專利名稱：從血漿制備富含IgG的組合物的方法
從血漿制備富含IgG的組合物的方法
背景技術(shù)：
在1952年，源自人血漿的免疫球蛋白產(chǎn)品首次用于治療免疫缺陷。最初，所選方法為肌肉內(nèi)或皮下施用免疫球蛋白同種型G(IgG)。然而，為注射有效治療各種疾病所需要的大量IgG，人們研發(fā)出具有較低濃度IgG(50mg/mL)的靜脈內(nèi)施用產(chǎn)品。靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IVIG)通常含有源自多于一千個(gè)血液供體的血漿的混合免疫球蛋白G(IgG)免疫球蛋白。IVIG通常含有超過(guò)95%的具有完整Fe依賴性作用功能的未修飾IgG和僅痕量的免疫球蛋白A(IgA)或免疫球蛋白M(IgM)，其為無(wú)菌的純化IgG產(chǎn)物且主要用于治療以下三大類醫(yī)學(xué)病狀(1)免疫缺陷，例如X-連鎖丙種球蛋白缺乏血癥、低丙種球蛋白血癥(原發(fā)性免疫缺陷)、和特征為低抗體水平的獲得性免疫低下病狀(繼發(fā)性免疫缺陷)；(2)炎癥性和自身免疫病；和⑶急性感染。具體來(lái)說(shuō)，許多患有原發(fā)性免疫缺陷病癥的患者缺乏抵抗感染所需的抗體。在某·些情形下，所述缺陷通常可通過(guò)通常經(jīng)由靜脈內(nèi)施用輸注純化的IgG(即IVIG療法)來(lái)彌補(bǔ)。若干種原發(fā)性免疫缺陷病癥通常以所述方式來(lái)治療，包括X-連鎖丙種球蛋白缺乏血癥(XLA)、普通可變性免疫缺陷(CVID)、高IgM綜合癥0HM)、重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)和某些 IgG 亞類缺陷(Blaese 和 Winkelstein, J. Patient & Family Handbook for PrimaryImmunodeficiency Diseases. Towson, MD:Immune Deficiency Foundation ;2007)。盡管IVIG治療可極為有效地管控原發(fā)性免疫缺陷病癥，但此療法僅臨時(shí)性替代體內(nèi)未產(chǎn)生的抗體，而不能治愈疾病。因此，依賴IVIG療法的患者需要反復(fù)給藥，通常大約每月一次，至死方休。此需要對(duì)連續(xù)生產(chǎn)IVIG組合物產(chǎn)生巨大需求。然而，與通過(guò)體外表達(dá)重組DNA載體所產(chǎn)生的其它生物制品不同，IVIG是從人血液和獻(xiàn)血漿分級(jí)分離得到。因此，IVIG產(chǎn)品不能通過(guò)簡(jiǎn)單地?cái)U(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模來(lái)增加。而且可商購(gòu)IVIG的數(shù)量受到血液和獻(xiàn)血漿的可資供應(yīng)量的限制。若干個(gè)因素促進(jìn)對(duì)IVIG的需求，包括對(duì)IVIG治療的認(rèn)可、對(duì)IVIG療法可有效作用的其它適應(yīng)癥的確定、和患者診斷和IVIG處方的增加。值得注意的是，自1990年以來(lái)全球?qū)VIG的需求已增長(zhǎng)四倍以上，而且目前仍以每年約7%至10%的速率繼續(xù)增加(Robert P. , Pharmaceutical Policy and Law, 11 (2009) 359-367)。舉例來(lái)說(shuō)，澳大利亞國(guó)家血液管理局報(bào)導(dǎo)，澳大利亞在2008-2009財(cái)年對(duì)IVIG的需求增加10. 6% (National BloodAuthority Australia Annual Report2008-2009)。部分由于全球需求的增加和免疫球蛋白產(chǎn)品可資供應(yīng)量的波動(dòng)，若干個(gè)國(guó)家(包括澳大利亞和英國(guó))已開(kāi)始實(shí)施需求管理程序，從而在產(chǎn)品短缺期間保護(hù)所述產(chǎn)品對(duì)需求最高的患者的供應(yīng)。在2007年已報(bào)導(dǎo)，對(duì)兩千六百五十萬(wàn)升血漿進(jìn)行分級(jí)分離，產(chǎn)生75. 2噸IVIG，平均產(chǎn)率為2. 8克/升(Robert P.，如前所述)。據(jù)同一報(bào)導(dǎo)評(píng)估，預(yù)期全球的IVIG產(chǎn)率到2012年將上升至約3. 43克/升。然而，由于全球?qū)VIG的需求持續(xù)增長(zhǎng)(預(yù)期從現(xiàn)在起至2015年每年增長(zhǎng)約7%至13%)，因此需要進(jìn)一步提高IVIG總體產(chǎn)率來(lái)滿足全球需求。IVIG產(chǎn)品的市場(chǎng)供應(yīng)商采用多種IVIG制備方法?，F(xiàn)行IVIG生產(chǎn)方法的一個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題是在純化過(guò)程期間IgG大量損失，據(jù)估算至少為起始材料中總IgG含量的30%至35%。一個(gè)挑戰(zhàn)在于維持病毒滅活品質(zhì)和清除可導(dǎo)致不良反應(yīng)的雜質(zhì)的同時(shí)提高IgG的產(chǎn)率。在IVIG的當(dāng)前產(chǎn)量下，即便產(chǎn)率的較小增加實(shí)際上也是極有意義的。舉例來(lái)說(shuō)，在2007年的產(chǎn)量下，效率提高2%等于增加56毫克/升，即多產(chǎn)生I. 5噸IVIG。在一系列關(guān)于血清和血漿蛋白質(zhì)的制備和特性的已出版學(xué)術(shù)論文的第四期中，Cohn等(J. Am. Chem. Soc. , 1946, 68(3) :459-475)首次描述醇分級(jí)分離血衆(zhòng)蛋白質(zhì)的方法(方法6),其使得可分離來(lái)自人血楽;的富含IgG的組分。若干年后,Oncley等(J. Am. Chem.Soc.，1949，71 (2) :541-550)基于Cohn的方法進(jìn)行了擴(kuò)展，其公開(kāi)了使得可分離更純凈的IgG制劑的方法(方法9)。盡管所述方法為整個(gè)血漿源血液因子工業(yè)奠定了基礎(chǔ)，但其所提供IgG制劑的純度未高至足以治療若干種免疫相關(guān)性疾病，包括川崎綜合癥(Kawasaki syndrome)、免疫性血小板減少性紫癜和原發(fā)性免疫缺陷。因此，研發(fā)出采用諸如離子交換色譜等各 種技術(shù)的其它方法來(lái)提供具有較高純度和較高濃度的IgG制劑。Hoppe等(Munch MedWochenschr 1967 (34) : 1749-1752)和 Falksveden (瑞典專利號(hào) 348942)和 Falksveden 和Lundblad(Methods of Plasma Protein Fractionation 1980)首先米用離子交換色譜來(lái)實(shí)現(xiàn)此目的。多種現(xiàn)代方法采用與管柱色譜偶聯(lián)的沉淀步驟，例如辛酸鹽沉淀(Lebing等，VoxSang2003 (84) : 193-201)和 Cohn 組分(1+)11+111 乙醇沉淀(Tanaka 等，Braz J Med BiolRes2000 (33) 37-30)。最近，Teschner 等(Vox Sang, 2007(92) :42-55)描述產(chǎn)生 10%IVIG 產(chǎn)物的方法，其中首先從混合血衆(zhòng)除去冷凍沉淀物，然后實(shí)施經(jīng)過(guò)修改的Cohn-Oncley冷乙醇分級(jí)分離，之后對(duì)中間體實(shí)施S/D處理，進(jìn)行離子交換色譜，納米過(guò)濾，并且任選地實(shí)施超濾/滲濾。然而，盡管所述IgG制備方法改進(jìn)了純度、安全性和產(chǎn)率，但在純化過(guò)程期間仍損失大量IgG。舉例來(lái)說(shuō)，Teschner等報(bào)導(dǎo)，其方法使IgG產(chǎn)率提高為65%(TeSChner等，如前所述)。根據(jù)不同血漿產(chǎn)品會(huì)議期間的報(bào)導(dǎo)，大規(guī)模制備IgG的平均產(chǎn)率，如Baxter、CSL Behring>Upfront Technology>Cangene>Prometric BioTherapeutics和Finnish RedCross，在最終容器中在約61%至約65%的范圍內(nèi)。此表示在制備期間存在于混合血漿組分中的IgG損失至少約三分之一。因此，需要制備IVIG產(chǎn)物的更有效的改進(jìn)方法。本發(fā)明通過(guò)提供制備產(chǎn)率比現(xiàn)行可用方法高至少6%至10%的IVIG制備方法以及通過(guò)所述方法獲得的IVIG組合物來(lái)滿足所述和其它需要。發(fā)明概述在一個(gè)方面，本發(fā)明提供從血漿制備富含IgG的組合物(例如IVIG組合物)的方法。有利的是，本文提供的方法顯著改進(jìn)制備IVIG組合物的制備方法的現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)。舉例來(lái)說(shuō)，本文提供的方法使得可提高IgG在最終總體組合物中的產(chǎn)率且不降低靜脈內(nèi)施用所需的純度。在一個(gè)方面，提供從血漿制備富含IgG的組合物的方法，其包括以下步驟(a)在第一沉淀步驟中用介于約6%與約10%之間的醇在介于約7. 0與約7. 5之間的pH值下使減少冷凍沉淀物的血衆(zhòng)(cryo-poor plasma)組分沉淀,從而獲得第一沉淀物和第一上清液，(b)在第二沉淀步驟中用介于約20%與約25%之間的醇在介于約6. 7與約7. 3之間的pH值下使IgG從第一上清液沉淀，從而形成第二沉淀物，(c)使第二沉淀物再懸浮以形成懸浮液，(d)在第三沉淀步驟中用介于約22%與約28%之間的醇在介于約6. 7與約7. 3之間的pH值下使IgG從步驟(c)中形成的懸浮液沉淀，從而形成第三沉淀物，(e)使第三沉淀物再懸浮以形成懸浮液，和(f)從步驟(e)中形成的懸浮液分離可溶性組分，由此形成富含IgG的組合物，其中第一沉淀步驟、第二沉淀步驟或第三沉淀步驟中的至少一個(gè)包括噴霧添加醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一沉淀步驟中通過(guò)噴霧添加醇。在另一實(shí)施方案中，在第二沉淀步驟中通過(guò)噴霧添加醇。在再一實(shí)施方案中，在第三沉淀步驟中通過(guò)噴霧添加醇。在某些實(shí)施方案中，可通過(guò)噴霧添加pH值調(diào)整劑來(lái)調(diào)節(jié)一種或多種溶液的pH值。在相關(guān)實(shí)施方案中，第一沉淀步驟、第二沉淀步驟或第三沉淀步驟中至少一個(gè)的PH值是通過(guò)在添加醇之后或在添加醇之前和之后、在添加醇期間和之后或在添加醇之前、期間和之后添加PH值調(diào)整溶液來(lái)實(shí)現(xiàn)。在另一相關(guān)實(shí)施方案中，可通過(guò)連續(xù)調(diào)節(jié)pH值在整個(gè)沉淀反應(yīng)期間維持沉淀步驟的pH值。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，在添加醇后通過(guò)噴霧添加pH值調(diào)整劑來(lái)調(diào)節(jié)第一沉淀·步驟的PH值。在另一實(shí)施方案中，在添加醇后通過(guò)噴霧添加pH值調(diào)整劑來(lái)調(diào)節(jié)第二沉淀步驟的PH值。在再一實(shí)施方案中，在添加醇后通過(guò)噴霧添加pH值調(diào)整劑來(lái)調(diào)節(jié)第三沉淀步驟的pH值。此外，本文提供的制備方法可進(jìn)一步包括離子交換色譜步驟(即陰離子交換和/或陽(yáng)離子交換色譜)、納米過(guò)濾步驟、超濾/滲濾步驟或任何其它適合純化技術(shù)，從而進(jìn)一步提高IVIG制劑的純度或品質(zhì)。在另一方面，提供從血漿制備富含IgG的組合物的方法，其包括以下步驟將減少冷凍沉淀物的血漿組分的pH值調(diào)節(jié)至7. 0或約7. 0，(b)在介于_7°C或約_7°C與_9°C或約_9°C之間的溫度下將步驟(a)的減少冷凍沉淀物的血漿組分的乙醇濃度調(diào)節(jié)至25%(v/v)或約25%(v/v)，由此形成混合物，(c)從步驟(b)的混合物分離液體和沉淀物，(d)用含有磷酸鹽和乙酸鹽的緩沖液使步驟(c)的沉淀物再懸浮，其中每1000L緩沖液用600mL或約600mL冰乙酸調(diào)節(jié)緩沖液的pH值，由此形成懸浮液，(e)將細(xì)碎的二氧化硅(SiO2)與步驟(d)的懸浮液混合至少約30分鐘，(f)用壓濾機(jī)過(guò)濾懸浮液，由此形成濾液，(g)用至少3倍壓濾機(jī)死體積的含有磷酸鹽和乙酸鹽的緩沖液洗滌壓濾機(jī)，其中每1000L緩沖液用150mL或約150mL冰乙酸調(diào)節(jié)緩沖液的pH值，由此形成洗滌溶液，(h)合并步驟(f)的濾液與步驟(g)的洗滌溶液，由此形成溶液，并用洗滌劑處理所述溶液，(i)將步驟(h)的溶液的pH值調(diào)節(jié)至7. 0或約7. 0并添加乙醇至25%或約25%的終濃度，由此形成沉淀物，(j)從步驟(i)的混合物分離液體和沉淀物，(k)將所述沉淀物溶解于包含溶劑或洗滌劑的水溶液中并將所述溶液維持至少60分鐘，(I)在步驟(k)后使所述溶液流過(guò)陽(yáng)離子交換色譜管柱并將吸附在管柱上的蛋白質(zhì)洗脫于洗出液中，(m)使步驟(I)的洗出液流過(guò)陰離子交換色譜管柱以產(chǎn)生流出液，(n)使步驟(m)的流出液流過(guò)納米過(guò)濾器以產(chǎn)生納米濾液，(O)使步驟(n)的納米濾液流過(guò)超濾膜以產(chǎn)生超濾液；和(P)相對(duì)于滲濾緩沖液來(lái)滲濾步驟(O)的超濾液以產(chǎn)生蛋白質(zhì)濃度介于約8%(w/v)與約12%(w/v)之間的滲濾液，由此獲得具有濃縮IgG的組合物。在另一方面，本發(fā)明提供通過(guò)本文所述的方法制備的水性IgG組合物。一般來(lái)說(shuō)，IgG組合物具有高純度(例如至少95%、98%、99%或更高IgG含量)，所含蛋白質(zhì)濃度介于約20g/L與約200g/L之間，且含有極低水平的常見(jiàn)IVIG污染物，例如IgG、IgM、纖維蛋白原、轉(zhuǎn)鐵蛋白、ACA、酰胺分解活性、PKA等。在另一方面，提供適用于IVIG療法中的藥用IgG組合物和制劑。所述藥用制劑具有高純度(例如至少98%、99%或更高IgG含量)，所含蛋白質(zhì)濃度介于約20g/L與約200g/L之間，且含有極低水平的常見(jiàn)IVIG污染物，例如IgG、IgM、纖維蛋白原、轉(zhuǎn)鐵蛋白、ACA、酰胺分解活性、PKA等。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)藥物組合物進(jìn)行適當(dāng)配制以供靜脈內(nèi)施用(即用于IVIG療法)、皮下施用或肌肉內(nèi)施用。在另一方面，本發(fā)明提供治療有需要的人的免疫缺陷、自身免疫病或急性感染的方法，所述方法包括施用本文所述的藥物組合物?？赏ㄟ^(guò)本文提供的方法治療或管控的疾病和病狀的非限制性實(shí)例包括同種異體骨髓移植、慢性淋巴細(xì)胞白血病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、兒科HIV、原發(fā)性免疫缺陷、川崎病(Kawasaki disease)、慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(CIDP)、具有高抗體接受體或具有ABO不相容性供體的腎移植、慢性疲 勞綜合癥、難辨梭菌結(jié)腸炎(clostridium difficile colitis)、皮肌炎和多肌炎、格雷夫氏眼病(Graves’ophthalmopathy)、吉蘭-巴雷綜合癥(Guillain_Barr6syndrome)、肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、包涵體肌炎、蘭伯特-伊頓綜合癥(Lambert-Eaton syndrome)、紅斑狼瘡、多灶性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病、多發(fā)性硬化癥(MS)、重癥肌無(wú)力、新生兒同種免疫性血小板減少癥、B19型細(xì)小病毒(Parvovirus B19)感染、天皰瘡、輸血后紫癜、腎移植排斥、自然流產(chǎn)/早產(chǎn)、僵硬人綜合癥、眼陣攣-肌陣攣綜合癥、成年危重病人的嚴(yán)重?cái)⊙Y和敗血癥性休克、中毒性表皮壞死溶解癥、慢性淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、X-連鎖丙種球蛋白缺乏血癥、低丙球蛋白血癥、原發(fā)性免疫缺陷、RRMS、阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)和帕金森氏病(Parkinson's disease)。附圖簡(jiǎn)述圖I :通過(guò)ELISA法(▲)和比濁法( )測(cè)定的IgG濃度和存在于組分II+III濾液洗滌液中的總蛋白質(zhì)濃度(■)，其是作為用于在過(guò)濾后洗滌過(guò)濾裝置的緩沖液的死體積數(shù)的函數(shù)。圖2 :在存在和不存在氣相二氧化硅(Aerosil) ( 二氧化硅)處理的情形下，在PH3. 8至5. 0下通過(guò)添加乙酸實(shí)施提取和澄清后，沉淀物G溶解組分中的平均PKA活性。圖3 :在存在和不存在氣相二氧化硅(二氧化硅)處理的情形下，在pH3. 8至5. 0下通過(guò)添加乙酸實(shí)施提取和澄清后，沉淀物G溶解組分中的平均纖維蛋白原含量。圖4 :在存在和不存在氣相二氧化硅(二氧化硅)處理的情形下，在pH3. 8至5. 0下通過(guò)添加乙酸實(shí)施提取和澄清后，沉淀物G溶解組分中的平均酰胺分解活性。圖5 :在4°C下孵育兩周后( )或在室溫下另外孵育一周后(■)，在PH3.8至
7.8下提取并澄清的沉淀物G溶解組分中的酰胺分解活性。圖6 :在pH3. 8至7. 8下提取并澄清的沉淀物G溶解組分中的PKA活性。圖7 :經(jīng)過(guò)和未經(jīng)煙霧二氧化硅處理的經(jīng)過(guò)修改的組分II+III濾液的純度差異。僅通過(guò)助濾劑澄清(A)和在煙霧二氧化硅處理后澄清(B)的經(jīng)過(guò)修改的組分II+III濾液的乙酸纖維素電泳色譜圖。圖8 :在大規(guī)模IgG制備中添加沉淀醇后組分II+III上清液的pH值從6. 9的偏離。圖9 :在經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀物提取緩沖液中冰乙酸的量與pH值的關(guān)系圖。

圖10 :在經(jīng)過(guò)修改的組分II+III懸浮液過(guò)濾器后洗滌緩沖液中冰乙酸的量與pH值的關(guān)系圖。定義本文所用的“抗體”是指實(shí)質(zhì)上由一種或多種免疫球蛋白基因或其片段編碼的多肽，其可特異性結(jié)合和識(shí)別分析物(抗原)。所識(shí)別的免疫球蛋白基因包括K、X、a、Y、
S、e和y恒定區(qū)基因以及無(wú)數(shù)免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈歸類為K或X。重鏈歸類為H a、S或e，其繼而分別定義免疫球蛋白類別IgG、IgM、IgA、IgD和IgE0示例性免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元由兩對(duì)多肽鏈構(gòu)成，每一對(duì)具有一個(gè)“輕”鏈·(約25kDa)和一個(gè)“重”鏈(約50-70kDa)。每一鏈的N端界定主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的具有約100至110個(gè)或更多氨基酸的可變區(qū)。術(shù)語(yǔ)可變輕鏈(')和可變重鏈(Vh)分別指所述輕鏈和重鏈。本文所用的術(shù)語(yǔ)“超濾(UF) ”涵蓋多種膜過(guò)濾方法，其中流體靜力壓將液體壓在半透膜上。保留高分子量混懸固體和溶質(zhì)，而水和低分子量溶質(zhì)透過(guò)所述膜。此分離方法經(jīng)常用于純化和濃縮大分子(IO3-IO6Da)溶液，尤其蛋白質(zhì)溶液。根據(jù)所保留分子的大小可使用多種超濾膜。超濾的特征通常在于膜孔徑介于IkDa與IOOOkDa之間且操作壓力介于
