專利名稱：解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種芽孢桿菌抗菌蛋白的分離純化方法。
背景技術(shù)：
抗菌蛋白表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑菌活性，加之抗菌蛋白能夠在細(xì)菌質(zhì)膜上形成離子通道，破壞膜勢，引起胞內(nèi)物質(zhì)泄漏而殺死細(xì)菌，因此不易產(chǎn)生耐藥性和交叉抗性，已成為新型生物農(nóng)藥的主要研究方向。雖然許多生防微生物都能分泌抗菌蛋白，而且蛋白質(zhì)的分離純化方法也已經(jīng)發(fā)展得較為完善，但由于菌株不同，其抗菌蛋白的性質(zhì)迥異，純化方法也各有差異。解淀粉芽孢桿菌TM8 (Bacillus amyloliquefaciens TF28)屬于芽孢桿菌屬， 其保藏編號為CGMCC No.4038，保藏日期為2010年7月沈日。解淀粉芽孢桿菌TM8 已在中國發(fā)明專利申請“防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用”(專利公開號為 CN101948771A，
公開日為2011年01月19日)中公布。解淀粉芽孢桿菌TM8可同時產(chǎn)生抗菌蛋白和脂肽類抗生素兩種抗菌物質(zhì)，但采用現(xiàn)有蛋白質(zhì)的分離純化方法無法獲得高純度的解淀粉芽孢桿菌TM8抗菌蛋白，雜質(zhì)蛋白多，而且抗菌蛋白收率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決現(xiàn)有蛋白質(zhì)的分離純化方法無法獲得高純度的解淀粉芽孢桿菌 TF28抗菌蛋白、雜質(zhì)蛋白多和抗菌蛋白收率低的問題，而提供的一種解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白的分離純化方法。本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白按以下步驟進(jìn)行分離純化一、取解淀粉芽孢桿菌TM8發(fā)酵液的上清液，向上清液中加入固體硫酸銨，至硫酸銨濃度為20%飽和度，然后4°C條件下靜置2h，再以6000r/min的速度離心30min，收集離心上清液，向離心上清液中加入固體硫酸銨，至硫酸銨濃度為40%飽和度，收集沉淀，將沉淀溶解在濃度為0. 02mol/L、pH值為6. 8的磷酸緩沖液中透析并濃縮，得到抗菌蛋白粗提物；二、室溫下用AKTApurifier液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行Q Sepharose Fast Flow陰離子交換層析，載樣緩沖液流速為0. 5mL/min，基線走平后上樣，待流出峰出現(xiàn)且UV-900紫外光檢測值接近基線進(jìn)行階梯式梯度洗脫，收集第二個洗脫峰并超濾濃縮，獲得濃縮蛋白；三、室溫下用AKTApurifier液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行Superdex 75分子篩凝膠過濾層析， 上樣緩沖液流速為0. 4mL/min,基線走平后上樣，收集第一個吸收峰，得到解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白；步驟二中上樣樣品為抗菌蛋白粗提物；步驟二中的載樣緩沖液是PH值為7. 6、 濃度為0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液；步驟二中階梯式梯度洗脫選用pH值為7. 6的 Tris-NaCl緩沖液作為洗脫緩沖液，洗脫緩沖液中Tris濃度為0. 05mol/L，洗脫緩沖液中 NaCl濃度為2mol/L ；步驟二階梯式梯度洗脫分三次進(jìn)行，第一次洗脫載樣緩沖液與洗脫緩沖液的體積比為8 2，第二次洗脫載樣緩沖液與洗脫緩沖液的體積比為6 4，第三次洗脫載樣緩沖液與洗脫緩沖液的體積比為46；步驟三中上樣樣品為濃縮蛋白；步驟三中的上樣緩沖液是含有NaCl、且PH值為 7. 0、濃度為0. 05mol/L的磷酸緩沖液，上樣緩沖液中NaCl的濃度為0. 15mol/L。采用本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白的分離純化方法可以得到高純度的解淀粉芽孢桿菌TM8抗菌蛋白，無雜質(zhì)蛋白，該抗菌蛋白分子量為36. SkDa,對水稻惡苗病菌、黃瓜枯萎病菌、大豆根腐病菌、大豆立枯絲核病菌、大豆菌核病菌和西紅柿灰霉病菌均有高抑菌活性。采用本發(fā)明方法解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白的最終收率為55% 58%。


