專利名稱：一種胸腺肽β₄的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種胸腺肽β 4的分離純化方法。
背景技術(shù)：
胸腺肽是胸腺分泌的具有生物活性的多肽的混和物，是一種免疫增強(qiáng)劑。在機(jī)體的免疫系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)中起到重要的調(diào)節(jié)作用。它能夠改善機(jī)體的免疫狀態(tài)，協(xié)調(diào)內(nèi)分泌，提高機(jī)體對細(xì)菌病毒感染的抵抗力。胸腺肽已經(jīng)用于多種疾病的輔助治療，療效顯著，在飼料中添加亦能起到促生長作用。胸腺肽含有的多種多肽均具有一定的藥效，其中一些已經(jīng)用于疾病的治療。如日達(dá)仙是Clone公司生產(chǎn)的胸腺肽Ci1,臨床用于慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎以及惡性腫瘤等的治療。胸腺肽β 4是從胸腺素5和5A中分離得到的，是胸腺肽β家族中的一員。盡管胸腺肽β 4是從胸腺中分離得到的，但在機(jī)體眾多組織中均有它的蹤跡，在參與調(diào)節(jié)細(xì)胞及生理活動(dòng)等一系列過程中呈現(xiàn)出功能的多樣性，因此自它誕生時(shí)起，就引起了生物醫(yī)學(xué)工作者的廣泛關(guān)注。胸腺肽β4是由43個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，分子量4963，等電點(diǎn)為ρΗ 5. 1，在哺乳動(dòng)物中高度保守。與胸腺肽α原或類胸腺肽不同，胸腺肽β4是胞漿蛋白而非核蛋白。 并且它只含有較少的疏水性氨基酸，不含有Lys-Lys-Xaa-Lys結(jié)構(gòu)區(qū)域。化學(xué)構(gòu)象研究表明，胸腺肽β 4是以單鏈形式存在及發(fā)揮作用的，其第31 43殘基和第18 30殘基間是一內(nèi)部重復(fù)區(qū)域，有6個(gè)氨基酸相同。雖然存在第4 12殘基和第32 40殘基兩個(gè)α螺旋區(qū)，但是胸腺肽β 4沒有β轉(zhuǎn)角形成。研究表明，胸腺肽β 4可以促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合，特別是對于眼角膜受傷有良好的療效。用胸腺肽日4治療創(chuàng)傷是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。研究表明，與生長因子的作用機(jī)理不同，胸腺肽β 4不能促進(jìn)細(xì)胞的生長。胸腺肽β 4通過促進(jìn)血管生長和細(xì)胞的遷移對創(chuàng)傷的愈合起作用，不僅對正常細(xì)胞起作用，且對年老的細(xì)胞起作用，因此在創(chuàng)傷愈合方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。同時(shí)，研究表明胸腺肽日4還可以促進(jìn)頭發(fā)的再生，其作用機(jī)理與促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合相似。T淋巴細(xì)胞在抗腫瘤過程中起到關(guān)鍵性作用。在腫瘤的發(fā)生、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移過程中， 免疫功能特別是細(xì)胞免疫功能降低是其重要因素。在機(jī)體腫瘤狀態(tài)下，T細(xì)胞功能不全和抑制表現(xiàn)為其數(shù)量減少和功能改變以及T細(xì)胞亞群比例失調(diào)。胸腺肽對于胸腺依賴性T淋巴細(xì)胞的成熟和分化起著關(guān)鍵性作用，故可增強(qiáng)腫瘤化療患者細(xì)胞免疫能力，起到輔助治療的作用。最新的研究表明胸腺肽β 4基因的表達(dá)水平與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與腫瘤凋亡關(guān)系密切。因此，可通過對胸腺肽β 4表達(dá)水平的監(jiān)測定位癌細(xì)胞，也可進(jìn)一步研究通過改變胸腺肽β 4的表達(dá)能否抑制腫瘤的生長。目前，對于胸腺肽i34(ThymOSin β 4，T β 4)分離純化的報(bào)道多見于國外文獻(xiàn)，國內(nèi)對于此方面的研究較少，更多是集中于τ β 4生理功能和醫(yī)療功效方面的研究。對于T β 4 分離純化的研究，國外所用方法包括了近年來廣泛用于生化分離的超濾、層析、等點(diǎn)聚焦、高效液相色譜等技術(shù)。