0.01巴與10巴之間，并且尤其可用于分離如蛋白質(zhì)等膠體與如糖和鹽等小分子。本文所用的術(shù)語(yǔ)“滲濾”是用與超濾相同的膜來(lái)實(shí)施并且是切向流動(dòng)過(guò)濾。在滲濾期間，將緩沖液引入循環(huán)槽中并同時(shí)從單元操作中除去濾液。在產(chǎn)物存在于滯留物(例如IgG)中的方法中，滲濾將各組分從產(chǎn)物池洗出至濾液中，由此交換緩沖液并降低不期望物質(zhì)的濃度。本文所用的術(shù)語(yǔ)“約”表示從指定值加或減10%的大致范圍。例如，表述“約20%”涵蓋18-22%的范圍。本文所用的術(shù)語(yǔ)“混合”描述通過(guò)任何形式的攪拌使兩種或更多種不同的化合物或物質(zhì)均勻分布于溶液或懸浮液中的活動(dòng)。本申請(qǐng)中所用的術(shù)語(yǔ)“混合”的結(jié)果并不要求所有成份皆完全均勻地分布于溶液或懸浮液中。本文所用的術(shù)語(yǔ)“溶劑”涵蓋能夠溶解或分散一種或多種其它物質(zhì)的任何液體物質(zhì)。溶劑可具有無(wú)機(jī)性質(zhì)，例如水；或其可為有機(jī)液體，例如乙醇、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、己烷、石油醚等。術(shù)語(yǔ)“溶劑洗滌劑處理”中所用的溶劑表示有機(jī)溶劑(例如磷酸三正丁酯)，其是用于使溶液中的脂質(zhì)包膜病毒滅活的溶劑洗滌劑混合物的一部分。本文所用的術(shù)語(yǔ)“洗滌劑”在本申請(qǐng)中可與術(shù)語(yǔ)“表面活性劑”或“表面活性試劑”互換使用。表面活性劑通常為兩親性有機(jī)化合物，即含有疏水基團(tuán)(“尾”)和親水基團(tuán)(“頭”)兩者，此使得表面活性劑可溶解于有機(jī)溶劑和水兩者中。表面活性劑可根據(jù)其頭部中所存在的形式上帶電的基團(tuán)來(lái)分類。非離子型表面活性劑在其頭部不具有帶電基團(tuán)，而離子型表面活性劑在其頭部攜帶凈電荷。兩性離子型表面活性劑所含的頭部具有兩種相反帶電基團(tuán)。常見(jiàn)表面活性劑的某些實(shí)例包括陰離子型(基于硫酸根、磺酸根或碳酸根陰離子)全氟辛酸鹽(PF0A或PF0)、全氟辛烷磺酸鹽(PFOS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、十二燒基硫酸按和其它燒基硫酸鹽、聚氧乙稀燒基硫酸納(也稱作十_■燒基釀硫酸納或SLES)、烷基苯磺酸鹽；陽(yáng)離子型(基于季銨陽(yáng)離子)溴化鯨蠟基三甲銨(CTAB)(也稱作溴化十六燒基三甲銨)和其它燒基三甲銨鹽、西卩比氯銨(cetylpyridinium chloride) (CPC)、聚乙氧基化牛脂胺(POEA)、苯扎氯銨(benzalkonium chloride) (BAC)、節(jié)索氯銨(benzethoniumchloride) (BZT);長(zhǎng)鏈脂肪酸和其鹽包括辛酸鹽、辛酸、庚酸鹽、己酸、庚酸、壬酸、癸酸等；兩性離子型(兼性)十二烷基甜菜堿；椰油酰胺丙基甜菜堿；椰油兩性甘氨酸鹽；非離子型烷基聚(環(huán)氧乙烷)、烷基酚聚(環(huán)氧乙烷)、聚(環(huán)氧乙烷)與聚(環(huán)氧丙烷)的共聚物(商業(yè)上稱作帕洛沙姆(Poloxamer)或帕洛沙胺(Poloxamine))、燒基多聚葡萄糖苷(包括辛基葡萄糖苷)、癸基麥芽糖苷、脂肪醇(例如鯨蠟醇和油醇)、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA、聚山梨醇酯(Tween20、Tween80等)、曲拉通(Triton)洗漆劑和氧化十二燒基二甲胺。本文所用的術(shù)語(yǔ)“靜脈內(nèi)IgG”或“IVIG”治療一般是指以靜脈內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)方式向患者施用IgG免疫球蛋白組合物以治療諸如免疫缺陷、炎癥性疾病和自身免疫病等多種病狀的治療方法。IgG免疫球蛋白通常是從血漿混合和制備的。可使用全抗體或片段。 IgG免疫球蛋白可以較高濃度(例如大于10%)配制以供皮下施用，或可配制成用于肌肉內(nèi)施用。此對(duì)于特異性IgG制劑來(lái)說(shuō)特別常見(jiàn)，所述制劑是以高于特定抗原(例如Rho D因子、百日咳毒素、破傷風(fēng)毒素、肉毒毒素、狂犬病等)的平均效價(jià)的濃度制備的。為便于論述，所述皮下或肌肉內(nèi)配制的IgG組合物也涵蓋于本申請(qǐng)的術(shù)語(yǔ)“IVIG”中。“治療有效量或劑量”或“足夠/有效量或劑量”意思是可產(chǎn)生施用后欲獲得的作用的劑量。確切劑量可取決于治療目的，且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用已知技術(shù)來(lái)確定(例如，參見(jiàn) Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (第 1-3 卷，1992) ；Lloyd, TheArt, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999) ；Pickar, DosageCalculations(1999);和 Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第 20 版，2003，Gennaro 編著，Lippincott, Williams & Wilkins)。本申請(qǐng)所用的術(shù)語(yǔ)“噴霧”是指例如在醇沉淀步驟期間(例如經(jīng)過(guò)修改的Cohn分級(jí)分離I或II+III沉淀步驟)以液體物質(zhì)的細(xì)液滴或細(xì)霧方式向系統(tǒng)中遞送液體物質(zhì)的方式。噴霧可通過(guò)任何加壓裝置來(lái)實(shí)施，例如容器(例如噴霧瓶)，其具有噴頭或噴嘴并且是以手動(dòng)或自動(dòng)方式操作以從液體產(chǎn)生細(xì)霧。通常，在實(shí)施噴霧的同時(shí)連續(xù)攪拌或以其它方式混合接受液體物質(zhì)的系統(tǒng)以確保所述液體在系統(tǒng)內(nèi)快速均勻分布。發(fā)明詳述I.綜述作為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的常規(guī)實(shí)踐，使用濃免疫球蛋白(尤其IgG)的滅菌制劑來(lái)治療屬于以下三大類的醫(yī)學(xué)病狀免疫缺陷、炎癥性和自身免疫病、和急性感染。一種常用IgG產(chǎn)物(靜脈內(nèi)免疫球蛋白或IVIG)以例如10%或約10%IgG的濃度配制成用于靜脈內(nèi)施用。也可以例如20%或約20%IgG的濃度配制濃免疫球蛋白用于皮下或肌肉內(nèi)施用。為便于論述，所述皮下或肌肉內(nèi)配制的IgG組合物也涵蓋于本申請(qǐng)的術(shù)語(yǔ)“IVIG”中。在某些方面，本發(fā)明提供制備IVIG的方法，其可提高產(chǎn)物的最終產(chǎn)率并且仍提供具有相同或較高品質(zhì)且在某些情形下具有較高濃度的IVIG組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供經(jīng)過(guò)修改的Cohn分級(jí)分離方法，其可在一個(gè)或多個(gè)沉淀步驟中降低IgG損失。
在另一方面，本發(fā)明提供根據(jù)本文提供的改進(jìn)制備方法制備的IgG組合物。有利的是，因本文提供的方法使產(chǎn)率提高，所以所述組合物的制備成本低于當(dāng)前可得的可商購(gòu)產(chǎn)品。此外，所述組合物與使用可商購(gòu)方法制備的組合物同樣純凈(如果并非更純凈)。重要的是，所述組合物適用于免疫缺陷、炎癥性和自身免疫病、和急性感染的IVIG療法。在一個(gè)實(shí)施方案中，IgG組合物含有10%或約10%IgG以供靜脈內(nèi)施用。在另一實(shí)施方案中，IgG組合物含有20%或約20%以供皮下或肌肉內(nèi)施用。在另一方面，本發(fā)明提供根據(jù)本文提供的改進(jìn)制備方法制備的IgG組合物的藥物組合物和制劑。在某些實(shí)施方案中，所述組合物和制劑提供與市場(chǎng)上其它現(xiàn)有IVIG組合物相比得到改進(jìn)的特性。舉例來(lái)說(shuō)，在某些實(shí)施方案中，本文提供的組合物和制劑可在延長(zhǎng)時(shí)I司內(nèi)保持穩(wěn)定。在另一方面，本發(fā)明提供治療免疫缺陷、炎癥性和自身免疫病、和急性感染的方法，其包括施用使用本文提供的改進(jìn)方法制備的IgG組合物。II. IVIG的制備方法
·
一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的免疫球蛋白制劑可從任何適合起始材料制備，例如回收血漿或原料血漿。在一典型實(shí)施例中，從健康供體收集血液或血漿。通常，從物種與接受將施用所述免疫球蛋白制劑的個(gè)體相同的動(dòng)物收集血液(通常稱作“同源”免疫球蛋白)。通過(guò)適合程序從血液分離免疫球蛋白，例如沉淀法(醇分級(jí)分離或聚乙二醇分級(jí)分離)、色譜法(離子交換色譜、親和色譜、免疫親和色譜等)、超速離心法和電泳制備法等。(例如，參見(jiàn)Cohn 等，J. Am. Chem. Soc. 68:459-75 (1946) ；OneIey 等，J. Am. Chem. Soc. 71:541-50 (1949)；Barundern 等，Vox Sang. 7:157-74 (1962) ;Koblet 等，Vox Sang. 13:93-102 (1967);美國(guó)專利號(hào)5，122，373和5，177，194 ;上述文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容是全文以引用方式并入本文以用于所有目的)。在多種情形下，免疫球蛋白是從通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的醇分級(jí)分離和/或離子交換色譜和親和色譜方法產(chǎn)生的含Y球蛋白產(chǎn)物制備的。舉例來(lái)說(shuō)，通常使用經(jīng)過(guò)純化的Cohn組分II作為分離免疫球蛋白的起始點(diǎn)。起始Cohn組分II糊狀物通常含有約95%IgG且包括四種IgG亞型。不同亞型存在于組分II中的比率與其存在于用于獲得其的混合人血漿中的比率大致相同。在配制為可施用產(chǎn)物之前對(duì)組分II實(shí)施進(jìn)一步純化。舉例來(lái)說(shuō)，可使組分II糊狀物溶解于純化冷醇水溶液中且通過(guò)沉淀和過(guò)濾來(lái)除去雜質(zhì)。在最終過(guò)濾后，可對(duì)免疫球蛋白懸浮液實(shí)施透析或滲濾(例如使用標(biāo)稱分子量極限小于或等于100, 000道爾頓的超濾膜)以除去醇。可對(duì)溶液實(shí)施濃縮或稀釋以獲得期望蛋白質(zhì)濃度，并且可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步純化。此外，可使用附加制備步驟來(lái)富集特定同種型或亞型的免疫球蛋白。舉例來(lái)說(shuō)，可使用蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G或蛋白質(zhì)H瓊脂糖色譜來(lái)富集IgG免疫球蛋白或特定IgG亞型免疫球蛋白的混合物。大體參見(jiàn) Harlow 和 Lane, Using Antibodies, Cold Spring HarborLaboratory Press (1999) ；Harlow 和 Lane, Antibodies, A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor LaboratoryPress (1988);和美國(guó)專利號(hào)5，180，810,上述文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容是全文以引用方式并入本文以用于所有目的。與上述方法不同，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供利用減少冷凍沉淀物的起始材料制備濃縮IgG組合物的方法。一般來(lái)說(shuō)，本文提供的方法利用經(jīng)過(guò)修改的Cohn-Oncley醇分級(jí)分離步驟和離子交換色譜來(lái)提供較高IgG產(chǎn)率，同時(shí)維持與現(xiàn)有可商購(gòu)IVIG制劑相同(如果未改進(jìn))的品質(zhì)。舉例來(lái)說(shuō)，在某些實(shí)施方案中，提供產(chǎn)生含有原料血漿起始材料中存在的IgG含量的近75%的最終總體IgG組合物的方法。所述方法代表總體IgG產(chǎn)率比現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)的純化方法提高至少10%至12%。舉例來(lái)說(shuō)，估計(jì)GA\,1 \,1/\GARir LIQUID制備方法提供的最終產(chǎn)率介于起始材料中存在的IgG含量的約60%與65%之間。因此，本文提供的方法相對(duì)于現(xiàn)有IgG純化技術(shù)提供顯著改進(jìn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供含有原料血漿起始材料中存在的IgG含量的至少70%的純化IgG組合物。在另一實(shí)施方案中，提供含有原料血漿起始材料中存在的IgG含量的至少75%的純化IgG組合物。在其它實(shí)施方案中，本文提供的純化IgG組合物含有原料血漿起始材料中存在的IgG含量的至少約65%，或原料血漿起始材料中存在的IgG含量的至少 66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75% 或更多。A.經(jīng)過(guò)修改的醇沉淀/離子交換色譜分級(jí)分離方法在一個(gè)方面，本發(fā)明提供制備適用于IVIG療法的IgG組合物的改進(jìn)方法。一般來(lái)說(shuō)，相比于產(chǎn)生可商購(gòu)IVIG產(chǎn)品所用的現(xiàn)行方法，所述方法提供的IgG制劑具有較高產(chǎn)率和相當(dāng)?shù)?如果并非較高)純度。在一個(gè)特定方面，本發(fā)明提供從血漿制備具有濃縮IgG的組合物(例如10%IVIG)的方法，所述方法包括實(shí)施至少一個(gè)醇沉淀步驟和至少一個(gè)離子交換色譜步驟。具體來(lái)說(shuō)，改進(jìn)上游方法中的若干個(gè)步驟與先前方法不同，例如，在較低溫度下使用25%乙醇，通過(guò)噴霧添加乙醇，通過(guò)噴霧調(diào)節(jié)pH值，和使用細(xì)碎的二氧化硅顆粒。在某一實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟(a)在第一沉淀步驟中用介于約6%與約10%之間的醇在介于約6. 7與約7. 3之間的pH值下使減少冷凍沉淀物的質(zhì)粒組分(plasmid fraction)沉淀,從而獲得富含IgG的上清液，(b)在較低溫度下和介于約6. 7與約7. 3之間的pH值下用介于約20%與約30%之間的醇使IgG從上清液沉淀，從而形成第一沉淀物，(c)使步驟(b)中形成的第一沉淀物再懸浮以形成懸浮液，(d)用洗滌劑處理步驟
(c)中形成的懸浮液，(e)用介于約20%與約30%之間的醇在介于約6. 7與約7. 3之間的pH值下使IgG從懸浮液沉淀，從而形成第二沉淀物，(f)使步驟(e)中形成的第二沉淀物再懸 浮以形成懸浮液，(g)用溶劑和/或洗滌劑處理步驟(f)中形成的懸浮液，和(h)實(shí)施至少一次離子交換色譜分級(jí)分離，由此制備含有濃縮IgG的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括在步驟(d)之前用細(xì)碎的二氧化硅(SiO2)處理步驟(c)中形成的懸浮液和過(guò)濾所述溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供從血漿制備濃縮IgG組合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)將減少冷凍沉淀物的血漿組分的pH值調(diào)節(jié)至約7. 0，(b)在介于約_5°C與約_9°C之間的溫度下將步驟(a)的減少冷凍沉淀物的血漿組分的乙醇濃度調(diào)節(jié)至25%(v/v)或約25%(v/v),由此形成混合物,其中乙醇濃度可通過(guò)噴霧來(lái)調(diào)節(jié)，(C)從步驟(b)的混合物分離液體和沉淀物，(d)用含有磷酸鹽和乙酸鹽的緩沖液使步驟(c)的沉淀物再懸浮，其中每1000L緩沖液用約400mL與約700mL之間的冰乙酸調(diào)節(jié)緩沖液的pH值，由此形成懸浮液，
(e)將細(xì)碎的二氧化硅(SiO2)與步驟(d)的懸浮液混合至少約30分鐘，(f)用壓濾機(jī)過(guò)濾所述懸浮液，由此形成濾液，(g)用至少3倍壓濾機(jī)死體積的含有磷酸鹽和乙酸鹽的緩沖液洗滌壓濾機(jī)，其中每1000L緩沖液用約150mL冰乙酸調(diào)節(jié)緩沖液的pH值，由此形成洗滌溶液，(h)合并步驟(f)的濾液與步驟(g)的洗滌溶液，由此形成溶液，并且用洗滌劑處理所述溶液，(i)將步驟(h)的溶液的pH值調(diào)節(jié)至約7. O且添加乙醇至25%或約25%的終濃度，由此形成沉淀物，其中乙醇濃度和/或pH值可通過(guò)噴霧來(lái)調(diào)節(jié)，(j)從步驟(i)的混合物分離液體和沉淀物，(k)使沉淀物溶解于包含溶劑或洗滌劑的水溶液中且將所述溶液維持至少60分鐘，(I)在步驟(k)后使所述溶液流過(guò)陽(yáng)離子交換色譜管柱并將吸附在管柱上的蛋白質(zhì)洗脫于洗出液中，(m)使步驟(I)的洗出液流過(guò)陰離子交換色譜管柱以產(chǎn)生流出液(即流過(guò)液(flow-through)), (n)使步驟(m)的流出液流過(guò)納米過(guò)濾器以產(chǎn)生納米濾液，(O)使步驟(n)的納米濾液流過(guò)超濾膜以產(chǎn)生超濾液，和(P)相對(duì)于滲濾緩沖液滲濾步驟(0)的超濾液以產(chǎn)生蛋白質(zhì)濃度介于約8%(w/v)與約22%(w/v)之間的滲濾液，由此獲得具有濃縮IgG的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(b)的溫度為_(kāi)7°C或約_7°C。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，步驟(d)中的混懸緩沖液用約600mL冰乙酸調(diào)節(jié)。在某些實(shí)施方案中，滲濾液的蛋白質(zhì)濃度可介于約8%與約12%之間，例如約8%或約9%、10%、11%或12%。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，滲濾液的蛋白質(zhì)濃度為10%或約10%。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，滲濾液的蛋白質(zhì)濃度為11%或約11%。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，滲濾液 的蛋白質(zhì)濃度為12%或約12%。在其它實(shí)施方案中，滲濾液的蛋白質(zhì)濃度介于約13%與約17%之間，例如約13%或約14%、15%、16%或17%。在其它實(shí)施方案中，滲濾液的蛋白質(zhì)濃度介于約18%與約22%之間，例如約18%或約19%、20%、21%或22%。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，滲濾液的蛋白質(zhì)濃度為20%或約20%。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，滲濾液的蛋白質(zhì)濃度為21%或約21%。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，滲濾液的蛋白質(zhì)濃度為22%或約22%。在本發(fā)明某些實(shí)施方案中，本文提供的方法可包括對(duì)上述分級(jí)分離方法步驟中的兩者或更多步驟的改進(jìn)。舉例來(lái)說(shuō)，各實(shí)施方案可包括以下步驟中的改進(jìn)第一沉淀步驟、經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀步驟、經(jīng)過(guò)修改的組分II+III溶解步驟、和/或經(jīng)過(guò)修改的組分II+III懸浮液過(guò)濾步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一沉淀步驟中進(jìn)行的改進(jìn)是通過(guò)噴霧添加醇。在另一實(shí)施方案中，在第一沉淀步驟中進(jìn)行的改進(jìn)是通過(guò)噴霧添加PH值調(diào)整劑。在另一實(shí)施方案中，在第一沉淀步驟中進(jìn)行的改進(jìn)是在添加醇后調(diào)節(jié)溶液的PH值。在一相關(guān)實(shí)施方案中，在第一沉淀步驟中進(jìn)行的改進(jìn)是在添加醇期間維持PH值。在另一相關(guān)實(shí)施方案中，在第一沉淀步驟中進(jìn)行的改進(jìn)是在沉淀孵育時(shí)間期間通過(guò)連續(xù)調(diào)節(jié)溶液的PH值來(lái)維持pH值。在某些實(shí)施方案中，可通過(guò)實(shí)施一項(xiàng)以上所述改進(jìn)步驟，來(lái)改進(jìn)第一沉淀步驟。可在此步驟中實(shí)現(xiàn)的其它改進(jìn)將通過(guò)參見(jiàn)下文提供的論述第一沉淀步驟的部分-經(jīng)過(guò)修改的分級(jí)分離I顯而易見(jiàn)。通過(guò)實(shí)施上述改進(jìn)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)，第一沉淀步驟的沉淀物組分中的IgG損失量將減少和/或沉淀步驟期間不可逆變性的IgG比例將降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，在經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀步驟中進(jìn)行的改進(jìn)是通過(guò)噴霧添加醇。在另一實(shí)施方案中，在經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀步驟中進(jìn)行的改進(jìn)是通過(guò)噴霧添加PH值調(diào)整劑。