圖1是具體實施方式
一解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果圖。圖 2是具體實施方式
五步驟二 Q Sepharose Fast Flow陰離子交換層析圖。圖3是具體實施方式
五步驟三Superdex 75分子篩凝膠過濾層析圖。圖4是具體實施方式
五解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白高效液相色譜檢測圖。
具體實施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白按以下步驟進(jìn)行分離純化一、取解淀粉芽孢桿菌TM8發(fā)酵液的上清液，向上清液中加入固體硫酸銨，至硫酸銨濃度為20%飽和度，然后4°C條件下靜置2h，再以6000r/min的速度離心30min，收集離心上清液，向離心上清液中加入固體硫酸銨，至硫酸銨濃度為40%飽和度，收集沉淀，將沉淀溶解在濃度為0. 02mol/L、pH值為6. 8的磷酸緩沖液中透析并濃縮，得到抗菌蛋白粗提物；二、室溫下用AKTApurifier液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行Q Sepharose Fast Flow陰離子交換層析，載樣緩沖液流速為0. 5mL/min，基線走平后上樣，待流出峰出現(xiàn)且UV-900紫外光檢測值接近基線進(jìn)行階梯式梯度洗脫，收集第二個洗脫峰并超濾濃縮，獲得濃縮蛋白；三、室溫下用AKTApurifier液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行Superdex 75分子篩凝膠過濾層析， 上樣緩沖液流速為0. 4mL/min,基線走平后上樣，收集第一個吸收峰，得到解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白；步驟二中上樣樣品為抗菌蛋白粗提物；步驟二中的載樣緩沖液是pH值為7. 6、 濃度為0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液；步驟二中階梯式梯度洗脫選用pH值為7. 6的 Tris-NaCl緩沖液作為洗脫緩沖液，洗脫緩沖液中Tris濃度為0. 05mol/L，洗脫緩沖液中 NaCl濃度為2mol/L ；步驟二階梯式梯度洗脫分三次進(jìn)行，第一次洗脫載樣緩沖液與洗脫緩沖液的體積比為8 2，第二次洗脫載樣緩沖液與洗脫緩沖液的體積比為6 4，第三次洗脫載樣緩沖液與洗脫緩沖液的體積比為46；步驟三中上樣樣品為濃縮蛋白；步驟三中的上樣緩沖液是含有NaCl、且pH值為
47. 0、濃度為0. 05mol/L的磷酸緩沖液，上樣緩沖液中NaCl的濃度為0. 15mol/L。本實施方式用飽和度為20%和40%的硫酸銨進(jìn)行鹽析，在保留解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白活性的前提下，減少了抗菌蛋白粗提物中雜質(zhì)蛋白的種類和數(shù)量。本實施方式步驟二階梯式梯度洗脫分三次進(jìn)行，每次洗脫只出現(xiàn)一個洗脫峰。采用階梯式梯度洗脫能夠避免疊峰的出現(xiàn)，使極性相差不大的蛋白也能徹底分離。解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果如圖1所示，解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白條帶清晰，分子量為36. SkDa0將水稻惡苗病菌、黃瓜枯萎病菌、大豆根腐病菌、大豆立枯絲核病菌、大豆菌核病菌和西紅柿灰霉病菌菌塊分別接種到PDA固體培養(yǎng)基平板中央，然后25°C條件下培養(yǎng)2 3天，菌落半徑達(dá)到1 1. 5cm，再在距離菌落邊緣0. 5cm的位置放入無菌濾紙片，并在無菌濾紙片上加10 μ L本實施方式獲得的解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白(解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白濃度為138. 