如A. Roboti, Ε. Livaniou等采用色譜聚焦的方法，一次分離得到 120mg T^45Ewald Hannappel，F(xiàn)riederike Wartenberg 等采用等電聚焦和制備高效液相的方法，分離得到了 T β 4和T β 9 ；Mahnaz Badamchian等采用制備高效液相進(jìn)行T β 4的分離純化；Allan L. Goldstein等分別采用陰離子或陽離子交換柱進(jìn)行梯度洗脫，分離純化得到T β 3和T β 4并確定了兩者的結(jié)構(gòu)。上述所用方法，多數(shù)采用等電聚焦或高效液相方法，雖然上述方法獲得產(chǎn)品純度較高，但成本高、制備量小，同時(shí)對設(shè)備要求很高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。采用一步離子交換法雖然方法簡單，成本低，但產(chǎn)品的純度達(dá)不到醫(yī)藥應(yīng)用的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種陰陽離子色譜串聯(lián)分離純化胸腺肽β4的方法，解決了傳統(tǒng)方法設(shè)備要求高、不適合工業(yè)化生產(chǎn)的問題。一種胸腺肽β4的分離純化方法，包括將動(dòng)物胸腺置于高氯酸溶液中破碎，離心取上清液，調(diào)節(jié)PH后再次離心取上清液，第一次凍干；將第一凍干粉溶于PH值小于胸腺肽 β 4等電點(diǎn)的第一緩沖液，通過裝填有陽離子交換劑的交換柱，第一次洗脫，收集洗脫液，第二次凍干，將第二凍干粉溶于PH值大于胸腺肽β 4等電點(diǎn)的緩沖液中，通過裝填有陰離子交換劑的交換柱，第二次洗脫，收集洗脫液，脫鹽。所述的動(dòng)物胸腺優(yōu)選為家畜胸腺，所述的上清液ρΗ調(diào)節(jié)至2. O 5. O。所述的高氯酸溶液的濃度優(yōu)選為0. 2 1Μ，最優(yōu)選為0. 41Μ。所述的陽離子交換劑優(yōu)選為美國GE healthcare公司的 CM-sepharoseFastFlow(FF)凝膠，更優(yōu)選的，裝填有陽離子交換劑的交換柱的長度為 30cm，上樣液通過速率為40cm/h。所述的陰離子交換劑優(yōu)選為美國GE healthcare公司的DEAE_s印harose FastFlow(FF)凝膠，更優(yōu)選的，第二凍干粉的濃度為6g/L、上樣液通過速率60cm/h，裝填有 DEAE-s印harose FF凝膠的交換柱長度40cm。所述的第一次洗脫，收集洗脫液包括分別用質(zhì)量體積濃度為1%、4%的NaCl溶液階躍洗脫，收集利用質(zhì)量體積濃度4%的NaCl溶液洗脫獲得的洗脫液。所述的第二次洗脫，收集洗脫液包括分別用蒸餾水、質(zhì)量體積濃度為1%、4%和 5%的NaCl溶液階躍洗脫，收集利用質(zhì)量體積濃度4%的NaCl溶液洗脫獲得的洗脫液。所述的第一緩沖液優(yōu)選為磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，ρΗ值為2. 5 4. 5所述的第二緩沖液優(yōu)選為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，PH值為6. 5-7. 1。所述的脫鹽方法優(yōu)選為凝膠過濾。本發(fā)明將樣品置于高氯酸溶液中破碎離心，上清液經(jīng)陽離子交換色譜和陰離子交換劑色譜純化，得率高，要求設(shè)備簡單，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為實(shí)施例2陽離子交換色譜洗脫曲線；圖2為實(shí)施例3陰離子交換色譜洗脫曲線；圖3為實(shí)施例3純化得到的胸腺β 4聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜；
圖4為實(shí)施例3純化得到的胸腺β 4高效液相色譜圖；圖5為實(shí)施例5流出液中蛋白含量與流速關(guān)系曲線圖；圖6為實(shí)施例5流速為lOOcm/h下柱長與流出液中蛋白含量以及柱壓的關(guān)系曲線圖；圖7為實(shí)施例5流速為40cm/h下柱長與流出液中蛋白含量以及柱壓的關(guān)系曲線圖；圖8為實(shí)施例5梯度洗脫曲線；圖9為實(shí)施例7洗脫液凝膠過濾后濾液吸光度及電導(dǎo)率檢測圖譜。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1提取胸腺五肽(TF5)稱取新鮮的小牛胸腺(杭州四季青生物工程材料有限公司)，按照1 :5(g/ml)的比例加入到事先配好的0.41mol/l的高氯酸溶液中，倒入組織勻漿器進(jìn)行勻漿。