在另一實(shí)施方案中，在經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀步驟中進(jìn)行的改進(jìn)是在添加醇后調(diào)節(jié)溶液的PH值。在一相關(guān)實(shí)施方案中，在經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀步驟中進(jìn)行的改進(jìn)是在添加醇期間維持PH值。在另一相關(guān)實(shí)施方案中，在經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀步驟中進(jìn)行的改進(jìn)是在沉淀孵育時(shí)間期間通過(guò)連續(xù)調(diào)節(jié)溶液的PH值來(lái)維持pH值。在另一方面，通過(guò)將醇濃度提高至25%或約25%，改進(jìn)經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀步驟。在再一實(shí)施方案中，通過(guò)將孵育溫度降低至介于約_7°C與-9°C之間，改進(jìn)經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀步驟。在某些實(shí)施方案中，經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀步驟可通過(guò)實(shí)施一項(xiàng)以上所述改進(jìn)來(lái)進(jìn)行改進(jìn)?？稍诖瞬襟E中實(shí)現(xiàn)的其它改進(jìn)將通過(guò)參見(jiàn)下文提供的論述第二沉淀步驟的部分-經(jīng)過(guò)修改的分級(jí)分離II+III顯而易見(jiàn)。通過(guò)實(shí)施上述改進(jìn)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)，經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀步驟的上清液組分中的IgG損失量將減少和/或沉淀步驟期間不可逆變性的IgG比例將降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，在經(jīng)過(guò)修改的組分II+III溶解步驟中進(jìn)行的改進(jìn)是通過(guò)將溶解緩沖液的冰乙酸含量提高至約0. 06%來(lái)實(shí)現(xiàn)。在另一實(shí)施方案中，在經(jīng)過(guò)修改的組分II+III溶解步驟中進(jìn)行的改進(jìn)是通過(guò)在溶解孵育時(shí)間期間通過(guò)連續(xù)調(diào)節(jié)溶液的PH值維持溶液的PH值來(lái)實(shí)現(xiàn)。在另一實(shí)施方案中，在經(jīng)過(guò)修改的組分II+III溶解步驟中進(jìn)行的改進(jìn)是通過(guò)在過(guò)濾之前混合細(xì)碎的二氧化硅(SiO2)與組分II+III懸浮液來(lái)實(shí)現(xiàn)。在某些實(shí)施方案中，經(jīng)過(guò)修改的組分II+III溶解步驟可通過(guò)實(shí)施一項(xiàng)以上所述改進(jìn)來(lái)進(jìn)行改進(jìn)?？稍诖瞬襟E中實(shí)現(xiàn)的其它改進(jìn)將通過(guò)參見(jiàn)下文提供的論述經(jīng)過(guò)修改的組分II+III溶解步驟 的部分-經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀物的提取顯而易見(jiàn)。通過(guò)實(shí)施上述改進(jìn)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)，組分II+III懸浮液中回收的IgG的量將提高和/或組分II+III懸浮液中雜質(zhì)的量將降低。在經(jīng)過(guò)修改的組分II+III懸浮液過(guò)濾步驟中進(jìn)行的一示例性改進(jìn)是通過(guò)用至少約3. 6死體積的每1000L含有150mL或約150mL冰乙酸的溶解緩沖液后洗滌濾器來(lái)實(shí)現(xiàn)?？稍诖瞬襟E中實(shí)現(xiàn)的其它改進(jìn)將通過(guò)參見(jiàn)下文提供的論述經(jīng)過(guò)修改的組分II+III懸浮液過(guò)濾步驟的部分-經(jīng)過(guò)修改的組分II+III懸浮液的預(yù)處理和過(guò)濾顯而易見(jiàn)。通過(guò)實(shí)施上述改進(jìn)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)，在經(jīng)過(guò)修改的組分II+III懸浮液過(guò)濾步驟期間損失的IgG量將減少。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法可包括第一沉淀步驟和經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀步驟中的改進(jìn)。在另一實(shí)施方案中，所述方法可包括第一沉淀步驟和經(jīng)過(guò)修改的組分II+III溶解步驟中的改進(jìn)。在另一實(shí)施方案中，所述方法可包括第一沉淀步驟和經(jīng)過(guò)修改的組分II+III懸浮液過(guò)濾步驟中的改進(jìn)。在另一實(shí)施方案中，所述方法可包括經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀步驟和經(jīng)過(guò)修改的組分II+III溶解步驟中的改進(jìn)。在另一實(shí)施方案中，所述方法可包括經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀步驟和經(jīng)過(guò)修改的組分II+III懸浮液過(guò)濾步驟中的改進(jìn)。在另一實(shí)施方案中，所述方法可包括經(jīng)過(guò)修改的組分II+III溶解步驟和經(jīng)過(guò)修改的組分II+III懸浮液過(guò)濾步驟中的改進(jìn)。在另一實(shí)施方案中，所述方法可包括第一沉淀步驟、經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀步驟和經(jīng)過(guò)修改的組分II+III溶解步驟中的改進(jìn)。在另一實(shí)施方案中，所述方法可包括第一沉淀步驟、經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀步驟和經(jīng)過(guò)修改的組分II+III懸浮液過(guò)濾步驟中的改進(jìn)。在另一實(shí)施方案中，所述方法可包括第一沉淀步驟、經(jīng)過(guò)修改的組分II+III溶解步驟和經(jīng)過(guò)修改的組分II+III懸浮液過(guò)濾步驟中的改進(jìn)。在另一實(shí)施方案中，所述方法可包括經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀步驟、經(jīng)過(guò)修改的組分II+III溶解步驟和經(jīng)過(guò)修改的組分II+III懸浮液過(guò)濾步驟中的改進(jìn)。在另一實(shí)施方案中，所述方法可包括第一沉淀步驟、經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀步驟、經(jīng)過(guò)修改的組分II+III溶解步驟和經(jīng)過(guò)修改的組分II+III懸浮液過(guò)濾步驟全部中的改進(jìn)。在某些實(shí)施方案中，本文提供的IgG純化方法中的一個(gè)方法改進(jìn)包括噴霧添加一種或多種原本通過(guò)流動(dòng)添加引入血漿組分中的溶液。舉例來(lái)說(shuō)，在某些實(shí)施方案中，方法改進(jìn)包括通過(guò)噴霧將醇(例如乙醇)添加至血漿組分中以實(shí)現(xiàn)使一種或多種蛋白質(zhì)物質(zhì)沉淀的目的。在其它實(shí)施方案中，可通過(guò)噴霧添加至血漿組分中的溶液包括但不限于PH值調(diào)整溶液、溶劑溶液、洗滌劑溶液、稀釋緩沖液、電導(dǎo)率調(diào)整溶液等。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)噴霧向血漿組分中添加醇來(lái)實(shí)施一個(gè)或多個(gè)醇沉淀步驟。在一第二優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)噴霧向血漿組分中添加PH值調(diào)整溶液來(lái)實(shí)施一個(gè)或多個(gè)pH值調(diào)整步驟。
·
在某些實(shí)施方案中，可與任何其它方法改進(jìn)組合的另一方法改進(jìn)包括在添加沉淀劑(例如醇或聚乙二醇)之后和/或同時(shí)調(diào)節(jié)所沉淀血漿組分的PH值。在某些實(shí)施方案中，提供方法改進(jìn)，其中在整個(gè)沉淀孵育或保持步驟期間通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)和調(diào)節(jié)PH值來(lái)維持正有效地沉淀的血漿組分的PH值。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)噴霧添加pH值調(diào)整溶液來(lái)實(shí)施pH值的調(diào)節(jié)。在其它實(shí)施方案中，可與任何其它方法改進(jìn)組合的另一方法改進(jìn)包括使用細(xì)碎的二氧化硅處理步驟來(lái)除去雜質(zhì)。I.減少冷凍沉淀物的血漿的制備用于制備濃縮IgG組合物的起始材料一般是由回收血漿(即已在體外與全血分離的血漿)或原料血漿(即通過(guò)血漿去除術(shù)收集的血漿)組成。純化方法通常始于使先前冷凍的混合血漿解凍，所述混合血漿已經(jīng)過(guò)安全性和品質(zhì)因素分析。解凍通常是在不高于6°C的溫度下實(shí)施。在冷凍血漿在低溫下完全解凍后，在冷環(huán)境(例如<6°C)中實(shí)施離心以分離固體低溫沉淀物與液體上清液?；蛘?，可通過(guò)過(guò)濾而非離心來(lái)實(shí)施分離步驟。隨后在下一步驟中處理液體上清液(也稱作“減少冷凍沉淀物的血漿”，其是通過(guò)離心從剛解凍血漿除去冷不溶性蛋白質(zhì)后獲得)。此時(shí)可實(shí)施多個(gè)附加步驟來(lái)分離因子VIII抑制劑旁路活性(factor eight inhibitor bypass activity) (FEIBA)、因子 IX-復(fù)合體、因子 VII-濃縮物或抗凝血酶III-復(fù)合體。2.第一沉淀事件-經(jīng)過(guò)修改的的分級(jí)分離I在此步驟中，通常將減少冷凍沉淀物的血漿冷卻至約0土 1°C并將pH值調(diào)節(jié)至介于約7. 0與約7. 5之間、優(yōu)選介于約7. I與約7. 3之間，最優(yōu)選為約7. 2。在一個(gè)實(shí)施方案中，將減少冷凍沉淀物的血漿的PH值調(diào)節(jié)至pH值為7. 2或約7. 2。隨后在攪拌血漿的同時(shí)添加預(yù)冷卻的乙醇至8%v/v或約8%v/v的目標(biāo)乙醇濃度。同時(shí)使溫度進(jìn)一步降低至介于約-4°C與約0°C之間。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，使溫度降低至_2°C或約_2°C以使諸如Ci2-巨球蛋白、@1A-球蛋白和。-球蛋白、纖維蛋白原和因子VIII等污染物沉淀。通常，沉淀事件可包括至少約I小時(shí)的保持時(shí)間，但也可采用更短或更長(zhǎng)的保持時(shí)間。隨后，通過(guò)離心、過(guò)濾或另一適合方法來(lái)收集理想地含有減少冷凍沉淀物的血漿中存在的全部IgG含量的上清液(上清液I)。與用作減少冷凍沉淀物的血漿的第一分級(jí)分離步驟的常規(guī)方法(Cohn等，如前所述；0ncley等，如前所述)相比，本發(fā)明在若干個(gè)實(shí)施方案中提供在上清液I組分中獲得提高的IgG產(chǎn)率的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，提高的IgG產(chǎn)率是通過(guò)噴霧添加醇來(lái)實(shí)現(xiàn)。在另一實(shí)施方案中，提高的IgG產(chǎn)率是通過(guò)噴霧添加pH值調(diào)整劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。在再一實(shí)施方案中，提高的IgG產(chǎn)率是通過(guò)在添加醇后調(diào)節(jié)溶液的pH值來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一相關(guān)實(shí)施方案中，提高的IgG產(chǎn)率是通過(guò)在添加醇期間調(diào)節(jié)溶液的pH值來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)特定方面，改進(jìn)涉及在方法中第一沉淀步驟的沉淀物組分中損失的IgG量降低。舉例來(lái)說(shuō)，在某些實(shí)施方案中，與Cohn方法6方案的第一沉淀步驟中損失的IgG量相比，在第一沉淀步驟的沉淀物組分中損失的IgG量降低。在某些實(shí)施方案中，方法改進(jìn)是通過(guò)在添加沉淀用醇之后將溶液的pH值調(diào)節(jié)至介于約7. 0與約7. 5之間來(lái)實(shí)現(xiàn)。在其它實(shí)施方案中，在添加沉淀用醇之后將溶液的pH值 調(diào)節(jié)至介于約7. I與約7. 3之間。在其它實(shí)施方案中，在添加沉淀用醇之后將溶液的pH值調(diào)節(jié)至約7.0或約7. 1、7.2、7.3、7.4或7.5。在一特定實(shí)施方案中，在添加沉淀用醇之后將溶液的PH值調(diào)節(jié)至約7. 2。因此，在某些實(shí)施方案中，與在添加沉淀用醇之前而非之后調(diào)節(jié)溶液的PH值的類似沉淀步驟相比，第一沉淀步驟的沉淀物組分中損失的IgG量降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，在沉淀保持或孵育時(shí)間期間通過(guò)連續(xù)調(diào)節(jié)溶液的PH值來(lái)將pH值維持在期望pH值。在一個(gè)實(shí)施方案中，醇是乙醇。在某些其它實(shí)施方案中，方法改進(jìn)是通過(guò)噴霧添加而非流動(dòng)添加沉淀用醇和/或用于調(diào)節(jié)PH值的溶液來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，在某些實(shí)施方案中，與通過(guò)流動(dòng)添加引入醇和/或用于調(diào)節(jié)PH值的溶液的類似沉淀步驟相比，第一沉淀步驟的沉淀物組分中損失的IgG量降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，醇是乙醇。在某些其它實(shí)施方案中，改進(jìn)是通過(guò)將溶液的pH值調(diào)節(jié)至介于約7. 0與約7. 5之間來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，將溶液的PH值調(diào)節(jié)至介于約7. I與約7. 3之間。在其它實(shí)施方案中，在添加沉淀用醇之后且通過(guò)噴霧添加而非流動(dòng)添加沉淀用醇和/或用于調(diào)節(jié)PH值的溶液來(lái)將溶液的pH值調(diào)節(jié)至7. 0或約7. 0,7. 1,7. 2,7. 3,7. 4或7. 5。在一特定實(shí)施方案中，在添加沉淀用醇之后且通過(guò)噴霧添加而非流動(dòng)添加沉淀用醇和/或用于調(diào)節(jié)PH值的溶液來(lái)將溶液的PH值調(diào)節(jié)至7. 2或約7. 2。在一個(gè)實(shí)施方案中，醇是乙醇。3.第二沉淀事件-經(jīng)過(guò)修改的的分級(jí)分離II+III為進(jìn)一步提高分級(jí)分離中的IgG含量和純度，對(duì)上清液I實(shí)施第二沉淀步驟，其是經(jīng)過(guò)修改的Cohn-Oncley組分II+III分級(jí)分離。一般來(lái)說(shuō)，將溶液的pH值調(diào)節(jié)至介于約6. 6與約6. 8之間的pH值。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，將溶液的pH值調(diào)節(jié)至6. 7或約6. 7。然后在攪拌的同時(shí)將醇(優(yōu)選為乙醇)添加至溶液中至介于約20%與約25%(v/v)之間的終濃度，從而使組分中的IgG沉淀。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，添加醇至25%(v/v)或約25%(v/v)的終濃度以使組分中的IgG沉淀。一般來(lái)說(shuō)，所述條件不會(huì)使諸如以下等污染物沉淀a i-脂蛋白、a r抗胰蛋白酶、Ge-球蛋白、a 1X_糖蛋白、結(jié)合球蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血液結(jié)合素、克雷斯馬斯因子(Christmas factor)的組分、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、膽堿酯酶、聞血壓蛋白原和白蛋白。在添加醇之前或同時(shí)，使溶液進(jìn)一步冷卻至介于約-7 V與約_9°C之間。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，使溶液冷卻至_7°C或約_7°C的溫度。在醇添加完成后，立即將溶液的pH值調(diào)節(jié)至介于約6. 8與約7. O之間。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，將溶液的pH值調(diào)節(jié)至6. 9或約6. 9。通常，沉淀事件可包括至少約10小時(shí)的保持時(shí)間，但也可采用更短或更長(zhǎng)保持時(shí)間。隨后，通過(guò)離心、過(guò)濾或另一適合方法從上清液分離理想地含有減少冷凍沉淀物的血漿中存在的IgG含量的至少約85%、優(yōu)選至少約90%、更優(yōu)選至少約95%的沉淀物(經(jīng)過(guò)修改的組分II+III)并加以收集。與用作減少冷凍沉淀物的血漿的第二分級(jí)分離步驟的常規(guī)方法(Cohn等,如前所述；0ncley等,如前所述)相比,本發(fā)明在若干個(gè)實(shí)施方案中提供在經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀物中獲得提高的IgG產(chǎn)率的方法。在一相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供使得經(jīng)過(guò)修改的II+III上清液中IgG損失降低的方法。與用作減少冷凍沉淀物的血漿的第二分級(jí)分離步驟的常規(guī)方法(Cohn等，如前所述；0ncley等,如前所述)相比,本發(fā)明在若干個(gè)實(shí)施方案中提供在經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀物中獲得提高的IgG產(chǎn)率的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，改進(jìn)是通過(guò)噴霧添加醇來(lái)實(shí)現(xiàn)。在另一實(shí)施方案中，改進(jìn)是通過(guò)噴霧添加PH值調(diào)整劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。在另一實(shí)施方案中，改進(jìn)是通過(guò)在添加醇后調(diào)節(jié)溶液的PH值來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一相關(guān)實(shí)施方案中，改進(jìn)是通過(guò)在添加醇期間 調(diào)節(jié)溶液的PH值來(lái)實(shí)現(xiàn)。在另一實(shí)施方案中，改進(jìn)是通過(guò)將醇(例如乙醇)濃度提高至約25%(v/v)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在另一實(shí)施方案中，改進(jìn)是通過(guò)將沉淀步驟的溫度降低至介于約_7°C與-9°C之間來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，改進(jìn)是通過(guò)將醇(例如乙醇)濃度提高至約25%(v/v)和將溫度降低至介于約-7V與-9°C之間來(lái)實(shí)現(xiàn)。相比之下，Cohn等和Oncley等兩者皆在_5°C下實(shí)施沉淀且Oncley等使用20%醇以降低沉淀物中污染物的水平。有利的是，本文提供的方法使得可實(shí)現(xiàn)最大IgG產(chǎn)率而終產(chǎn)物中不含高水平的污染物。已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在添加沉淀用醇之前將溶液的pH值調(diào)節(jié)至pH值為約6. 