nm，0.IAUFS 或 1. 0AUFS。運行時間30分鐘。標準硫酸粘菌素的有效標準品，溶解于水以制備成lmg/ml。標準品粘菌素基質(zhì)，在0. IM鹽酸中1. Omg/ml。分析樣品稀釋至含有0. 5-lmg/ml。稀釋劑3%磷酸，40ml，和乙腈，60ml。如果渾濁則離心。Tffe 2 μ^mm^m vmnmi^mr^a^i hplc設(shè)備Waters自動HPLC設(shè)備，由以下組成泵型號510注射器717附加自動取樣器檢測器490E預濾器GuardPak, Nova-Pak, C18柱Nova_Pak，C18，60 A，4 μ m，150 X 4. 6mm柱室Jones色譜型號7955試劑硫酸鈉，無水，預分析三乙胺，HPLC級甲磺酸，彡99%超純水緩沖液硫酸鈉，無水，28. 4g(0. 10M)，三乙胺14. Oml (0. 05M)，甲磺酸 10. Oml (0. 06M)，用超純水定容至2000ml。A-洗脫液50%緩沖液，35%超純水，15%乙腈。用甲磺酸調(diào)節(jié)至pH 2. 0。B-洗脫液50%緩沖液，20%超純水，30%乙腈。用甲磺酸調(diào)節(jié)至pH 2. 0。樣品制備粘菌素乙酸鹽在0.05M乙酸中l(wèi)_2g/l。攪拌30分鐘并通過0. 45 μ m薄膜過濾益；LiyjL。標準品制備兩種內(nèi)部標準品，ー種具有高活性(2000yg/mg)而另ー種具有低活性 (400 μ g/mg)ο分析程序流速0. 8ml/min。柱溫25°C檢測:214nm時間常數(shù)1.0秒AUFS 1. 000AU自動歸零開Wisp 溫度25 °C注射:20μ 1/ 次(run)。梯度程序
權(quán)利要求
1.通過反相色譜法純化粘菌素的方法，其特征在干， 粘菌素基質(zhì)在乙酸和高乙醇濃度中上柱并且用低乙醇濃度洗脫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述高乙醇濃度為20%-30%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述高乙醇濃度為20%-M%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述高乙醇濃度為對％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述低乙醇濃度為10-15%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述低乙醇濃度為12%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述乙酸濃度為0.1M。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，隨后進ー步是疏水作用色譜法的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述流動相的PH為7-8。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述流動相的pH為7.5。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中， 所述高乙醇濃度為對％，所述低乙醇濃度為12%， 所述乙酸濃度為0. 1M， 所述流動相的PH為7. 5，并且所述固定相為C8-樹脂。
12.通過根據(jù)權(quán)利要求11所述方法生產(chǎn)的產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用反相色譜法純化粘菌素的方法，其中，粘菌素基質(zhì)在乙酸和高乙醇濃度中上柱并且用低乙醇濃度洗脫。
文檔編號C07K7/62GK102596987SQ201080049616
公開日2012年7月18日 申請日期2010年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日
發(fā)明者卡斯滕·奧弗巴萊-彼得森, 托本·科克 申請人:?？怂估麃喼扑幱邢薰?br>