32 μ g/mL) 25°C培養(yǎng)4 后能夠清楚的觀察到每個PDA固體培養(yǎng)基上明顯的抑菌圈。本實施方式獲得的解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白對水稻惡苗病菌、黃瓜枯萎病菌、大豆根腐病菌、大豆立枯絲核病菌、大豆菌核病菌和西紅柿灰霉病菌的抑菌圈直徑都大于8. 7mm, 說明本實施方式獲得的解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白對水稻惡苗病菌、黃瓜枯萎病菌、大豆根腐病菌、大豆立枯絲核病菌、大豆菌核病菌和西紅柿灰霉病菌這些常見植物病菌均有高抑菌活性。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟二中手動上樣，上樣體積為100yL。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一或二的不同點是步驟三中手動上樣，上樣體積為lOOyL。其它步驟及參數(shù)與實施方式一或二相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一、二或三的不同點是步驟一中發(fā)酵解淀粉芽孢桿菌TM8的液體培養(yǎng)基按8. Og牛肉膏、5. Og酵母膏、10. Og葡萄糖和 IOOOmL水的比例組成，pH值為7. 2。其它步驟及參數(shù)與實施方式一、二或三相同。
具體實施方式
五本實施方式解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白按以下步驟進(jìn)行分離純化一、取解淀粉芽孢桿菌TM8發(fā)酵液的上清液，向上清液中加入固體硫酸銨，至硫酸銨濃度為20%飽和度，然后4°C條件下靜置2h，再以6000r/min的速度離心30min，收集離心上清液，向離心上清液中加入固體硫酸銨，至硫酸銨濃度為40%飽和度，收集沉淀，將沉淀溶解在濃度為0. 02mol/L、pH值為6. 8的磷酸緩沖液中透析并濃縮，得到抗菌蛋白粗提物；二、室溫下用AKTApurifier液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行Q Sepharose Fast Flow陰離子交換層析，載樣緩沖液流速為0. 5mL/min,基線走平后手動上樣，上樣體積為100 μ L，待流出峰出現(xiàn)且UV-900紫外光檢測值接近基線進(jìn)行階梯式梯度洗脫，收集第二個洗脫峰并超濾濃縮，獲得濃縮蛋白；三、室溫下用AKTApurifier液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行Superdex 75分子篩凝膠過濾層析， 上樣緩沖液流速為0. 4mL/min,基線走平后手動上樣，上樣體積為100 μ L，收集第一個吸收峰，得到解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白；步驟二中上樣樣品為抗菌蛋白粗提物；步驟二中的載樣緩沖液是pH值為7. 6、濃度為0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液；步驟二中階梯式梯度洗脫選用pH值為7. 6的 Tris-NaCl緩沖液作為洗脫緩沖液，洗脫緩沖液中Tris濃度為0. 05mol/L，洗脫緩沖液中 NaCl濃度為2mol/L ；步驟二階梯式梯度洗脫分三次進(jìn)行，第一次洗脫載樣緩沖液與洗脫緩沖液的體積比為8 2，第二次洗脫載樣緩沖液與洗脫緩沖液的體積比為6 4，第三次洗脫載樣緩沖液與洗脫緩沖液的體積比為46；步驟三中上樣樣品為濃縮蛋白；步驟三中的上樣緩沖液是含有NaCl、且pH值為 7. 0、濃度為0. 05mol/L的磷酸緩沖液，上樣緩沖液中NaCl的濃度為0. 15mol/L ；步驟一中發(fā)酵解淀粉芽孢桿菌TM8的液體培養(yǎng)基按8. Og牛肉膏、5. Og酵母膏、 10. Og葡萄糖和IOOOmL水的比例組成，pH值為7. 2。本實施方式步驟二 Q Sepharose Fast Flow陰離子交換層析圖譜如圖2所示，圖 2中淺顏色曲線為紫外光檢測值曲線，圖2中深顏色曲線為電導(dǎo)率曲線。本實施方式步驟三Superdex 75分子篩凝膠過濾層析圖譜如圖3所示，圖3中淺顏色曲線為紫外光檢測值曲線。采用高效液相色譜檢測本實施方式所得的到解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白，其結(jié)果如圖4所示，說明本實施方式方法得到的解淀粉芽孢桿菌TM8抗菌蛋白純度高，無雜質(zhì)蛋白。本實施方式中使用蛋白定量試劑盒測定各個步驟的蛋白產(chǎn)量及收率，本實施方式最終收率為55.3%。