9時(shí)，部分歸因于蛋白質(zhì)沉淀，溶液的PH值從6. 9變至介于約7. 4與約7. 7之間(參見(jiàn)圖8)。因?yàn)槿芤旱腜H值偏離6. 9，所以IgG的沉淀變得不太順利并且某些污染物的沉淀變得較為順利。有利的是，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在添加沉淀用醇之后調(diào)節(jié)溶液的PH值，在組分II+III沉淀物中回收到較高百分比的IgG。因此，在一個(gè)方面，改進(jìn)涉及在方法中在經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀步驟的上清液組分中損失的IgG量降低。換句話說(shuō)，組分II+III沉淀物中存在的起始IgG的百分比增力口。在某些實(shí)施方案中，方法改進(jìn)是通過(guò)在添加沉淀用醇之后或期間將溶液的PH值調(diào)節(jié)至介于約6. 7與約7. I之間來(lái)實(shí)現(xiàn)。在另一實(shí)施方案中，方法改進(jìn)是通過(guò)在沉淀孵育期中使溶液的PH值連續(xù)維持在介于約6. 7與約7. I之間來(lái)實(shí)現(xiàn)。在其它實(shí)施方案中，在添加沉淀用醇之后或期間將溶液的PH值調(diào)節(jié)至介于約6. 8與約7. 0之間，或在添加沉淀用醇之后立即或在添加期間調(diào)節(jié)至pH值為約6. 7,6. 8,6. 9,7. 0或7. I。在一特定實(shí)施方案中，在添加沉淀用醇之后或期間將溶液的PH值調(diào)節(jié)至約6. 9。在某些實(shí)施方案中，在沉淀孵育期中使溶液的PH值連續(xù)維持在介于約6. 8至約7. 0之間，或在沉淀孵育期中連續(xù)維持pH值為約6.9。因此，在某些實(shí)施方案中，與在添加沉淀用醇之前而非之后調(diào)節(jié)溶液的pH值的類似沉淀步驟相比，或與并未在整個(gè)沉淀孵育期中維持溶液的PH值的類似沉淀步驟相比，第二沉淀步驟的上清液組分中損失的IgG量降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，在沉淀保持或孵育時(shí)間期間通過(guò)連續(xù)調(diào)節(jié)溶液的PH值來(lái)將pH值維持在期望pH值。在一個(gè)實(shí)施方案中，醇是乙醇。在另一實(shí)施方案中，方法改進(jìn)是通過(guò)噴霧添加而非流動(dòng)添加沉淀用醇和/或用于調(diào)節(jié)PH值的溶液來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，在某些實(shí)施方案中，與通過(guò)流動(dòng)添加引入醇和/或用于調(diào)節(jié)PH值的溶液的類似沉淀步驟相比，第二沉淀步驟的上清液組分中損失的IgG量降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，醇是乙醇。在另一實(shí)施方案中，方法改進(jìn)是通過(guò)在介于約_7°C與約_9°C之間的溫度下實(shí)施沉淀步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，沉淀步驟是在_7°C或約-7°C的溫度下實(shí)施。在另一實(shí)施方案中，沉淀步驟是在_8°C或約-8°C的溫度下實(shí)施。在另一實(shí)施方案中，沉淀步驟是在_9°C或約-9°C的溫度下實(shí)施。在某些實(shí)施方案中，沉淀步驟的醇濃度介于約23%與約27%之間。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，醇濃度介于約24%與約26%之間。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，醇濃度為25%或約25%。在其它實(shí)施方案中，醇濃度可為或約為23%、24%、25%、26%或27%。在一特定實(shí)施方案中，第二沉淀步驟是在-7°C或約-7°C的溫度下實(shí)施且醇濃度為25%或約25%。在一個(gè)實(shí)施方案中，醇是乙醇。將第二沉淀中的醇濃度從20%(如Oncley等所用，如前所述)提高至25%和使孵育溫度從-5°C (如Cohn和Oncley方法中所用)降低至_7°C或約_7°C的作用是使經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀物中的IgG含量增加5%至6%。 在另一實(shí)施方案中，方法改進(jìn)是通過(guò)以下來(lái)實(shí)現(xiàn)在添加沉淀用醇之后立即或在添加期間將溶液的PH值調(diào)節(jié)至介于約6. 7與約7. I之間(優(yōu)選為6. 9或約6. 9)，在沉淀孵育期中通過(guò)連續(xù)調(diào)節(jié)pH值來(lái)使溶液的pH值維持在pH值介于約6. 7與約7. I之間(優(yōu)選為
6.9或約6. 9)，和噴霧添加而非流動(dòng)添加沉淀用醇和/或用于調(diào)節(jié)pH值的溶液。在另一特定實(shí)施方案中，方法改進(jìn)是通過(guò)以下來(lái)實(shí)現(xiàn)在介于約_7°C與約-9°C之間(優(yōu)選為_(kāi)7°C或約_7°C)的溫度下實(shí)施沉淀步驟，和用介于約23%與約27%之間(優(yōu)選為25%或約25%)的醇濃度使IgG沉淀。在另一特定實(shí)施方案中，方法改進(jìn)是通過(guò)納入所有以上提供的經(jīng)過(guò)修改的組分II+III改進(jìn)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，方法改進(jìn)是通過(guò)以下來(lái)實(shí)現(xiàn)在-7V或約-7°C的溫度下通過(guò)噴霧添加25%或約25%的乙醇使IgG沉淀，并且接著在添加沉淀用醇之后將溶液的PH值調(diào)節(jié)至6. 9或約6. 9。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，在整個(gè)沉淀孵育或保持時(shí)間期間使溶液的PH值維持在6. 9或約6. 9。4.經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀物的提取為溶解經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀物的IgG含量，使用冷提取緩沖液以I份沉淀物比15份提取緩沖液的典型比率使分級(jí)分離II+III沉淀物再懸浮?？墒褂闷渌m合再懸浮比率,例如約1:8至約1:30或約1:10至約1:20或約1:12至約1:18或約1:13至約1:17或約1:14至約1:16。在某些實(shí)施方案中，再懸浮比率可為約1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、I:14、I:15、I:16、I:17、I:18、I:19、I:20、I:21、I:22、I:23、I:24、I:25、I:26、1:27、1:28、1:29、1:30 或更高。用于提取經(jīng)過(guò)修改的II+III沉淀物的適合溶液的pH值一般介于約4. 0與約5. 5之間。在某些實(shí)施方案中，溶液的PH值介于約4. 5與約5. 0之間，在其它實(shí)施方案中，提取溶液的 pH 值可為約 4. 0,4. 1,4. 2,4. 3,4. 4,4. 5,4. 6,4. 7,4. 8,4. 9,5. 0,5. 1,5. 2,5. 3,5. 4或5. 5。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，提取緩沖液的pH值為4. 5或約4. 5。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，提取緩沖液的PH值為4. 7或約4. 7。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，提取緩沖液的pH值為4. 9或約4.9。一般來(lái)說(shuō)，所述pH值要求可使用選自以下的緩沖劑來(lái)滿足例如乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸二氫鹽、磷酸一氫鹽、其混合物等。適合緩沖液濃度通常介于約5至約IOOmM范圍內(nèi)，或?yàn)榧s 10 至約 50mM或約 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或IOOmM緩沖劑。提取緩沖液的電導(dǎo)率優(yōu)選為約0. 5mS CnT1至約2. OmS cnT1。舉例來(lái)說(shuō)，在某些實(shí)施方案中，提取緩沖液的電導(dǎo)率為約0. 5mS cnT1，或約0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. OU. 1、1. 2、
I.3、I. 4、I. 5、I. 6、I. 7、I. 8、I. 9或約2. OmS本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解如何產(chǎn)生具有適
當(dāng)電導(dǎo)率的提取緩沖液。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，示例性提取緩沖液可在4. 5 ±0. 2或約4. 5 ±0. 2的pH值和0. 7至0. 9mS/cm或約0. 7至0. 9mS/cm的電導(dǎo)率下含有5mM或約5mM的磷酸二氫鈉和5mM或約5mM的乙酸鹽。一般來(lái)說(shuō)，在介于約0°C與約10°C之間或介于約2°C與約8°C之間的溫度下實(shí)施提取。在某些實(shí)施方案中，可在約0°C、1°C、2°C、3°C、4°C、5°C、6°C、7°C、8°C、9°C或10°C下實(shí)施提取。在一特定實(shí)施方案中，在介于約2°C與約10°C之間的溫度下實(shí)施提取。通常，提取·過(guò)程將進(jìn)行介于約60與約300分鐘之間或介于約120與240min之間或介于約150與210分鐘之間的時(shí)長(zhǎng)，同時(shí)連續(xù)攪拌懸浮液。在某些實(shí)施方案中，提取過(guò)程將進(jìn)行約60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或約300分鐘。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，提取過(guò)程將在連續(xù)攪拌下進(jìn)行至少160分鐘。已發(fā)現(xiàn),米用含有5mM磷酸二氫鈉、5mM乙酸鹽和0. 051%至0. 06%冰乙酸(v/v)的提取緩沖液，最終IgG組合物中的產(chǎn)率提高可獲得實(shí)質(zhì)性增加而不危害終產(chǎn)物的純度。乙酸量與提取緩沖液pH值的相關(guān)性在圖9中示出。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，在4. 5±0. 2或約
4.5±0. 2的pH值下以糊狀物與緩沖液比率為1:15或約1:15下提取組分II+III沉淀物。有利的是，人們已發(fā)現(xiàn)，與GAMMAGAR!y LIQUID (Baxter Healthcare)的采用含有5mM磷酸二氫鈉、5mM乙酸鹽和0.051%冰乙酸(v/v)的提取緩沖液的現(xiàn)行制備方法相比，通過(guò)將冰乙酸含量提高至0. 06%(v/v)或約0. 06%(v/v)可使最終IgG組合物的產(chǎn)率提高獲得實(shí)質(zhì)性增加。與先前用于提取第二沉淀步驟(GAMMAGARIV' LIQUID)中形成的沉淀物的方法相比，本發(fā)明在若干個(gè)實(shí)施方案中提供在經(jīng)過(guò)修改的組分II+III懸浮液中獲得提高的IgG產(chǎn)率的方法。在一個(gè)方面，改進(jìn)涉及在方法中經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀物的不溶性組分中損失的IgG量降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法改進(jìn)是通過(guò)以1:15(沉淀物與緩沖液)的比率用含有5mM磷酸二氫鈉、5mM乙酸鹽和0. 06%冰乙酸(v/v)的溶液提取經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀物來(lái)實(shí)現(xiàn)。在另一實(shí)施方案中，改進(jìn)是通過(guò)在提取過(guò)程的持續(xù)期間維持溶液的PH值來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在提取過(guò)程的持續(xù)過(guò)程中溶液的pH值維持在介于約4. I與約4. 9之間。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，在提取過(guò)程的持續(xù)過(guò)程中溶液的pH值維持在介于約
4.2與約4. 8之間。在一更優(yōu)選實(shí)施方案中，在提取過(guò)程的持續(xù)過(guò)程中溶液的pH值維持在介于約4. 3與約4. 7之間。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，在提取過(guò)程的持續(xù)過(guò)程中溶液的pH值維持在介于約4. 4與約4. 6之間。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，在提取過(guò)程的持續(xù)過(guò)程中溶液的pH值維持在4. 5或約4. 5。在另一方面，改進(jìn)涉及在方法中在組分II+III溶解步驟中從組分II+III沉淀物溶解的IgG量增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法改進(jìn)是通過(guò)使組分II+III沉淀物溶解于每IOOOL含有600mL冰乙酸的溶解緩沖液中來(lái)實(shí)現(xiàn)。在另一實(shí)施方案中，改進(jìn)涉及在方法中在組分II+III沉淀物中的IgG溶解后雜質(zhì)減少。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法改進(jìn)是通過(guò)將細(xì)碎的二氧化硅(SiO2)與組分II+III懸浮液混合至少約30分鐘來(lái)實(shí)現(xiàn)。5.經(jīng)過(guò)修改的組分II+III懸浮液的預(yù)處理和過(guò)濾為除去經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀物(即經(jīng)過(guò)修改的組分II+III濾餅)中的不溶性組分，通常使用深層過(guò)濾來(lái)過(guò)濾懸浮液?？捎糜诒疚奶峁┑姆椒ㄖ械纳顚舆^(guò)濾器包括金屬、玻璃、陶瓷、有機(jī)(例如硅藻土)深層過(guò)濾器等。適合過(guò)濾器的實(shí)例包括但不限于Cuno50SA、Cuno90SA和Cuno VRO6過(guò)濾器(Cuno)?；蛘?可通過(guò)離心而非過(guò)濾來(lái)實(shí)施分離步驟。盡管上述制備方法改進(jìn)使純化過(guò)程初始步驟中的IgG損失最少，但在例如于PH4. 5或4. 6下提取II+III糊狀物時(shí)關(guān)鍵性的雜質(zhì)(包括PKA活性、酰胺分解活性和纖維 蛋白原含量)遠(yuǎn)多于在PH值為約4. 9至5. 0下進(jìn)行提取(參見(jiàn)實(shí)施例2至5)。為消除本文提供的方法中所提取的雜質(zhì)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)通過(guò)在過(guò)濾/離心之前增加預(yù)處理步驟可顯著提高IgG組合物的純度。在一個(gè)實(shí)施方案中，此預(yù)處理步驟包括添加細(xì)碎的二氧化硅顆粒(例如煙霧二氧化硅、氣相二氧化硅(Aerosif))，之后孵育40至80分鐘
的時(shí)期，在此期間持續(xù)混合懸浮液。在某些實(shí)施方案中，孵育期可介于約50分鐘與約70分鐘之間，或?yàn)榧s30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80分鐘或更久。一般來(lái)說(shuō)，可在介于約(TC與約10°C之間或介于約2°C與約8°C之間實(shí)施處理。在某些實(shí)施方案中，可在約0°C、1°〇、21、31、41、51、61、71、81、91或101下實(shí)施處理。在一特定實(shí)施方案中，在介于約2°C與約10°C之間實(shí)施處理。煙霧二氧化硅處理的作用通過(guò)實(shí)施例17中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果來(lái)例示。在此實(shí)施例中，使組分II+III沉淀物混懸并分為兩個(gè)樣品，其中一者僅在過(guò)濾前用助濾劑來(lái)澄清(圖7A)，且其中一者在添加助濾劑和過(guò)濾之前用煙霧二氧化硅處理(圖7B)。如色譜圖和定量數(shù)據(jù)中可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)煙霧二氧化硅預(yù)處理的濾液樣品的IgG純度遠(yuǎn)高于僅用助濾劑處理的樣品(68. 8%對(duì)55. 7% ;分另Ij比較表17與18)。在某些實(shí)施方案中，以介于約20g/kg II+III糊狀物與約100g/kgII+III糊狀物之間的濃度添加煙霧二氧化硅(即對(duì)于以1:15的比率提取的經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀物來(lái)說(shuō)，應(yīng)以約20g/16kg II+III懸浮液至約100g/16kg II+III懸浮液的濃度或以約0. 125%(w/w)至約0.625%(w/w)的終濃度添加煙霧二氧化硅)。在某些實(shí)施方案中，可以約20g/kg II+III 糊狀物或約 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 IOOg/kg II+III糊狀物的濃度添加煙霧二氧化硅。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將煙霧二氧化硅(例如氣相二氧化硅380或等同物)添加至經(jīng)過(guò)修改的組分II+III懸浮液中至約40g/16kgII+III的終濃度。在約2至8°C下混合至少50至70分鐘。在某些實(shí)施方案中，將在二氧化硅處理后添加助濾劑(例如CelpureC300 (Celpure)或 Hyflo-Supper-Cel (World Minerals))以促進(jìn)深層過(guò)濾。可以約 0. Ikg/kg II+III糊狀物至約0.07kg/kg II+III糊狀物或約0. 2kg/kg II+III糊狀物至約0. 06kg/kg II+III糊狀物或約0. 3kg/kgII+III糊狀物至約0. 05kg/kg II+III糊狀物的終濃度添加助濾劑。在某些實(shí)施方案中，可以約0. lkg/kg II+III糊狀物或約0. 2,0. 3,0. 4、0. 5,0. 6或0. 7kg/kg II+III糊狀物的終濃度添加助濾劑。
在Gammagardk liquid制備方法的過(guò)濾步驟期間損失較大比例的igG。已發(fā)現(xiàn)，過(guò)濾后洗滌的現(xiàn)行方法使用I. 8死體積的混懸緩沖液來(lái)清洗壓濾機(jī)框架和管線，其在此步驟中不足以實(shí)現(xiàn)IgG的最大回收。令人驚訝的是，人們發(fā)現(xiàn)為有效回收經(jīng)過(guò)修改的組分II+III澄清懸浮液中的總IgG，需要至少3. 0死體積、優(yōu)選3. 6死體積的混懸緩沖液(參見(jiàn)實(shí)施例12和圖I)。在某些實(shí)施方案中，可用任何適合混懸緩沖液來(lái)洗滌壓濾機(jī)。在一特定實(shí)施方案中，洗滌緩沖液包含例如5mM磷酸二氫鈉、5mM乙酸鹽和0. 015%冰乙酸(v/v)。在一個(gè)方面，改進(jìn)涉及在方法中在組分II+III懸浮液過(guò)濾步驟期間損失的IgG量降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法改進(jìn)是通過(guò)用至少約3. 6死體積的每1000L含有150mL冰乙酸的溶解緩沖液后洗滌過(guò)濾器來(lái)實(shí)現(xiàn)。后洗滌緩沖液中冰乙酸量與PH值之間的關(guān)系于圖10中示出。在一個(gè)實(shí)施方案中，后洗滌提取緩沖液的pH值介于約4. 6與約5. 3之間。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，后洗滌緩沖液的PH值介于約4. 7與約5. 2之間。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，后洗滌緩沖液的PH值介于約4. 8與約5. I之間。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，后洗滌緩沖液的PH值介于約4. 9與約5. 0之間。
·