將勻漿液在4°C、10000r/min的條件下離心20min，取上清液加入10mol/l的KOH水溶液調(diào)節(jié)pH = 3. O。將調(diào)好的溶液在4°C、10000r/min的條件下離心lOmin，取上清液。實(shí)施例2陽離子交換色譜將上清液放在-20°C冷凍，放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥。凍干粉以5g/L溶于0. 02mol/L、pH4. 20的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，配成上樣液。陽離子交換采用 CM-sepharose FF 凝膠(GE Healthcare, USA)，填裝后柱高為 50cm，直徑為 2. 5cm。上樣液以5BV/h的速度通過陽離子交換柱，上樣量為1L，交換之后用1%、4%的NaCl溶液(w/v) 以150cm/h洗脫，如圖1所示，得到兩個(gè)洗脫峰。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)4% NaCl溶液得到的洗脫峰與標(biāo)準(zhǔn)Τβ4有相同條帶，進(jìn)一步通過HPLC檢測Τβ4(4% (w/v)洗脫液)含量為36.4%。實(shí)施例3陰離子交換色譜收集T β 4所在的洗脫峰，_20°C冷凍后進(jìn)行冷凍干燥。將凍干粉溶于0. 02mol/L、 pH6. 80的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，以2BV/h的速度通過DEAE-s印harose FF (GE Healthcare, USA)陰離子交換柱(Φ 1. 6cmX 50cm)，離子交換之后分別以去離子水、1 %、 4%、5%的NaCl溶液(w/v)以75cm/h洗脫，如圖2所示，得到四個(gè)洗脫峰。經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，確定4% NaCl溶液洗脫峰與標(biāo)準(zhǔn)T β 4具有相同條帶(如圖3所示)，進(jìn)一步通過HPLC檢測得到T β 4 (w/v)洗脫液)的含量為90. 1 % (見圖4)。利用SDS-PAGE電泳法鑒定T β 4由于目前沒有相應(yīng)的酶聯(lián)免疫試劑盒，本發(fā)明根據(jù)T β 4對肌動(dòng)蛋白G與肌動(dòng)蛋白 F動(dòng)力學(xué)平衡的影響檢測胸腺肽日4的活性。由于肌動(dòng)蛋白F是由肌動(dòng)蛋白G聚合而成的二聚體，采用SDS-PAGE會(huì)破壞肌動(dòng)蛋白F的二聚體結(jié)構(gòu)使其解聚，因此采用Native-PAGE 電泳法進(jìn)行活性檢測。1)樣品的處理將肌動(dòng)蛋白G (46 μ Μ)和T β 4 (93 μ Μ)混合，混合后在室溫下反應(yīng) 30分鐘。如果樣品沒有聚合，可加入IOOmM的KCl和2mM的MgCl2,或者增加T β 4的濃度， 同時(shí)增加反應(yīng)的時(shí)間。2)非變性凝膠電泳
a、電泳所用儲(chǔ)液:1. 5M Tris-HCl 緩沖液，ρΗ8· 9 ；0. 5Μ Tris-HCl 緩沖液，ρΗ6· 8 ； 10%過硫酸銨(APS)，實(shí)驗(yàn)時(shí)現(xiàn)配現(xiàn)用；30.(^丙烯酰胺，0.88甲叉雙丙烯酰胺配成IOOmL
溶液，4°C保存；電泳緩沖液(xl)0. 05M Tris 1. 21g，0. 38M 甘氨酸 5. 32g，蒸餾水加到 200ml，調(diào)整PH值到8. 9。樣品緩沖液(x5)甘油5ml，蒸餾水 2. 7ml, 0. 5M Tris-HCl (pH 6. 8)2. 13ml 溴芬蘭 (可視蹤)。染色液50 %甲醇500ml，10 %醋酸IOOml，蒸餾水400ml，0. 25 %考馬斯亮藍(lán) R2502. 5g0脫色液15%甲醇 150ml，10%醋酸 100ml，蒸餾水 750ml。b、電泳凝膠配比分離膠丙烯酰胺10%，1. 5M Tris-HCKpH 8. 9) 7. 0ml，丙烯酰胺儲(chǔ)液9. :3ml，蒸溜水 12. 3ml, 10% APS IOOul，TEMED 23ul。濃縮膠丙烯酰胺3%,0. 5MTris-HCKpH 6. 8)2. 5ml，丙烯酰胺儲(chǔ)液1. 0ml，蒸溜水 6. 4ml，10% APS IOOul，TEMED IOul。將樣品加入樣品緩沖液中時(shí)，最好在0°C加入，不需要加熱。