權(quán)利要求
1.解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白的分離純化方法，其特征在于解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白按以下步驟進(jìn)行分離純化一、取解淀粉芽孢桿菌TM8(Bacillus amyloliquefaciens TF28)發(fā)酵液的上清液， 向上清液中加入固體硫酸銨，至硫酸銨濃度為20%飽和度，然后4°C條件下靜置2h，再以 6000r/min的速度離心30min，收集離心上清液，向離心上清液中加入固體硫酸銨，至硫酸銨濃度為40%飽和度，收集沉淀，將沉淀溶解在濃度為0. 02mol/L、pH值為6. 8的磷酸緩沖液中透析并濃縮，得到抗菌蛋白粗提物；二、室溫下用AKTApurifier液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行QSepharose Fast Flow陰離子交換層析，載樣緩沖液流速為0. 5mL/min，基線走平后上樣，待流出峰出現(xiàn)且UV-900紫外光檢測值接近基線進(jìn)行階梯式梯度洗脫，收集第二個洗脫峰并超濾濃縮，獲得濃縮蛋白；三、室溫下用AKTApurifier液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行Superdex75分子篩凝膠過濾層析，上樣緩沖液流速為0. 4mL/min，基線走平后上樣，收集第一個吸收峰，得到解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白；步驟二中上樣樣品為抗菌蛋白粗提物；步驟二中的載樣緩沖液是PH值為7. 6、濃度為 0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液；步驟二中階梯式梯度洗脫選用pH值為7. 6的Tris-NaCl 緩沖液作為洗脫緩沖液，洗脫緩沖液中iTris濃度為0. 05mol/L，洗脫緩沖液中NaCl濃度為 2mol/L ；步驟二階梯式梯度洗脫分三次進(jìn)行，第一次洗脫載樣緩沖液與洗脫緩沖液的體積比為8 2，第二次洗脫載樣緩沖液與洗脫緩沖液的體積比為6 4，第三次洗脫載樣緩沖液與洗脫緩沖液的體積比為4 6；步驟三中上樣樣品為濃縮蛋白；步驟三中的上樣緩沖液是含有NaCl、且pH值為7.0、濃度為0. 05mol/L的磷酸緩沖液，上樣緩沖液中NaCl的濃度為0. 15mol/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白的分離純化方法，其特征在于步驟三中手動上樣，上樣體積為100 μ L0
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白的分離純化方法，其特征在于步驟一中發(fā)酵解淀粉芽孢桿菌ΤΜ8的液體培養(yǎng)基按8.0g牛肉膏、5.0g酵母膏、lO.Og葡萄糖和IOOOmL水的比例組成，pH值為7. 2。
全文摘要
解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白的分離純化方法，它涉及一種芽孢桿菌抗菌蛋白的分離純化方法。它解決了現(xiàn)有蛋白質(zhì)的分離純化方法無法獲得高純度的解淀粉芽孢桿菌TF28抗菌蛋白、雜質(zhì)蛋白多和抗菌蛋白收率低的問題。方法一、獲得抗菌蛋白粗提物；二、陰離子交換層析獲得濃縮蛋白；三、分子篩凝膠過濾層析，得到解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白。本發(fā)明用于解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白的分離純化。
文檔編號C07K1/18GK102153618SQ201110028639
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月27日
發(fā)明者孟利強(qiáng), 張云湖, 張淑梅, 李晶, 王玉霞, 趙曉宇 申請人:黑龍江省科學(xué)院微生物研究所