與先前用于澄清第二沉淀步驟(GAV1\1AC;ARi)K LIQUID)中形成的懸浮液的方法相比，本發(fā)明在若干個(gè)實(shí)施方案中提供在澄清的組分II+III懸浮液中獲得提高的IgG產(chǎn)率和純度的方法。在一個(gè)方面，改進(jìn)涉及在方法中經(jīng)過(guò)修改的組分II+III濾餅中損失的IgG量降低。在另一方面，改進(jìn)涉及在方法中在澄清的組分II+III懸浮液中存在的雜質(zhì)量降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法改進(jìn)是通過(guò)在過(guò)濾或離心澄清經(jīng)過(guò)修改的組分II+III懸浮液之前納入煙霧二氧化硅處理來(lái)實(shí)現(xiàn)。在某些實(shí)施方案中，煙霧二氧化硅處理包括添加約 0. lkg/kg II+III 糊狀物至約 0. 07kg/kg II+III 糊狀物或約 0. 2kg/kg II+III 糊狀物至約 0.06kg/kg II+III 糊狀物或約 0. 3kg/kg II+III 糊狀物至約 0.05kg/kg II+III 糊狀物或約0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6或0. 7kg/kg II+III糊狀物，且混合物在介于約2°C與約8°C之間的溫度下孵育介于約50分鐘與約70分鐘之間或約30、35、40、45、50、55、60、65、70、75,80分鐘或更久。在另一實(shí)施方案中，方法改進(jìn)是通過(guò)納入煙霧二氧化硅處理來(lái)實(shí)現(xiàn)，其使殘余纖維蛋白原、酰胺分解活性和/或前激肽釋放酶活化因子活性的水平降低。在另一實(shí)施方案中，方法改進(jìn)是通過(guò)在完成經(jīng)過(guò)修改的組分II+III懸浮液過(guò)濾步驟后用介于約3與約5體積之間的過(guò)濾器死體積洗滌深層過(guò)濾器來(lái)實(shí)現(xiàn)。在某些實(shí)施方案中，用介于約3. 5體積與約4. 5體積之間或至少約2. 5,2. 6,2. 7,2. 8,2. 9,3. 0,3. 1,3. 2、
3.3,3. 4,3. 5,3. 6,3. 7,3. 8,3. 9,4. 0,4. 1,4. 2,4. 3,4. 4,4. 5,4. 6,4. 7,4. 8,4. 9,5. 0 體積的過(guò)濾器死體積洗滌過(guò)濾器。在一特定實(shí)施方案中，用至少約3. 6死體積的混懸緩沖液洗滌壓濾機(jī)。6.洗滌劑處理為從經(jīng)過(guò)修改的組分II+III濾液除去其它污染物，隨后對(duì)樣品實(shí)施洗滌劑處理。洗滌劑處理血漿源組分的方法為本領(lǐng)域中所熟知。一般來(lái)說(shuō)，可結(jié)合本文提供的方法使用任何標(biāo)準(zhǔn)非離子型洗滌劑處理。舉例來(lái)說(shuō)，洗滌劑處理的示例性方案提供于下文中。簡(jiǎn)單的說(shuō)，在攪拌下以約0. 2%(w/v)的終濃度將聚山梨醇酯-80添加至經(jīng)過(guò)修改的組分II+III濾液中，且在介于約2至8°C之間的溫度下將樣品孵育至少30分鐘。然后以約8g/L的終濃度將去水檸檬酸鈉混合至溶液中，并在介于約2至8°C之間的溫度下在連續(xù)攪拌下將樣品再孵育30分鐘。在某些實(shí)施方案中，可使用任何適合非離子型洗滌劑。適合非離子型洗滌劑的實(shí)例包括但不限于辛基葡糖苷、洋地黃皂苷(Digitonin)、C12E8、蘆布若爾(Lubrol)、曲拉通(Triton) X-100、Nonidet P-40、Tween-20 (即聚山梨醇酯-20)、Tween-80 (即聚山梨醇酯-80)、烷基聚(環(huán)氧乙烷)、Brij洗滌劑、烷基酚聚(環(huán)氧乙烷)、帕洛沙姆、辛基葡萄糖
苷、癸基麥芽糖苷等。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法改進(jìn)是通過(guò)噴霧添加而非流動(dòng)添加洗滌試劑(例如聚山梨醇酯-80和去水檸檬酸鈉)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在其它實(shí)施方案中，洗滌試劑可以固體形式添加至經(jīng)過(guò)修改的組分II+III濾液中，同時(shí)混合樣品以確保添加劑快速分布。在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選通過(guò)將固體撒布在濾液的非局部表面區(qū)域上來(lái)添加固體試劑，以使得不發(fā)生局部過(guò)濃(例如在流動(dòng)添加中)。
7.第三沉淀事件-沉淀G為除去若干殘余小蛋白質(zhì)(例如白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白)，以25%醇濃度實(shí)施第三沉淀。簡(jiǎn)單的說(shuō)，用適合PH值調(diào)整溶液(例如IM氫氧化鈉或IM乙酸)將經(jīng)過(guò)洗滌劑處理的II+III濾液的pH值調(diào)節(jié)至介于約6. 8與7. 2之間、優(yōu)選介于約6. 9與約7. I之間、最優(yōu)選為約7. O。然后將冷醇添加至溶液中至約25%(v/v)的終濃度并在攪拌下在約_6°C至-10°C之間的溫度下孵育所述混合物，從而形成第三沉淀物(即沉淀物G)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將混合物孵育至少 2 小時(shí)或至少 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、
22、23、24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，將混合物孵育至少2小時(shí)。在一更優(yōu)選實(shí)施方案中，將混合物孵育至少4小時(shí)。在一甚至更優(yōu)選實(shí)施方案中，將混合物孵育至少8小時(shí)。在一個(gè)方面，方法改進(jìn)涉及在方法中第三沉淀步驟的上清液組分中損失的IgG量降低。在某些實(shí)施方案中，方法改進(jìn)是通過(guò)在添加沉淀用醇之后立即或添加期間將溶液的PH值調(diào)節(jié)至介于約6. 8與約7. 2之間來(lái)實(shí)現(xiàn)。在另一實(shí)施方案中，方法改進(jìn)是通過(guò)在沉淀孵育期中使溶液的PH值連續(xù)維持在介于約6. 8與約7. 2之間來(lái)實(shí)現(xiàn)。在其它實(shí)施方案中，在添加沉淀用醇之后立即或在添加期間將溶液的PH值調(diào)節(jié)至介于約6. 9與約7. I之間，或在添加沉淀用醇之后立即或在添加期間調(diào)節(jié)至pH值為約6. 8,6. 9,7. 0,7. I或7. 2。在一特定實(shí)施方案中，在添加沉淀用醇之后立即或在添加期間將溶液的PH值調(diào)節(jié)至約7. O。在某些實(shí)施方案中，在沉淀孵育期中使溶液的PH值連續(xù)維持在介于約6. 9與約7. I之間，或在沉淀孵育期中連續(xù)維持PH值為約7. O。因此，在某些實(shí)施方案中，與在添加沉淀用醇之前而非之后調(diào)節(jié)溶液的PH值的類似沉淀步驟相比，或與并未在整個(gè)沉淀孵育期中維持溶液的PH值的類似沉淀步驟相比，在第三沉淀步驟的上清液組分中損失的IgG量降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，在沉淀保持或孵育時(shí)間期間通過(guò)連續(xù)調(diào)節(jié)溶液的pH值來(lái)將pH值維持在期望pH值。在一個(gè)實(shí)施方案中，醇是乙醇。在另一實(shí)施方案中，方法改進(jìn)是通過(guò)噴霧添加而非流動(dòng)添加沉淀用醇和/或用于調(diào)節(jié)PH值的溶液來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，在某些實(shí)施方案中，與通過(guò)流動(dòng)添加引入醇和/或用于調(diào)節(jié)PH值的溶液的類似沉淀步驟相比，在第三沉淀步驟的上清液組分中損失的IgG量降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，醇是乙醇。
8.沉淀物G (PptG)的混懸和過(guò)濾為溶解沉淀物G中的IgG含量，使用冷提取緩沖液來(lái)使PptG再懸浮。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在介于約0°C與約8°C之間下將沉淀物G以I比3. 5溶解于注射用水(WFI)中以使得AU28tl.值介于約40至95之間。隨后將攪拌至少2小時(shí)的溶液的最終pH值調(diào)節(jié)至5. 2±0. 2或約5.2±0.2。在一個(gè)實(shí)施方案中，用IM乙酸實(shí)施此pH值調(diào)節(jié)。為增加IgG的溶解度，使懸浮液的電導(dǎo)率增至介于約2. 5與約6. OmS/cm之間。在一個(gè)實(shí)施方案中,通過(guò)添加氯化鈉來(lái)使懸浮液的電導(dǎo)率增加。然后用標(biāo)稱孔徑介于約0. Iym與約0.4i!m之間的適合深層過(guò)濾器過(guò)濾混懸PptG溶液以除去任何未溶解的顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，深層過(guò)濾器的標(biāo)稱孔徑為約0.2 iim(例如Cuno VR06過(guò)濾器或等同物)以獲得澄清濾液。在另一實(shí)施方案中，對(duì)混懸PptG溶液進(jìn)行離心以回收澄清上清液。使用電導(dǎo)率介于約2. 5與約6. OmS/cm之間的氯化鈉溶液實(shí)施過(guò)濾器的后洗滌。通常，用于提取沉淀物G的適合溶液包括WFI和低電導(dǎo)率緩沖液。在一個(gè)實(shí)施方案中，低電導(dǎo)率緩沖液的電導(dǎo)率小于約10mS/cm。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，低電導(dǎo)率緩沖液的電導(dǎo)率小于約9、8、7、6、5、4、3、2或lmS/cm。在一優(yōu)選實(shí)施方案中， 低電導(dǎo)率緩沖液的電導(dǎo)率小于約6mS/cm。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，低電導(dǎo)率緩沖液的電導(dǎo)率小于約4mS/cm。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，低電導(dǎo)率緩沖液的電導(dǎo)率小于約2mS/cm。9.溶劑洗滌劑處理為使血漿源產(chǎn)物中可能存在的各種病毒污染物滅活，隨后對(duì)澄清PptG濾液實(shí)施溶劑洗滌劑(S/D)處理。洗滌劑處理血漿源組分的方法為本領(lǐng)域中所熟知(綜述參見(jiàn)Pelletier JP 等,Best Pract Res Clin Haematol. 2006 ; 19 (I) :205-42)。一般來(lái)說(shuō)，可結(jié)合本文提供的方法使用任何標(biāo)準(zhǔn)S/D處理。舉例來(lái)說(shuō)，S/D處理的示例性方案提供于下文中。簡(jiǎn)單的說(shuō)，分別以約I. 0%、0. 3%和0. 3%的終濃度將曲拉通X-100、Tween-20和磷酸三(正丁基)酯(TNBP)添加至澄清PptG濾液中。然后在介于約18°C與約25°C之間的溫度下將混合物攪拌至少約I小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法改進(jìn)是通過(guò)噴霧添加而非流動(dòng)添加S/D試劑(例如曲拉通x-100、Tween-20和TNBP)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在其它實(shí)施方案中，可將洗滌試劑以固體形式添加至澄清PptG濾液中，對(duì)其進(jìn)行混合以確保S/D組分快速分布。在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選通過(guò)將固體撒布在濾液的非局部表面區(qū)域上來(lái)添加固體試劑，以使得不發(fā)生局部過(guò)濃(例如在流動(dòng)添加中)。10.離子交換色譜為從經(jīng)過(guò)S/D處理的PptG濾液進(jìn)一步純化并濃縮IgG，可采用陽(yáng)離子交換和/或陰離子交換色譜。使用離子交換色譜純化并濃縮IgG的方法為本領(lǐng)域中所熟知。舉例來(lái)說(shuō)，美國(guó)專利號(hào)5，886，154描述如下方法其中在低pH值(介于約3. 8與4. 5之間)下提取組分II+III沉淀物，之后使用辛酸使IgG沉淀，且最后實(shí)施兩個(gè)陰離子交換色譜步驟。美國(guó)專利號(hào)6，069，236描述完全不依賴醇沉淀的色譜型IgG純化方案。PCT專利公布號(hào)TO2005/073252描述IgG純化方法，其涉及提取組分II+III沉淀物、辛酸處理、PEG處理和單一陰離子交換色譜步驟。美國(guó)專利號(hào)7，186,410描述IgG純化方法，其涉及提取組分I+II+III或組分II沉淀物，之后在堿性pH值下實(shí)施單一陰離子交換步驟。美國(guó)專利號(hào)7，553，938描述一種方法，其涉及提取組分I+II+III或組分II+III沉淀物、辛酸鹽處理和一個(gè)或兩個(gè)陰離子交換色譜步驟。美國(guó)專利號(hào)6，093，324描述一種純化方法，其包括使用在介于約6. 0與約6. 6之間的pH值下操作的大孔陰離子交換樹(shù)脂。美國(guó)專利號(hào)6，835，379描述在不存在醇分級(jí)分離的情形下依賴陽(yáng)離子交換色譜的純化方法。上述公布的公開(kāi)內(nèi)容都是全文以弓I用方式并入本文以用于所有目的。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，可對(duì)經(jīng)過(guò)S/D處理的PptG濾液實(shí)施陽(yáng)離子交換色譜和陰離子交換色譜兩者。舉例來(lái)說(shuō)，在一個(gè)實(shí)施方案中，使經(jīng)過(guò)S/D處理的PptG濾液流過(guò)陽(yáng)離子交換管柱，其結(jié)合溶液中的IgG。然后可從所吸附的IgG洗去S/D試劑，之后用PH值介于約8. 0與9. 0之間的高pH值洗脫緩沖液將所吸附的IgG洗脫出管柱。以此方式，可使用陽(yáng)離子交換色譜步驟從制劑除去S/D試劑，濃縮含IgG的溶液，或同時(shí)進(jìn)行兩者。在某些實(shí)施方案中，pH值洗脫緩沖液的pH值可介于約8. 2與約8. 8之間，或介于約8. 4與約
8.6 之間，或 pH 值為約 8. 0,8. 1,8. 2,8. 3,8. 4,8. 5,8. 6,8. 7,8. 8,8. 9 或 9. O。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，洗脫緩沖液的PH值為約8. 5±0. I。
在某些實(shí)施方案中，可將來(lái)自陽(yáng)離子交換管柱的洗出液調(diào)節(jié)至較低pH值，例如介于約5. 5與約6. 5之間，且用適當(dāng)緩沖液稀釋以使溶液的電導(dǎo)率降低。在某些實(shí)施方案中，可將陽(yáng)離子交換洗出液的PH值調(diào)節(jié)至pH值介于約5. 7與約6. 3之間或介于約5. 9與約
6.I 之間，或 pH 值為約 5. 5,5. 6,5. 7,5. 8,5. 9,6. 0,6. 1,6. 2,6. 3,6. 4 或 6. 5。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，將洗出液的PH值調(diào)節(jié)至pH值為約6. 0±0. I。然后將洗出液裝載至陰離子交換管柱上，其結(jié)合制劑中存在的若干污染物。在管柱裝載和洗滌期間收集含有IgG組分的管柱流過(guò)液。在某些實(shí)施方案中，可以管柱模式、分批模式或兩種模式的組合來(lái)實(shí)施本發(fā)明離子交換色譜步驟。在某些實(shí)施方案中，方法改進(jìn)是通過(guò)噴霧添加而非流動(dòng)添加用于調(diào)節(jié)pH值的溶液來(lái)實(shí)現(xiàn)。11.納米過(guò)濾和超濾/滲濾為進(jìn)一步降低本文提供的IgG組合物的病毒負(fù)載量，可使用適合納米過(guò)濾裝置對(duì)陰離子交換管柱流出液實(shí)施納米過(guò)濾。在某些實(shí)施方案中，納米過(guò)濾裝置的平均孔徑介于約15nm與約200nm之間。適用于此用途的納米過(guò)濾器的實(shí)例包括但不限于DVD、DV50、DV20 (Pall), Viresolve NFP、Viresolve NFR(Millipore)、Planoval5N、20N、35N 和75N(Planova)。在一具體實(shí)施方案中，納米過(guò)濾器的平均孔徑可介于約15nm與約72nm之間，或介于約19nm與約35nm之間，或?yàn)榧s15nm、19nm、35nm或72nm。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，納米過(guò)濾器的平均孔徑為約35nm，例如Asahi PLAN0VA35N過(guò)濾器或其等同物。任選地，可實(shí)施超濾/滲濾以進(jìn)一步濃縮納米濾液。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用開(kāi)放通道膜且在制備方法接近結(jié)束時(shí)實(shí)施特別設(shè)計(jì)的后洗滌和配制可使所得IgG組合物的蛋白質(zhì)濃度(200mg/mL)約為現(xiàn)有技術(shù)IVIG(例如GAWAGARDf: LIQUID)的兩倍且不影響產(chǎn)率和儲(chǔ)存穩(wěn)定性。大多數(shù)可商購(gòu)超濾膜皆不能在不損失較多蛋白質(zhì)的情形下實(shí)現(xiàn)200mg/mL IgG的濃度。所述膜會(huì)過(guò)早封閉且因此難以實(shí)現(xiàn)充分后洗滌。因此不得不使用開(kāi)放通道膜構(gòu)造。即使采用開(kāi)放通道膜，也不得不使用特別設(shè)計(jì)的后洗滌程序以獲得期望濃度而不造成較多蛋白質(zhì)損失(損失小于2%)。甚至更令人驚訝的事實(shí)在于，200mg/mL的較高蛋白質(zhì)濃度并不影響低PH值儲(chǔ)存步驟的病毒滅活能力。在納米過(guò)濾后，可通過(guò)超濾/滲濾進(jìn)一步濃縮濾液。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)超濾來(lái)將納米濾液濃縮至蛋白質(zhì)濃度介于約2%與約10%(w/v)之間。在某些實(shí)施方案中，在具有開(kāi)放通道篩網(wǎng)的盒中實(shí)施超濾且超濾膜的標(biāo)稱切割分子量(NMWCO)小于約IOOkDa或小于約90、80、70、60、50、40、30kDa或更小。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，超濾膜的NMWCO不超過(guò)50kDa。在完成超濾步驟后，可通過(guò)相對(duì)于適合靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)施用的溶液實(shí)施滲濾來(lái)進(jìn)一步濃縮濃縮物。在某些實(shí)施方案中，滲濾溶液可包含穩(wěn)定和/或緩沖劑。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，穩(wěn)定和緩沖劑是具有適當(dāng)濃度的甘氨酸，例如濃度介于約0. 20M與約0. 30M之間，或介于約0. 22M與約0. 28M之間，或介于約0. 24M與約0. 26M之間，或濃度為約2. 0,2. I、
2.2,2. 3,2. 4,2. 5,2. 6,2. 7,2. 8,2. 9或3. O。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，滲濾緩沖液含有0. 25M或約0. 25M甘氨酸。通常，最小交換體積為初始濃縮物體積的至少約3倍或初始濃縮物體積的至少約
4、5、6、7、8、9倍或更多倍?？蓪gG溶液濃縮至最終蛋白質(zhì)濃度介于約5%與約25%(w/v)之間，或介于約6%與約18%(w/v)之間，或介于約7%與約16%(w/v)之間，或介于約8%與約14%(w/v)之間，或介于約9%與約12%之間，或濃縮至終濃度為約5%或6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25% 或更高。在一個(gè)實(shí)施方案中，在不向濃縮溶液中添加后洗滌組分的情形下實(shí)現(xiàn)至少約23%的最終蛋白質(zhì)濃度。在另一實(shí)施方案中，在不向濃縮溶液中添加后洗滌組分的情形下實(shí)現(xiàn)至少約24%的最終蛋白質(zhì)濃度。在不向濃縮溶液中添加后洗滌組分的情形下實(shí)現(xiàn)至少約25%的最終蛋白質(zhì)濃度。通常，在濃縮過(guò)程結(jié)束時(shí)，溶液的pH值將介于約4. 6至5. I之間。在一示例性實(shí)施方案中，在超濾前將IgG組合物的pH值調(diào)節(jié)至約4. 5。通過(guò)超濾將溶液濃縮至蛋白質(zhì)濃度為5±2%w/v。UF膜的標(biāo)稱切割分子量(NMWCO)為50，000道爾頓或更小(Millipore Pellicon聚醚砜膜)。相對(duì)于10倍體積的0. 25M甘氨酸溶液(pH4. 5±0. 2)對(duì)濃縮物進(jìn)行滲濾。在整個(gè)超濾-滲濾操作中，使溶液維持在介于約2°C至約8°C之間的溫度下。在滲濾后，溶液濃縮至蛋白質(zhì)濃度為至少ll%(w/v)。12.配制在完成滲濾步驟后，用滲濾緩沖液將溶液的蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)至終濃度介于約5%與約20%(w/v)之間，或介于約6%與約18%(w/v)之間，或介于約7%與約16%(w/v)之間，或介于約8%與約14%(w/v)之間，或介于約9%與約12%之間，或調(diào)節(jié)至終濃度為約5%或6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19% 或 20%。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，溶液的最終蛋白質(zhì)濃度介于約9%與約11%之間，更優(yōu)選為約10%。通過(guò)利用絕對(duì)孔徑不超過(guò)約0. 22微米(例如約0. 2微米)的膜濾器過(guò)濾來(lái)對(duì)經(jīng)過(guò)配制的總體溶液實(shí)施進(jìn)一步滅菌。然后以無(wú)菌方式將溶液分配至適當(dāng)密封的最終容器中，且取樣以供測(cè)試。在一個(gè)實(shí)施方案中，用滲濾緩沖液將IgG組合物進(jìn)一步調(diào)節(jié)至濃度為約