為了保持電泳過程中蛋白質(zhì)的活性，電泳應(yīng)該在4°C或冰凍情況下進(jìn)行，避免電泳過程中由于散熱使蛋白質(zhì)失活。利用高效液相色譜定量檢測T β 4 ·測試前先用30 %的H2A氧化Ih將T β 4氧化成T β 4亞砜。HPLC 方法如下液相色譜儀 Agilent IlOOkries，色譜柱為 YMC-PackPROTEIN-RP 反相蛋白柱，乙腈濃度線性洗脫，其中A 含體積分?jǐn)?shù)0. 三氟乙酸水溶液，B 含體積分?jǐn)?shù) 0. 三氟乙酸乙腈溶液；B體積分?jǐn)?shù)在25min內(nèi)從25%到60% ；流速0. 5mL/min ；紫外檢測，檢測波長220nm實(shí)施例4硫酸銨沉淀取胸腺組織500g，勻漿并離心(10000r/min、20min)，取上清液，加熱到80°C，取上清液并冷卻到6°C，加入-10°C丙酮，收集沉淀，真空抽濾去除丙酮，將沉淀溶解，加入硫酸銨至25% 50%飽和度，得到TF5沉淀。其余分離純化過程同實(shí)施例2和實(shí)施例3，同時(shí)將該方法與實(shí)施例1的提取方法作對比，具體結(jié)果如下表所示
權(quán)利要求
1.一種胸腺肽β 4的分離純化方法，包括將動(dòng)物胸腺置于高氯酸溶液中破碎，離心取上清液，調(diào)節(jié)PH后再次離心取上清液，第一次凍干；將第一凍干粉溶于PH值小于胸腺肽β 4 等電點(diǎn)的第一緩沖液，通過裝填有陽離子交換劑的交換柱，第一次洗脫，收集洗脫液，第二次凍干，將第二凍干粉溶于PH值大于胸腺肽β 4等電點(diǎn)的緩沖液中，通過裝填有陰離子交換劑的交換柱，第二次洗脫，收集洗脫液，脫鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，所述的高氯酸溶液濃度為0.2 1Μ。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，所述的陽離子交換劑為 CM-sepharose FastFlow 凝膠。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離純化方法，其特征在于，所述的第一次洗脫，收集洗脫液包括分別用質(zhì)量體積濃度為1%、4%的NaCl溶液階躍洗脫，收集利用質(zhì)量體積濃度4%的 NaCl溶液洗脫獲得的洗脫液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，所述的陰離子交換劑為 DEAE-sepharose FastFlow 凝膠。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離純化方法，其特征在于，所述的第一次洗脫，收集洗脫液包括分別用蒸餾水、質(zhì)量體積濃度為1%、4%和5%的NaCl溶液階躍洗脫，收集利用質(zhì)量體積濃度4%的NaCl溶液洗脫獲得的洗脫液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，所述的脫鹽方法為凝膠過濾。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，所述的第一緩沖液為PH值達(dá) 2. 5 4. 5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，所述的第二緩沖液為PH值達(dá) 6. 5-7. 1的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種胸腺肽β4的分離純化方法，包括將動(dòng)物胸腺置于高氯酸溶液中破碎，離心取上清液，調(diào)節(jié)pH后再次離心取上清液，第一次凍干；將第一凍干粉溶于pH值小于胸腺肽β4等電點(diǎn)的第一緩沖液，通過裝填有陽離子交換劑的交換柱，第一次洗脫，收集洗脫液，第二次凍干，將第二凍干粉溶于pH值大于胸腺肽β4等電點(diǎn)的緩沖液中，通過裝填有陰離子交換劑的交換柱，第二次洗脫，收集洗脫液，脫鹽。本發(fā)明將樣品置于高氯酸溶液中破碎離心，上清液經(jīng)陽離子交換色譜和陰離子交換劑色譜純化，得率高，要求設(shè)備簡單，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/18GK102167738SQ20111002848
公開日2011年8月31日 申請日期2011年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月26日
發(fā)明者吳綿斌, 張書衍 申請人:浙江大學(xué)