10.2±0. 2%(w/v)。必要時(shí)，將pH值調(diào)節(jié)至約4. 4至約4. 9。最后，對(duì)溶液實(shí)施無(wú)菌過(guò)濾并在30°C或約30°C下孵育三周。13.醇添加有利的是，已發(fā)現(xiàn)，出于從血漿分級(jí)分離IgG的目的，噴霧添加而非流動(dòng)添加醇使得IgG產(chǎn)率的損失降低。不希望受理論限制，在流動(dòng)添加至血漿組分期間，醇在流體流入處的瞬時(shí)局部過(guò)濃可導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和不可逆損失和/或在IgG應(yīng)保留在上清液中的步驟期間導(dǎo)致IgG沉淀。此外，所述作用可在需要添加大體積醇時(shí)放大，例如涉及分級(jí)分離至少IOOL混合血漿的工業(yè)規(guī)模純化。通過(guò)噴霧添加醇的作用例示于實(shí)施例14中，其中用通過(guò)流動(dòng)添加(I和2)或噴霧添加(3和4)引入的8%乙醇使減少冷凍沉淀物的血漿樣品沉淀。如表14中可見(jiàn)，在將乙醇通過(guò)噴霧添加至樣品中時(shí)存在于減少冷凍沉淀物的血漿中的IgG近100%回收于上清液中，而在流動(dòng)添加醇后損失4-5%的IgG。僅在此步驟中，此即導(dǎo)致介于約0. 20g/L與0. 25g/L之間的IgG損失。對(duì)于2007年的生產(chǎn)水平來(lái)說(shuō)，此可換算為損失約530萬(wàn)克(5，300公斤)IgG?？紤]到IVIG的現(xiàn)行市場(chǎng)價(jià)格介于每克$50與$100之間的范圍內(nèi)，此步驟中損失4-5%代表全球經(jīng)濟(jì)每年損失多達(dá)5億美元。因此，在本文提供的方法的一個(gè)方面，通過(guò)噴霧添加醇來(lái)實(shí)施一個(gè)或多個(gè)沉淀步驟。在某些實(shí)施方案中，噴霧添加可通過(guò)使用任何加壓裝置來(lái)實(shí)施，例如具有噴頭或噴嘴且手動(dòng)或自動(dòng)化操作以從液體產(chǎn)生細(xì)霧的容器(例如噴霧瓶)。在某些實(shí)施方案中，噴霧添加是在連續(xù)攪拌或以其它方式混合系統(tǒng)的同時(shí)實(shí)施，從而確保液體在系統(tǒng)內(nèi)快速均勻地分·布。14. pH值的調(diào)節(jié)血楽;組分的蛋白質(zhì)沉淀特征高度依賴于沉淀出血衆(zhòng)蛋白質(zhì)的溶液的pH值。自從分別在1946年和1949年引入Cohn法和Oncley法以來(lái),科學(xué)家已利用此事實(shí)來(lái)分級(jí)分離血漿蛋白質(zhì)。傳統(tǒng)上，在添加醇之前調(diào)節(jié)血漿組分的PH值以有利于目標(biāo)組分的最高回收產(chǎn)率。有利的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在添加醇后直接調(diào)節(jié)溶液的PH值或在添加醇的同時(shí)調(diào)節(jié)溶液的PH值可獲得更明確且可重現(xiàn)的沉淀。人們發(fā)現(xiàn)，將乙醇添加至血漿組分中可導(dǎo)致溶液pH值波動(dòng)，一般是使溶液的pH值升高。因此，通過(guò)在添加醇之前而非之后將血漿組分的pH值調(diào)節(jié)至預(yù)定PH值，將會(huì)使沉淀反應(yīng)在非最適pH值下發(fā)生。同樣，從血漿組分沉淀蛋白質(zhì)會(huì)影響靜電環(huán)境且由此改變?nèi)芤旱膒H值。因此，隨著容許沉淀事件繼續(xù)進(jìn)行，溶液的PH值會(huì)開(kāi)始偏離使得目標(biāo)蛋白質(zhì)物質(zhì)可實(shí)現(xiàn)最大回收率的預(yù)定PH值。對(duì)于大部分蛋白質(zhì)沉淀的沉淀事件、使用高醇含量的沉淀事件和需要較長(zhǎng)孵育期的沉淀事件來(lái)說(shuō)，尤其會(huì)發(fā)生所述PH值偏離。調(diào)節(jié)血漿組分的pH值的作用由實(shí)施例16中所示的結(jié)果例示。在此實(shí)施例中，在噴霧添加醇之后從上清液I組分的兩個(gè)樣品沉淀IgG。在添加醇之前將兩個(gè)樣品的pH值都調(diào)節(jié)至6. 7且在添加醇之后但在10小時(shí)的沉淀孵育步驟之前將其再調(diào)節(jié)至6. 9。在第一樣品(參照)中，在10小時(shí)的孵育期間不調(diào)節(jié)pH值，而在樣品2(連續(xù)調(diào)節(jié))中，在10小時(shí)的孵育期間將PH值持續(xù)調(diào)節(jié)至pH6. 9。如表16中可見(jiàn)，在從樣品除去經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀物后，第一上清液含有0. 2g IgG/L血漿，而在沉淀孵育期間使pH值保持恒定的第二樣品僅含有0. 13g IgG/L血漿。第二樣品中所減少的0.07g IgG/L血漿的損失對(duì)于2007年的生產(chǎn)水平來(lái)說(shuō)代表?yè)p失約190萬(wàn)克(1，900公斤)IgG?？紤]到IVIG的現(xiàn)行市場(chǎng)價(jià)格介于每克$50與$100之間的范圍，此步驟中損失I. 5%代表全球經(jīng)濟(jì)每年損失多達(dá)2億美元。因此，在本文提供的方法的一個(gè)方面，在添加醇后直接調(diào)節(jié)血漿組分的pH值。在相關(guān)實(shí)施方案中，可在添加醇之前和之后或在添加醇期間和之后或在添加醇之前、期間和之后調(diào)節(jié)pH值。在一相關(guān)實(shí)施方案中，在一個(gè)或多個(gè)醇沉淀事件或孵育期間連續(xù)調(diào)節(jié)溶液的PH值。在某些實(shí)施方案中，在連續(xù)攪拌或以其它方式混合系統(tǒng)的同時(shí)連續(xù)調(diào)節(jié)或維持溶液的PH值，從而確保pH值調(diào)整劑在系統(tǒng)內(nèi)的快速均勻分布。與流動(dòng)添加醇的情形類似，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)添加大體積的pH值調(diào)整劑可引發(fā)瞬時(shí)局部PH值變化，從而導(dǎo)致不期望的蛋白質(zhì)變性或沉淀。因此，在本文提供的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)噴霧添加將PH值調(diào)整劑引入一個(gè)或多個(gè)血漿分級(jí)分離步驟中。在本文提供的方法的另一實(shí)施方案中，可通過(guò)噴霧添加PH值調(diào)整劑來(lái)調(diào)節(jié)血漿組分或沉淀步驟的PH值。在某些實(shí)施方案中，噴霧添加可通過(guò)使用任何加壓裝置來(lái)實(shí)施，例如具有噴頭或噴嘴且手動(dòng)或自動(dòng)化操作以從液體產(chǎn)生細(xì)霧的容器(例如噴霧瓶)。在某些實(shí)施方案中，噴霧添加是在連續(xù)攪拌或以其它方式混合系統(tǒng)的同時(shí)實(shí)施，從而確保液體在系統(tǒng)內(nèi)快速均勻地分 布。III.濃縮IgG組合物已描述包含全抗體的IVIG組合物可用于治療某些自體免疫性病狀。(例如，參見(jiàn)美國(guó)專利公布號(hào)US2002/0114802、US2003/0099635和US2002/0098182)。所述參考文獻(xiàn)中所公開(kāi)的IVIG組合物包括多克隆抗體。I.水性IgG組合物在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及通過(guò)本文提供的方法制備的水性IgG組合物。一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)本文所述的新穎方法制備的IgG組合物將具有高IgG含量和純度。舉例來(lái)說(shuō)，本文提供的IgG組合物的蛋白質(zhì)濃度可為至少約3%(w/v)且IgG含量大于約90%純度。所述高純度IgG組合物適合于治療性施用，例如適合IVIG療法。在一個(gè)實(shí)施方案中，IgG的濃度為約10%且用于靜脈內(nèi)施用。在另一實(shí)施方案中，濃度為約20%且用于皮下或肌肉內(nèi)施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過(guò)包括以下步驟的方法制備的水性IgG組合物(a)在第一沉淀步驟中用介于約6%與約10%之間的醇在介于約6. 7與約7. 3之間的pH值下使減少冷凍沉淀物的質(zhì)粒組分(plasmidfraction)沉淀,從而獲得富含IgG的上清液，
(b)用介于約20%與約30%之間的醇在介于約6. 7與約7. 3之間的pH值下使IgG從上清液沉淀，從而形成第一沉淀物，(c)使步驟(b)中形成的第一沉淀物再懸浮以形成懸浮液，(d)用洗滌劑處理步驟(c)中形成的懸浮液，(e)用介于約20%與約30%之間的醇在介于約6. 7與約7. 3之間的pH值下使IgG從懸浮液沉淀，從而形成第二沉淀物，(f)使步驟(e)中形成的第二沉淀物再懸浮以形成懸浮液，(g)用溶劑和/或洗滌劑處理步驟(f)中形成的懸浮液，和(h)實(shí)施至少一次離子交換色譜分級(jí)分離，由此制備含有濃縮IgG的組合物。在一具體實(shí)施方案中，提供通過(guò)包括以下步驟的方法制備的IgG組合物(a)將減少冷凍沉淀物的血漿組分的PH值調(diào)節(jié)至約7.0，(b)在介于約_5°C與約_9°C之間的溫度下將步驟(a)中減少冷凍沉淀物的血漿組分的乙醇濃度調(diào)節(jié)至約25%(v/v)，由此形成混合物，(c)從步驟(b)的混合物分離液體和沉淀物，(d)用含有磷酸鹽和乙酸鹽的緩沖液使步驟(c)的沉淀物再懸浮，其中每1000L緩沖液用600mL冰乙酸調(diào)節(jié)緩沖液的pH值，由此形成懸浮液，(e)將細(xì)碎的二氧化硅(Si02)與步驟(d)的懸浮液混合至少約30分鐘，(f)用壓濾機(jī)過(guò)濾所述懸浮液，由此形成濾液，(g)用至少3倍壓濾機(jī)死體積的含有磷酸鹽和乙酸鹽的緩沖液洗滌壓濾機(jī)，其中每1000L緩沖液用150mL冰乙酸調(diào)節(jié)緩沖液的pH值，由此形成洗滌溶液，(h)合并步驟(f)的濾液與步驟(g)的洗滌溶液，由此形成溶液，且用洗滌劑處理所述溶液，(i)將步驟(h)的溶液的pH值調(diào)節(jié)至約7. O并添加乙醇至終濃度為約25%，由此形成沉淀物，(j)從步驟(i)的混合物分離液體和沉淀物，(k)使沉淀物溶解于包含溶劑或洗滌劑的水溶液中且將所述溶液維持至少60分鐘，(I)在步驟(k)后使所述溶液流過(guò)陽(yáng)離子交換色譜管柱并將吸附在管柱上的蛋白質(zhì)洗脫于洗出液中，(m)使步驟(I)的洗出液流過(guò)陰離子交換色譜管柱以產(chǎn)生流出液，(n)使步驟(m)的流出液流過(guò)納米過(guò)濾器以產(chǎn)生納米濾液，(O)使步驟(n)的納米濾液流過(guò)超濾膜以產(chǎn)生超濾液，和(P)相對(duì)于滲濾緩沖液滲濾步驟(O)的超濾液以產(chǎn)生蛋白質(zhì)濃度介于約8%(w/v)與約12%(w/v)之間的滲濾液，由此獲得具有濃縮IgG的組合物。在某些實(shí)施方案中，使用本文提供的方法制備水性IgG組合物，所述方法在上述分級(jí)分離方法步驟中的兩個(gè)或多個(gè)中包括改進(jìn)。舉例來(lái)說(shuō)，在某些實(shí)施方案中，改進(jìn)可存在于第一沉淀步驟、經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀步驟、經(jīng)過(guò)修改的組分II+III溶解步驟和/或經(jīng)過(guò)修改的組分II+III懸浮液過(guò)濾步驟中。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供通過(guò)本文所述的純化方法制備的水性IgG組合物，其中 所述方法包括噴霧添加一種或多種原本通過(guò)流動(dòng)添加引入血漿組分中的溶液。舉例來(lái)說(shuō)，在某些實(shí)施方案中，所述方法包括通過(guò)噴霧將醇(例如乙醇)引入血漿組分中。在其它實(shí)施方案中，可通過(guò)噴霧添加至血漿組分中的溶液包括但不限于PH值調(diào)整溶液、溶劑溶液、洗滌劑溶液、稀釋緩沖液、電導(dǎo)率調(diào)整溶液等。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)將醇噴霧添加至血漿組分中來(lái)實(shí)施一個(gè)或多個(gè)醇沉淀步驟。在一第二優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)將PH值調(diào)整溶液噴霧添加至血漿組分中來(lái)實(shí)施一個(gè)或多個(gè)PH值調(diào)整步驟。在某些實(shí)施方案中，提供通過(guò)本文所述的純化方法制備的水性IgG組合物，其中所述方法包括在添加沉淀劑(例如醇或聚乙二醇)之后和/或同時(shí)調(diào)節(jié)所沉淀血漿組分的PH值。在某些實(shí)施方案中，提供方法改進(jìn)，其中在整個(gè)沉淀孵育或保持步驟期間通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)和調(diào)節(jié)PH值來(lái)維持正有效地沉淀的血漿組分的pH值。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)噴霧添加PH值調(diào)整溶液來(lái)實(shí)施pH值的調(diào)節(jié)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供水性IgG組合物，其包含介于約30g/L與約250g/L之間的蛋白質(zhì)濃度。在某些實(shí)施方案中，IgG組合物的蛋白質(zhì)濃度介于約50g/L與約200g/L之間，或介于約70g/L與約150g/L之間，或介于約90g/L與約120g/L，或?yàn)樗龇秶鷥?nèi)的任何適合濃度，例如約 30g/L 或約 35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L、100g/L、105gL、110g/L、I15g/L、120g/L、125g/L、130g/L、135g/L、140g/L、145g/L、150g/L、155g/L、160g/L、165g/L、170g/L、175g/L、180gL、185g/L、190g/L、195g/L、200g/L、205g/L、210g/L、215g/L、220g/L、225g/L、230g/L、235g/L、240g/L、245g/L、250g/L或更高。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，水性IgG組合物的濃度為10%或約10%。在一特別優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物的濃度為10. 2±0. 2%(w/v)。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，水性IgG組合物的濃度為20%或約20%。本文提供的方法使得可制備具有極高純度的IgG組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的組合物中至少約95%的總蛋白質(zhì)為IgG。在其它實(shí)施方案中，至少約96%的蛋白質(zhì)為IgG，或組合物中總蛋白質(zhì)的至少約97%、98%、99%、99. 5%或更多為IgG。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物中至少97%的總蛋白質(zhì)為IgG。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物中至少98%的總蛋白質(zhì)為IgG。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物中至少99%的總蛋白質(zhì)為IgG。
類似地，本文提供的方法使得可制備含有極低水平污染物的IgG組合物。舉例來(lái)說(shuō)，表19提供通過(guò)本文提供的改進(jìn)方法制備的三種總體IgG溶液的雜質(zhì)測(cè)試的結(jié)果。在某些實(shí)施方案中，提供含有少于約140mg/L IgA的IgG組合物。在其它實(shí)施方案中，IgG組合物含有少于約60mg/L IgA、優(yōu)選少于約40mg/L IgA、最優(yōu)選少于約30mg/L IgA。在另一實(shí)施方案中，提供含有少于約50mg/L IgM的IgG組合物。在其它實(shí)施方案中，IgG組合含有少于約25mg/L IgM、優(yōu)選少于約10mg/L IgM、更優(yōu)選少于約5mg/L IgM、更優(yōu)選少于約4mg/L IgM、更優(yōu)選少于約3mg/L IgM、最優(yōu)選少于約2. 5mg/L IgM。在另一實(shí)施方案中，提供含有少于約100PL-lnmol/mL min酰胺分解活性的IgG組合物。在其它實(shí)施方案中，IgG組合物含有少于約50PL-lnmol/mL min酰胺分解活性、優(yōu)選少于約25PL-lnmol/mL min酰胺分解活性、更優(yōu)選少于約20PL-lnmol/mL min酰胺分解活性、更優(yōu)選少于約15PL-lnmol/mL min酰胺分解活性、最優(yōu)選少于約10PL-lnmol/mL min酰胺分解活性。
在另一實(shí)施方案中，提供含有少于約20mg/L纖維蛋白原的IgG組合物。在其它實(shí)施方案中，IgG組合物含有少于約10mg/L纖維蛋白原、優(yōu)選少于約5mg/L纖維蛋白原、更優(yōu)選少于約2. 5mg/L纖維蛋白原、更優(yōu)選少于約lmg/L纖維蛋白原、更優(yōu)選少于約0. 5mg/L纖維蛋白原、最優(yōu)選少于約0. 25mg/L纖維蛋白原。在另一實(shí)施方案中，提供主要由IgG單體/ 二聚體組成的IgG組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供至少 95%、96%、97%、98%、99%、99. 1%、99. 2%, 99. 3%, 99. 4%, 99. 5%, 99. 6%, 99. 7%、99. 8%或99. 9%的IgG是單體或二聚體的IgG組合物。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，提供至少97%的IgG是單體或二聚體的IgG組合物。在一更優(yōu)選實(shí)施方案中，至少99%的IgG是單體或二聚體。在一更優(yōu)選實(shí)施方案中，至少99. 5%的IgG是單體或二聚體。在一更優(yōu)選實(shí)施方案中，至少99. 7%的IgG是單體或二聚體。2.藥物組合物在另一方面，本發(fā)明提供包含通過(guò)本文提供的方法制備的純化IgG的藥物組合物和制劑。一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)本文所述的新穎方法制備的IgG藥物組合物和制劑具有高IgG含量和純度。舉例來(lái)說(shuō)，本文提供的IgG藥物組合物和制劑的蛋白質(zhì)濃度可為至少約7%(w/v)且IgG含量可大于約95%純度。所述高純度IgG藥物組合物和制劑適合于治療性施用，例如適合IVIG療法。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，配制藥用IgG組合物以供靜脈內(nèi)施用(例如IVIG療法)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的藥物組合物是通過(guò)配制使用本文提供的方法分離的水性IgG組合物來(lái)制備。一般來(lái)說(shuō)，將已對(duì)經(jīng)過(guò)配制的組合物實(shí)施至少一個(gè)、優(yōu)選至少兩個(gè)、最優(yōu)選至少三個(gè)病毒滅活或除去步驟?？捎糜诒疚奶峁┑姆椒ǖ牟《緶缁罨虺ゲ襟E的非限制性實(shí)例包括溶劑洗漆劑處理(Horowitz等，Blood CoagulFibrinolysisl994(5 增刊 3) :S21_S28 ;和 Kreil 等，Transfusion2003 (43) :1023-1028,兩個(gè)參考文獻(xiàn)都是全文以引用方式明確并入本文以用于所有目的)、納米過(guò)濾(Hamamoto等，Vox Sangl989(56)230-236 ;和 Yuasa 等，J Gen Virol. 1991 (72 (pt8)): 2021-2024，兩個(gè)參考文獻(xiàn)都是全文以引用方式明確并入本文以用于所有目的)和在高溫下的低PH值孵育(Kempf 等，Transfusionl991 (31) 423-427 ;和 Louie 等，Biologicalsl994 (22) : 13-19)。在某些實(shí)施方案中，提供IgG含量介于約80g/L IgG與約120g/LIgG之間的藥用制劑。一般來(lái)說(shuō)，所述IVIG是通過(guò)以下方式來(lái)制備使用本文所述的方法從血漿分離IgG組合物，濃縮所述組合物，并在適合靜脈內(nèi)施用的溶液中配制濃縮組合物?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適合方法來(lái)濃縮IgG組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)超濾/滲濾來(lái)濃縮組合物。在某些實(shí)施方案中，用于濃縮組合物的超濾裝置將采用標(biāo)稱切割分子量(NMWCO)小于約IOOkDa或小于約90、80、70、60、50、40、30kDa或更小的超濾膜。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，超濾膜的NMWCO不超過(guò)50kDa?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適合技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)緩沖液交換。在一具體實(shí)施方案中，通過(guò)滲濾來(lái)實(shí)現(xiàn)緩沖液交換。在一具體實(shí)施方案中，提供IgG的藥物組合物，其中使用包括以下步驟的方法從血衆(zhòng)純化IgG組合物(a)在第一沉淀步驟中用介于約6%與約10%之間的醇在介于約6. 7與約7. 3之間的pH值下使減少冷凍沉淀物的質(zhì)粒組分(plasmidfraction)沉淀,從而獲得富含IgG的上清液，(b)用介于約20%與約30%之間的醇在介于約6. 7與約7. 3之間的pH值下使IgG從上清液沉淀，從而形成第一沉淀物，(c)使步驟(b)中形成的第一沉淀物再懸浮以形成懸浮液，(d)用洗滌劑處理步驟(c)中形成的懸浮液，(e)用介于約20%與約30%之間的醇在介于約6. 7與約7. 3之間的pH值下使IgG從懸浮液沉淀，從而形成第二沉淀物，(f)使步驟(e)中形成的第二沉淀物再懸浮以形成懸浮液，(g)用溶劑和/或洗滌劑處理步·驟(f)中形成的懸浮液，(h)實(shí)施至少一次離子交換色譜分級(jí)分離；(i)實(shí)施溶劑洗滌劑處理；和(j)對(duì)組合物實(shí)施納米過(guò)濾，由此制備IgG的組合物。在一具體實(shí)施方案中，提供IgG的藥物組合物，其中使用包括以下步驟的方法從血衆(zhòng)純化IgG組合物(a)將減少冷凍沉淀物的血衆(zhòng)組分的pH值調(diào)節(jié)至約7. 0, (b)在介于約_5°C與約_9°C之間的溫度下將步驟(a)中減少冷凍沉淀物的血漿組分的乙醇濃度調(diào)節(jié)至約25%(v/v)，由此形成混合物，(c)從步驟(b)的混合物分離液體和沉淀物，(d)用含有磷酸鹽和乙酸鹽的緩沖液使步驟(c)的沉淀物再懸浮,其中每1000L緩沖液用600mL冰乙酸調(diào)節(jié)緩沖液的PH值，由此形成懸浮液，(e)將細(xì)碎的二氧化硅(Si02)與步驟(d)的懸浮液混合至少約30分鐘，(f)用壓濾機(jī)過(guò)濾所述懸浮液，由此形成濾液，(g)用至少3倍壓濾機(jī)死體積的含有磷酸鹽和乙酸鹽的緩沖液洗滌壓濾機(jī)，其中每1000L緩沖液用150mL冰乙酸調(diào)節(jié)緩沖液的PH值，由此形成洗滌溶液，(h)合并步驟(f)的濾液與步驟(g)的洗滌溶液，由此形成溶液，且用洗滌劑處理所述溶液，(i)將步驟(h)的溶液的pH值調(diào)節(jié)至約7.0并添加乙醇至終濃度為約25%，由此形成沉淀物，(j)從步驟(i)的混合物分離液體和沉淀物，(k)使沉淀物溶解于包含溶劑或洗滌劑的水溶液中且將所述溶液維持至少60分鐘，(I)在步驟(k)后使所述溶液流過(guò)陽(yáng)離子交換色譜管柱并將吸附在管柱上的蛋白質(zhì)洗脫于洗出液中，(m)使步驟(I)的洗出液流過(guò)陰離子交換色譜管柱以產(chǎn)生流出液，(n)使步驟(m)的流出液流過(guò)納米過(guò)濾器以產(chǎn)生納米濾液，(O)使步驟(n)的納米濾液流過(guò)超濾膜以產(chǎn)生超濾液，和(P)相對(duì)于滲濾緩沖液滲濾步驟(O)的超濾液以產(chǎn)生蛋白質(zhì)濃度介于約8%(w/v)與約12%(w/v)之間的滲濾液，由此獲得具有濃縮IgG的組合物。在某些實(shí)施方案中，提供IgG的藥物組合物，其中使用本文提供的方法制備IgG組合物，所述方法在上述分級(jí)分離方法步驟中的兩個(gè)或多個(gè)中包括改進(jìn)。舉例來(lái)說(shuō)，在某些實(shí)施方案中，改進(jìn)可存在于第一沉淀步驟、經(jīng)過(guò)修改的組分II+III沉淀步驟、經(jīng)過(guò)修改的組分II+III溶解步驟和/或經(jīng)過(guò)修改的組分II+III懸浮液過(guò)濾步驟中。在某些實(shí)施方案中，提供IgG的藥物組合物，其中使用本文提供的純化方法制備IgG組合物，其中所述方法包括噴霧添加一種或多種原本通過(guò)流動(dòng)添加引入血漿組分中的溶液。舉例來(lái)說(shuō)，在某些實(shí)施方案中，所述方法包括通過(guò)噴霧將醇(例如乙醇)引入血漿組分中。在其它實(shí)施方案中，可通過(guò)噴霧添加至血漿組分中的溶液包括但不限于PH值調(diào)整溶液、溶劑溶液、洗滌劑溶液、稀釋緩沖液、電導(dǎo)率調(diào)整溶液等。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)將醇噴霧添加至血漿組分中來(lái)實(shí)施一個(gè)或多個(gè)醇沉淀步驟。在一第二優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)將PH值調(diào)整溶液噴霧添加至血漿組分中來(lái)實(shí)施一個(gè)或多個(gè)pH值調(diào)整步驟。在某些實(shí)施方案中，提供IgG的藥物組合物，其中通過(guò)本文所述的純化方法制備IgG組合物，其中所述方法包括在添加沉淀劑(例如醇或聚乙二醇)之后和/或同時(shí)調(diào)節(jié)所沉淀血漿組分的PH值。在某些實(shí)施方案中，提供方法改進(jìn)，其中在整個(gè)沉淀孵育或保持步驟期間通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)和調(diào)節(jié)PH值來(lái)維持正有效地沉淀的血漿組分的pH值。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)噴霧添加PH值調(diào)整溶液來(lái)實(shí)施pH值的調(diào)節(jié)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供IgG的藥物組合物，其包含介于約70g/L與約130g/L之間的蛋白質(zhì)濃度。在某些實(shí)施方案中，IgG組合物的蛋白質(zhì)濃度介于約80g/L與 約120gL之間，優(yōu)選介于約90g/L與約110g/L之間，最優(yōu)選為約100g/L，或?yàn)樗龇秶鷥?nèi)的任何適合濃度，例如約 70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L、100g/L、105g/L、110g/L、115g/L、120g/L、125g/L或130g/L。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，提供蛋白質(zhì)濃度為100g/L或約100g/L的藥物組合物。在一特別優(yōu)選實(shí)施方案中，藥物組合物的蛋白質(zhì)濃度為102g/L或約102gL。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供IgG的藥物組合物，其包含介于約170g/L與約230g/L之間的蛋白質(zhì)濃度。在某些實(shí)施方案中，IgG組合物的蛋白質(zhì)濃度介于約180g/L與約220g/L之間，優(yōu)選介于約190g/L與約210gL之間，最優(yōu)選為約200g/L，或?yàn)樗龇秶鷥?nèi)的任何適合濃度，例如約 170g/L、175gL、180g/L、185g/L、190g/L、195g/L、200g/L、205g/L、210g/L、215g/L、220g/L、225g/L或230g/L。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，提供蛋白質(zhì)濃度為200g/L或約200g/L的藥物組合物。本文提供的方法使得可制備具有極高純度的IgG藥物組合物。舉例來(lái)說(shuō)，在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的組合物中至少約95%的總蛋白質(zhì)為IgG。在其它實(shí)施方案中，至少約96%的蛋白質(zhì)為IgG，或組合物中總蛋白質(zhì)的至少約97%、98%、99%、99. 5%或更多為IgG。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物中至少97%的總蛋白質(zhì)為IgG。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物中至少98%的總蛋白質(zhì)為IgG。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物中至少99%的總蛋白質(zhì)為IgG0類似地，本文提供的方法使得可制備含有極低水平污染物的IgG藥物組合物。舉例來(lái)說(shuō)，在某些實(shí)施方案中，提供含有少于約100mg/LIgA的IgG組合物。在其它實(shí)施方案中，IgG組合物含有少于約50mg/L IgA、優(yōu)選少于約35mg/L IgA、最優(yōu)選少于約20mg/L IgA。本文提供的藥物組合物通常包含一種或多種適合靜脈內(nèi)、皮下和/或肌肉內(nèi)施用的緩沖劑或PH值穩(wěn)定劑。適合配制本文提供的IgG組合物的緩沖劑的非限制性實(shí)例包括甘氨酸、檸檬酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、谷氨酸鹽、酒石酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、組氨酸或其它氨基酸、葡糖酸鹽、蘋果酸鹽、琥珀酸鹽、甲酸鹽、丙酸鹽、碳酸鹽或其調(diào)節(jié)至適當(dāng)PH值的任何組合。一般來(lái)說(shuō)，緩沖劑將足以將制劑中的適合PH值維持延長(zhǎng)時(shí)間段。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，緩沖劑是甘氨酸。
在某些實(shí)施方案中，緩沖劑在制劑中的濃度介于約IOOmM與約400mM之間，優(yōu)選介于約150mM與約350mM之間，更優(yōu)選介于約200mM與約300mM之間，最優(yōu)選為約250mM。在一特別優(yōu)選實(shí)施方案中，IVIG組合物包含介于約200mM與約300mM之間的甘氨酸，最優(yōu)選包含約250mM甘氨酸。在某些實(shí)施方案中，制劑的pH值介于約4. I與約5. 6之間，優(yōu)選介于約4. 4與約
5.3之間，最優(yōu)選介于約4. 6與約5. I之間。在特定實(shí)施方案中，制劑的pH值可為約4. I、4. 2,4. 3,4. 4,4. 5,4. 6,4. 7,4. 8,4. 9,5. 0,5. 1,5. 2,5. 3,5. 4,5. 5 或 5. 6。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，制劑的pH值介于約4. 6與約5. I之間。在某些實(shí)施方案中，本文提供的藥物組合物任選地可更包含用于調(diào)節(jié)組合物摩爾滲透壓濃度的試劑。摩爾滲透壓濃度試劑的非限制性實(shí)例包括甘露醇、山梨醇、甘油、蔗糖、葡萄糖、右旋糖、左旋糖、果糖、乳糖、聚乙二醇、磷酸鹽、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、葡糖酸葡庚糖酸鈣、二甲基砜等。 通常，本文提供的制劑的摩爾滲透壓濃度將與生理摩爾滲透壓濃度相當(dāng)，為約285-295m0smol/kg(Lacy 等，Drug Information Handbook-Lexi_Compl999:1254)。在某些實(shí)施方案中，制劑的摩爾滲透壓濃度介于約200m0smol/kg與約350m0smol/kg之間，優(yōu)選介于約240與約300m0smol/kg之間。在特定實(shí)施方案中，制劑的摩爾滲透壓濃度為約 200m0smol/kg 或 210m0smol/kg、220m0smol/kg、230m0smol/kg、240m0smol/kg、245m0smol/kg、250m0smol/kg、255m0smol/kg、260m0smol/kg、265m0smol/kg、270m0smol/kg、275m0smol/kg、280m0smol/kg、285m0smo1/kg、290m0smo1/kg、295m0smol/kg、300m0smo1/kg、3IOmOsmo1/kg、320m0smo1/kg、330m0smo1/kg、340m0smo1/kg、340m0smoI/kg或 350m0smol/kgo本文提供的IgG制劑一般可在延長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)以液體形式保持穩(wěn)定。在某些實(shí)施方案中，制劑可在室溫下穩(wěn)定至少約3個(gè)月，或在室溫下穩(wěn)定至少約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個(gè)月。制劑一般也可在冷藏條件(通常介于約2°C與約8°C之間)下穩(wěn)定6個(gè)月或至少約18個(gè)月，或在冷藏條件下穩(wěn)定至少約21、24、27、30、33、36、39、42 或 45 個(gè)月。IV.治療方法如現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的常規(guī)實(shí)踐，使用濃縮免疫球蛋白(尤其IgG)的滅菌制劑來(lái)治療屬于以下三大類的醫(yī)學(xué)病狀免疫缺陷、炎癥性和自身免疫病、和急性感染。所述IgG制劑也可用于治療多發(fā)性硬化癥(尤其復(fù)發(fā)-緩解型多發(fā)性硬化癥或RRMS)、阿茲海默氏病和帕金森氏病。本發(fā)明的純化IgG制劑適合于所述目的以及臨床上可接受的IgG制劑的其它用途。FDA已批準(zhǔn)使用IVIG來(lái)治療各種適應(yīng)癥，包括同種異體骨髓移植、慢性淋巴細(xì)胞白血病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、兒科HIV、原發(fā)性免疫缺陷、川崎病、慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(CIDP)、和具有高抗體接受體或具有ABO不相容性供體的腎移植。在某些實(shí)施方案中，本文提供的IVIG組合物可用于治療或管控所述疾病和病狀。此外，一般向患者提供IVIG的標(biāo)示外用法，以治療或管控各種適應(yīng)癥，例如慢性疲勞綜合癥、難辨梭菌結(jié)腸炎、皮肌炎和多肌炎、格雷夫氏眼病、吉蘭-巴雷綜合癥、肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、包涵體肌炎、蘭伯特-伊頓綜合癥、紅斑狼瘡、多灶性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病、多發(fā)性硬化癥(MS)、重癥肌無(wú)力、新生兒同種免疫性血小板減少癥、B19型細(xì)小病毒感染、天皰瘡、輸血后紫癜、腎移植排斥、自然流產(chǎn)/早產(chǎn)、僵硬人綜合癥、眼陣攣-肌陣攣綜合癥、成年危重病人的嚴(yán)重?cái)⊙Y和敗血癥性休克、中毒性表皮壞死溶解癥、慢性淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、X-連鎖丙種球蛋白缺乏血癥和低丙球蛋白血癥。在某些實(shí)施方案中，本文提供的IVIG組合物可用于治療或管控所述疾病和病狀。最后，已提出IVIG用于治療或管控包括原發(fā)性免疫缺陷、RRMS、阿茲海默氏病和帕金森氏病在內(nèi)的疾病的實(shí)驗(yàn)用途(美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)u. S. 2009/0148463，其是全文以引用方式并入本文以用于所有目的)。在某些實(shí)施方案中，本文提供的IVIG組合物可用于治療或管控原發(fā)性免疫缺陷、RRMS、阿茲海默氏病或帕金森氏病。在包括每日施用的某些實(shí)施方案中，可由醫(yī)師在考慮以下個(gè)體差異后來(lái)確定施用至受試者的有效量年齡、體重、疾病嚴(yán)重度、施用路徑(例如靜脈內(nèi)與皮下)和對(duì)療法的反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫球蛋白制劑可依每天約5mg/公斤至約2000mg/公斤的量施用至受試者。在其它實(shí)施方案中，免疫球蛋白制劑可依以下量施用至少約IOmg/公斤、至少15mg/公斤、至少20mg/公斤、至少25mg/公斤、至少30mg/公斤或至少50mg/公斤。在其它實(shí)施方案中，免疫球蛋白制劑可依每天最多約IOOmg/公斤、最多約150mg/公斤、最多約200mg/公斤、最多約250mg/·公斤、最多約300mg/公斤、最多約400mg/公斤的劑量施用至受試者。在其它實(shí)施方案中，免疫球蛋白制劑的劑量可增加或減少。此外，免疫球蛋白制劑可每天施用一個(gè)或多個(gè)劑量。熟悉IgG制劑所治療疾病的臨床醫(yī)師可根據(jù)本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定患者的適合劑量。根據(jù)本發(fā)明，完成治療時(shí)程所需要的時(shí)間可由醫(yī)師來(lái)確定且可介于短至一天至一個(gè)月以上的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，治療時(shí)程可為I至6個(gè)月。通過(guò)靜脈內(nèi)方式將有效量的IVIG制劑施用至受試者。術(shù)語(yǔ)“有效量”是指IVIG制劑可使受試者的疾病或病狀獲得改善或補(bǔ)救的量。欲施用至受試者的有效量可由醫(yī)師在考慮以下個(gè)體差異后來(lái)確定年齡、體重、所治療疾病或病狀、疾病嚴(yán)重度和對(duì)療法的反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，IVIG制劑可以每次施用約5mg/公斤至約2000mg/公斤的劑量施用至受試者。在某些實(shí)施方案中，劑量可為至少約5mg/kg或至少約10mg/kg或至少約20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、350mg/kg、400mg/kg、450mg/kg、500mg/kg、550mg/kg、600mg/kg、650mg/kg、700mg/kg、750mg/kg、800mg/kg、850mg/kg、900mg/kg、950mg/kg、1000mg/kg、1100mg/kg、1200mg/kg、1300mg/kg、1400mg/kg、1500mg/kg、1600mg/kg> 1700mg/kg> 1800mg/kg> 1900mg/kg 或至少約 2000mg/kg。IVIG治療的劑量和頻率尤其取決于以下因素所治療的疾病或病狀和患者疾病或病狀的嚴(yán)重度。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于原發(fā)性免疫功能障礙來(lái)說(shuō)，大約每3至4周施用介于約IOOmg/公斤體重與約400mg/公斤體重之間的劑量。對(duì)于神經(jīng)性和自身免疫病來(lái)說(shuō)，在3至6個(gè)月內(nèi)施用最多2g/公斤體重，每月施用一次，每次時(shí)程為5天。此一般補(bǔ)充有維持療法，其包括大約每3至4周施用一次介于約IOOmg/公斤體重與約400mg/公斤體重之間的劑量。一般來(lái)說(shuō)，患者將接受大約每14至35天或大約每21至28天一次的劑量或治療。治療頻率尤其取決于以下因素所治療的疾病或病狀和患者疾病或病狀的嚴(yán)重度。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，提供治療有需要的人的免疫缺陷、自身免疫病或急性感染的方法，所述方法包括施用本發(fā)明的藥用IVIG組合物。在一相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供根據(jù)本文提供的方法制備的IVIG組合物，其用于治療有需要的人的免疫缺陷、自身免疫病或急性感染。在某些實(shí)施方案中，免疫缺陷、自身免疫病或急性感染是選自同種異體骨髓移植、慢性淋巴細(xì)胞白血病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、兒科HIV、原發(fā)性免疫缺陷、川崎病、慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(CIDP)、具有高抗體接受體或具有ABO不相容性供體的腎移植、慢性疲勞綜合癥、難辨梭菌結(jié)腸炎、皮肌炎和多肌炎、格雷夫氏眼病、吉蘭-巴雷綜合癥、肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、包涵體肌炎、蘭伯特-伊頓綜合癥、紅斑狼瘡、多灶性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病、多發(fā)性硬化癥(MS)、重癥肌無(wú)力、新生兒同種免疫性血小板減少癥、B19型細(xì)小病毒感染、天皰瘡、輸血后紫癜、腎移植排斥、自然流產(chǎn)/早產(chǎn)、僵硬人綜合癥、眼陣攣-肌陣攣綜合癥、成年危重病人的嚴(yán)重?cái)⊙Y和敗血癥性休克、中毒性表皮壞死溶解癥、慢性淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、X-連鎖丙種球蛋白缺乏血癥、低丙球蛋白血癥、原發(fā)性免疫缺陷、RRMS、阿茲海默氏病和帕金森氏病。
實(shí)施例 僅以說(shuō)明性方式而非限制性方式提供以下實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地了解多種非關(guān)鍵參數(shù)，可對(duì)所述參數(shù)進(jìn)行改變或修改而獲得基本上相同或類似的結(jié)果。實(shí)施例I本實(shí)施例證實(shí)，可在過(guò)濾前通過(guò)用氣相二氧化硅處理從所提取的修改的組分II+III糊狀物懸浮液除去大量纖維蛋白原、酰胺分解活性、前激肽釋放酶活性和脂蛋白。當(dāng)前使用煙霧二氧化硅(氣相二氧化硅380)來(lái)吸附纖維蛋白原、酰胺分解活性、前激肽釋放酶活性和脂蛋白。為更詳細(xì)地研究氣相二氧化硅的作用，在過(guò)濾前用不同量的氣相二氧化硅處理6份經(jīng)過(guò)修改的組分II+III懸浮液。簡(jiǎn)單的說(shuō)，使用含有5mM乙酸鈉/5mM磷酸二氫鈉緩沖液的溶解緩沖液(pH4. 5)以每克II+III糊狀物15克溶解緩沖液的比率來(lái)再懸浮如本文所述制備的經(jīng)過(guò)修改的II+III糊狀物。在添加糊狀物后，在介于2V與8°C之間的溫度下于pH值受控環(huán)境(pH IPC限值4. 9至5. 3)中將懸浮液攪拌I小時(shí)。我們已發(fā)現(xiàn)，此懸浮液的PH值通常變至pH值為約5. 1，且因此不需要其它pH值調(diào)節(jié)。在至少120分鐘的附加提取后，將氣相二氧化硅380以每克II+III糊狀物0至IOOmg添加至容器中并將懸浮液孵育I小時(shí)。添加硅藻土，之后用Cuno50SA過(guò)濾器實(shí)施深層過(guò)濾。在過(guò)濾后，用含有8g L-1檸檬酸鹽和0. 2%聚山梨醇酯80的提取緩沖液(pH5. 0)洗滌過(guò)濾器并將洗滌液添加至濾液中。然后用聚山梨醇酯80處理合并的濾液和洗滌溶液以進(jìn)一步溶解例如脂蛋白等疏水性雜質(zhì)，且用25%乙醇(pH7)在介于_8°C與-10°C之間的溫度下使IgG沉淀。所得Ppt G沉淀物幾乎為白色且具有較高IgG純度。然后以每2克Ppt G沉淀物7克水的比率將沉淀物溶解于純水中。在Cuno過(guò)濾步驟后分析IgG溶液的IgG回收率和雜質(zhì)。具體來(lái)說(shuō)，測(cè)量酰胺分解活性(PL-I)、PKA活性和纖維蛋白原的水平(表3)。值得注意的是，如表3中所見(jiàn)，使用每克II+III糊狀物40至60mg氣相二氧化硅380提取方案實(shí)現(xiàn)可接受水平的IgG回收，且顯著降低酰胺分解和PKA活性，以及顯著降低濾液中的纖維蛋白原的水平。與不進(jìn)行氣相二氧化硅處理而實(shí)施的提取相比，每克II+III糊狀物添加40mg氣相二氧化硅380使PKA活性和纖維蛋白原含量降低幾乎90%且使酰胺分解活性降低60%，同時(shí)維持類似的IgG回收率(73%)。表I.在II+III Cuno過(guò)濾步驟中氣相二氧化硅380的量的作用(以CAMMACARDii LIQUID 條件提取)
權(quán)利要求
1.一種從血漿制備富含IgG的組合物的方法，所述方法包括以下步驟 (a)在第一沉淀步驟中，用介于約6%與約10%之間的醇，在介于約7.0與約7. 5之間的pH值下,使減少冷凍沉淀物的質(zhì)粒組分(plasmid fraction)沉淀,獲得第一沉淀物和第一上清液； (b)在第二沉淀步驟中，用介于約20%與約25%之間的醇，在介于約6.7與約7. 3之間的pH值下,使IgG從所述第一上清液沉淀,形成第二沉淀物； (c)使所述第二沉淀物再懸浮，以形成懸浮液； (d)在第三沉淀步驟中，用介于約22%與約28%之間的醇，在介于約6.7與約7. 3之間的PH值下，使IgG從步驟(c)中形成的所述懸浮液沉淀，形成第三沉淀物； (e)使所述第三沉淀物再懸浮，以形成懸浮液；和 (f)從步驟(e)中形成的所述懸浮液分離可溶性組分，由此形成富含IgG的組合物， 其中所述第一沉淀步驟、第二沉淀步驟或第三沉淀步驟中的至少一個(gè)包括噴霧添加所述醇。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述第一沉淀步驟、第二沉淀步驟和第三沉淀步驟皆包括噴霧添加所述醇。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所述第一沉淀步驟、第二沉淀步驟或第三沉淀步驟中至少一個(gè)的pH值是在添加所述醇后，通過(guò)添加pH值調(diào)整溶液來(lái)實(shí)現(xiàn)。
4.如權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一沉淀步驟、第二沉淀步驟和第三沉淀步驟的PH值都是在添加所述醇后，通過(guò)添加pH值調(diào)整溶液來(lái)實(shí)現(xiàn)。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其中所述添加pH值調(diào)整溶液包括噴霧添加所述pH值調(diào)整溶液。
6.如權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中在添加醇之前和之后、在添加醇期間和之后或在添加醇之前、期間和之后，調(diào)整所述沉淀步驟的PH值。
7.如權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中在整個(gè)沉淀步驟中通過(guò)連續(xù)調(diào)節(jié)所述pH值來(lái)維持所述至少一個(gè)沉淀步驟的pH值。
8.如權(quán)利要求I至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括離子交換色譜純化步驟。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述方法包括陰離子交換色譜純化步驟和陽(yáng)離子交換色譜步驟兩者。
10.如權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括納米過(guò)濾步驟和/或超濾/滲濾步驟。
11.如權(quán)利要求I至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(f)中獲得的所述富含IgG的組合物包含步驟(a)中所用所述減少冷凍沉淀物的血漿組分中IgG含量的至少85%。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中在步驟(f)中獲得的所述富含IgG的組合物包含步驟(a)中所用所述減少冷凍沉淀物的血漿組分中IgG含量的至少90%。
13.如權(quán)利要求I至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述最終IgG組合物中Y-球蛋白的純度為至少約95%。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述最終IgG組合物中Y-球蛋白的純度為至少約 98%o
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述最終IgG組合物中Y-球蛋白的純度為至少約 99%o
16.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述方法包括以下步驟 (a)將減少冷凍沉淀物的血漿組分的pH值調(diào)節(jié)至約7.O ； (b)在介于約_7°C與約_9°C之間的溫度下，將步驟(a)的所述減少冷凍沉淀物的血漿組分的乙醇濃度調(diào)節(jié)至約25%(v/v)，由此形成混合物； (c)從步驟(b)的所述混合物分離液體和沉淀物； (d)用含有磷酸鹽和乙酸鹽的緩沖液，使步驟(c)的所述沉淀物再懸浮，其中每IOOOL緩沖液用介于300mL與700mL之間的冰乙酸調(diào)節(jié)所述緩沖液的pH值，由此形成懸浮液； (e)將細(xì)碎的二氧化硅(SiO2)與步驟(d)的所述懸浮液混合至少約30分鐘； (f)用壓濾機(jī)過(guò)濾所述懸浮液，由此形成濾液； (g)用至少3倍壓濾機(jī)死體積的含有磷酸鹽和乙酸鹽的緩沖液洗滌所述壓濾機(jī)，其中每1000L緩沖液用介于50mL與200mL之間的冰乙酸調(diào)節(jié)所述緩沖液的pH值，由此形成洗滌溶液； (h)合并步驟(f)的所述濾液與步驟(g)的所述洗滌溶液，由此形成溶液，并且用洗滌劑處理所述溶液； (i)將步驟(h)的所述溶液的pH值調(diào)節(jié)至約7.0并添加乙醇至終濃度為約25%，由此形成沉淀物； (j)從步驟(i)的所述混合物分離液體和沉淀物； (k)使所述沉淀物溶解于包含溶劑或洗滌劑的水溶液中并將所述溶液維持至少60分鐘； (I)在步驟(k)后使所述溶液流過(guò)陽(yáng)離子交換色譜管柱并將吸附在所述管柱上的蛋白質(zhì)洗脫于洗出液中； (m)使步驟(I)的所述洗出液流過(guò)陰離子交換色譜管柱，以產(chǎn)生流出液； (n)使步驟(m)的所述流出液流過(guò)納米過(guò)濾器，以產(chǎn)生納米濾液； (O)使步驟(n)的所述納米濾液流過(guò)超濾膜，以產(chǎn)生超濾液；和 (P)將步驟(O)的所述超濾液相對(duì)于滲濾緩沖液進(jìn)行滲濾，以產(chǎn)生蛋白質(zhì)濃度介于約8%(w/v)與約12%(w/v)之間的滲濾液，由此獲得具有濃縮IgG的組合物。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中在步驟(b)和(i)中的至少一個(gè)中，通過(guò)噴霧將乙醇引入所述組分中來(lái)調(diào)節(jié)所述乙醇濃度。
18.如權(quán)利要求16或17所述的方法，其中在步驟(b)和(i)中的至少一個(gè)中，在所述添加乙醇后將所述pH值調(diào)節(jié)至適合pH值。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中對(duì)于整個(gè)沉淀反應(yīng)，通過(guò)在步驟(b)和(i)中的至少一個(gè)中連續(xù)調(diào)節(jié)pH值來(lái)維持所述pH值。
20.如權(quán)利要求16至19中任一項(xiàng)所述的方法，其中在至少一個(gè)步驟中通過(guò)噴霧能夠調(diào)節(jié)所述pH值的溶液來(lái)調(diào)節(jié)所述pH值。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中通過(guò)噴霧冰乙酸來(lái)調(diào)節(jié)pH值。
22.如權(quán)利要求16至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括通過(guò)0.22 ii m或更小的過(guò)濾器過(guò)濾所述滲濾液。
23.如權(quán)利要求16至22中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述血漿是人血漿。
24.如權(quán)利要求16至23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述減少冷凍沉淀物的血漿組分是通過(guò)包括以下步驟的方法來(lái)形成 (i)使混合獻(xiàn)血漿的混合物冷卻至介于約2°C與約10°C之間的溫度； (ii)通過(guò)離心由步驟(i)的所述混合物分離液體和沉淀物； (iii)將乙醇混合至步驟(ii)中形成的液體上清液中，直至最終濃度介于約5%(v/v)至約10%(v/v)乙醇之間，由此形成混合物； (iv)使步驟(iii)中形成的所述混合物冷卻至介于約_4°C與約0°C之間； (v)通過(guò)離心由步驟(iv)的所述混合物分離液體和沉淀物；和分離所述上清液，由此 形成減少冷凍沉淀物的血漿組分。
25.如權(quán)利要求16至24中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(b)的所述混合物的所述溫度為約_7°C。
26.如權(quán)利要求16至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中每kg沉淀物使用介于約12L與約18L之間的緩沖液，使步驟(c)中形成的所述沉淀物再懸浮。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中每kg沉淀物用約15L緩沖液使所述沉淀物再懸浮。
28.如權(quán)利要求16至27中任一項(xiàng)所述的方法，其中添加至步驟(e)中的所述懸浮液中的二氧化硅的量介于約0. 02克/克步驟(c)中形成的沉淀物與約0. 06克/克步驟(c)中形成的沉淀物之間。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中添加至步驟(e)中的所述懸浮液中的二氧化硅的量為約0. 04克/克步驟(c)中形成的沉淀物。
30.如權(quán)利要求16至29中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(f)中在過(guò)濾之前，向所述混合物中添加助濾劑。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述助濾劑是硅藻土。
32.如權(quán)利要求16至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(f)中形成的所述濾液中所述Y -球蛋白的純度為至少約85%。
33.如權(quán)利要求16至32中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(f)中形成的所述濾液含有少于約IOmg的纖維蛋白原/克總蛋白質(zhì)。
34.如權(quán)利要求16至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(f)中形成的所述濾液含有少于約500IU的PKA活性/克總蛋白質(zhì)。
35.如權(quán)利要求16至34中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(h)中所用的所述洗滌劑包含介于約0. l%(w/v)與約0. 3%(w/v)之間的聚山梨醇酯-80。
36.如權(quán)利要求16至35中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(k)中所用的所述水溶液包含曲拉通-X100、聚山梨醇酯-80和TNBP。
37.如權(quán)利要求16至36中任一項(xiàng)所述的方法，其中將步驟(k)中的所述溶液維持在介于約18°C與約25°C之間的溫度下。
38.如權(quán)利要求16至37中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(n)的所述納米過(guò)濾器的平均孔徑介于約15nm至約72nm之間。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述納米過(guò)濾器的平均孔徑介于約19nm與約35nm之間。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述納米過(guò)濾器的平均孔徑為約35nm。
41.如權(quán)利要求16至40中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(O)的所述超濾膜的標(biāo)稱切割分子量(NMWCO)為約IOOkDa或更低。
42.如權(quán)利要求16至41中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物的蛋白質(zhì)濃度為約10%(w/v)。
43.如權(quán)利要求16至42中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(h)中形成的所述溶液包含步驟(a)的所述減少冷凍沉淀物的血漿組分中所存在IgG的至少約85%。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中步驟(h)中形成的所述溶液包含步驟(a)的所述減少冷凍沉淀物的血漿組分中所存在IgG的至少約90%。
45.一種水性IgG組合物，其是通過(guò)如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法來(lái)制備。
46.如權(quán)利要求45所述的水性IgG組合物，其中所述組合物包含至少約80克蛋白質(zhì)/升所述組合物。
47.如權(quán)利要求45或46所述的水性IgG組合物，其中所述蛋白質(zhì)的至少95%是IgG。
48.如權(quán)利要求47所述的水性IgG組合物，其中所述蛋白質(zhì)的至少98%是IgG。
49.如權(quán)利要求45至48中任一項(xiàng)所述的水性IgG組合物，其中所述組合物含有少于約35 u g/mL 的 IgA。
50.一種藥物組合物，其包含根據(jù)如權(quán)利要求I至44中任一項(xiàng)所述的方法制備的水性IgG組合物。
51.如權(quán)利要求50所述的藥物組合物，其中所述組合物包含約100克蛋白質(zhì)/升所述組合物。
52.如權(quán)利要求50或51所述的藥物組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包含濃度介于約200mM至約300mM之間的甘氨酸。
53.如權(quán)利要求50至52中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述組合物的pH值介于約4.6與約5. I之間。
54.如權(quán)利要求50至53中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述組合物的摩爾滲透壓濃度介于約 240m0smol/kg 與約 300m0smol/kg 之間。
55.如權(quán)利要求50至54中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述組合物可在室溫下穩(wěn)定至少約9個(gè)月。
56.如權(quán)利要求50至55中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述組合物可在介于約2V與約8°C之間的溫度下穩(wěn)定至少約36個(gè)月。
57.如權(quán)利要求50至56中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述組合物配制成用于靜脈內(nèi)施用。
58.一種治療有需要的人的免疫缺陷、自身免疫病或急性感染的方法，所述方法包括施用如權(quán)利要求50至57中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供制備IVIG產(chǎn)物的改進(jìn)方法。這些方法具有各種優(yōu)點(diǎn)，例如純化期間IgG的損失減少和最終產(chǎn)品的品質(zhì)得到改進(jìn)。在其它方面，本發(fā)明提供適于靜脈內(nèi)、皮下和/或肌肉內(nèi)施用的水性和藥物組合物。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療疾病或病狀的方法，其包括施用本文提供的IgG組合物。
文檔編號(hào)C07K16/00GK102970975SQ201080067929
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2010年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月26日
發(fā)明者L·布魯克施魏格, S·斯瓦托什, J·尼恩貝格爾, W·特施納, H·A·巴特韋克, H-P·施瓦茨, T·貢丁格, B·克爾布爾, R·格勞澤伯格, A·普列夫利亞科維奇 申請(qǐng)人:巴克斯特國(guó)際公司, 巴克斯特保健股份有限公司