一種制備綿羊mstn基因單克隆抗體疫苗的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種制備綿羊MSTN基因單克隆抗體疫苗的方法：運用生物信息學方法分析并篩選綿羊MSTN基因單克隆抗體所需抗原肽的抗原表位，把這些抗原表位核苷酸序列串聯(lián)組合，克隆并原核表達這些表位組合模式，將獲得的相關(guān)抗原肽分別免疫小鼠，用雜交瘤細胞融合技術(shù)分別制備針對綿羊MSTN基因特異不同組合模式抗原表位的單克隆抗體，篩選并檢測這些細胞株，從而獲得具有較高效價的針對綿羊MSTN基因不同抗原表位的單克隆抗體疫苗。本發(fā)明采用單克隆抗體技術(shù)制備抗綿羊MSTN基因編碼蛋白的單克隆抗體，這種抗體只能特異地與抗原分子上的一個抗原決定簇結(jié)合反應，在培養(yǎng)過程中只要不發(fā)生變異，不同時間內(nèi)分泌的抗體都能保持同樣的結(jié)構(gòu)和功能。本發(fā)明簡便易行，易于推廣，免疫綿羊后可以使綿羊MSTN基因失活，從而使綿羊產(chǎn)生雙肌表型，大大提高單位綿羊的產(chǎn)肉率。
【專利說明】一種制備綿羊MSTN基因單克隆抗體疫苗的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因克隆與原核表達技術(shù)、雜交瘤與單克隆抗體制備技術(shù)。具體地說是運用基因克隆方法制備綿羊MSTN(MSTN:Myostatin，肌生成抑制素)基因單克隆抗體所需抗原肽，再利用小鼠雜交瘤細胞融合技術(shù)制備針對綿羊MSTN基因的單克隆抗體疫苗的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]綿羊MSTN基因是動物骨骼肌生長的負調(diào)控因子，如果MSTN基因失活，能使動物肌肉生長較為發(fā)達，瘦肉率大大提高。如MSTN基因突變、缺失或失活小鼠比野生型小鼠體格大2-3倍。MSTN基因失活的動物生長為雙肌動物，如雙肌牛、雙肌狗等等，該基因的研究近年來受到人們的高度重視。研究人員采用了很多使該基因失活的方法，如基因敲除、基因沉默等技術(shù)，但是這些方法在生產(chǎn)實踐中都難以具體實施。本發(fā)明利用單克隆抗體疫苗的方法使該基因失活，簡便易行，在生產(chǎn)實踐中可以大力推廣，因此具有非常重要的實踐意義。
[0003]現(xiàn)代分子生物學技術(shù)可以有效地實現(xiàn)基因克隆，但基因表達和蛋白純化仍存在困難。例如在大腸桿菌表達系統(tǒng)，不能表達某些基因或表達產(chǎn)物常常形成沒有生物學活性的包涵體，對于一些結(jié)構(gòu)復雜的蛋白質(zhì)或分子量大于lOOkDa的大蛋白，采用現(xiàn)有大腸桿菌表達系統(tǒng)就相對困難，同時又因為每種蛋白質(zhì)分子所帶電荷、分子量及疏水性等方面存在差異，所以會存在表達產(chǎn)物純化較難、純化周期較長和產(chǎn)量較低等缺點。
[0004]綿羊肌生成抑制素，其基因全長約1128bp，編碼約375aa，考慮到這些方面的原因，曾經(jīng)一段時間把研究工作放在基因克隆并表達肌肉抑制素基因的C-末端上，C-末端的保守功能域，基因長約330bp，編碼llOaa，目前大部分實驗室也都克隆并表達出其C-末端，但C-末端并不能包含肌肉抑制素的全部抗原表位，而且C-末端抗原表位不一定是其優(yōu)勢抗原表位。所以如果表達出C-末端蛋白，并用其為免疫原制備單克隆抗體，制備的單克隆抗體還要面臨篩選抗原表位的工作，篩選出的抗原表位不能代表肌肉抑制素的單克隆抗體疫苗，只能是其C-末端單克隆抗體疫苗。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)制備單克隆抗體的實驗室方法中:有化學合成抗原肽或生物合成抗原肽兩種方法:
[0006]采用化學合成抗原肽制備單克隆抗體的方法，存在化學合成抗原生物學活性條件差的缺點，缺乏足夠的免疫原性，很難像蛋白抗原那樣誘導集體的多種免疫反應；此外，還表現(xiàn)在缺乏足夠多的B細胞抗原表位的刺激，一般來說單獨的抗原決定簇的免疫原性較弱，通常要與載體偶聯(lián)，或以融合蛋白的形式進行免疫，以提高免疫原性。
[0007]采用生物合成抗原肽制備單克隆抗體的方法，如:先運用生物信息學預測得出綿羊MSTN編碼抗原多表位的最佳組合模式，以期得到具有生物活性的免疫原，再運用生物合成法合成這些抗原表位的核苷酸序列，并構(gòu)建這些基因表位的原核表達載體，并表達這些表位基因的抗原肽序列。因為所表達的抗原肽大大縮短，所以比較容易表達。并且將制備出的免疫用抗原肽，免疫BALB/c小鼠制備單抗，可以提高免疫原性，減少獲得單克隆抗體后，做抗體特異性檢測篩選等方面的工作量。前期研究獲得單克隆抗體的方法中有連接BSA或KLH載體蛋白的，但之后的特異性檢測試驗要考慮得到的單克隆抗體，是合成的抗原肽的抗體還是蛋白載體的抗體，故不采用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供3種生物合成綿羊MSTNM基因多表位組合模式序列，用基因克隆與原核表達技術(shù)制備這些免疫用抗原肽，并將這些抗原肽免疫小鼠用雜交瘤細胞融合技術(shù)制備針對綿羊MSTN基因的幾種單克隆抗體疫苗的新方法。
[0009]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的:
[0010]運用生物信息學方法分析并篩選綿羊MSTN基因單克隆抗體所需抗原肽的抗原表位，把這些抗原表位核苷酸序列串聯(lián)組合，克隆并原核表達這些表位組合模式，將獲得的相關(guān)抗原肽分別免疫小鼠，用雜交瘤細胞融合技術(shù)分別制備針對綿羊MSTN基因特異不同組合模式抗原表位的單克隆抗體，篩選并檢測這些細胞株，從而獲得具有較高效價的針對綿羊MSTN基因不同抗原表位的單克隆抗體疫苗。
[0011]本發(fā)明依下述方法步驟進行:
[0012]1、利用生物信息學方法分析并篩選綿羊MSTN基因的抗原表位。
[0013]2、將這些抗原表位串聯(lián)成3種組合模式，人工合成這些綿羊MSTN基因抗原表位組合模式。
[0014]3、利用基因克隆與原核表達技術(shù)分別進行這些抗原表位組合模式的克隆與原核表達，利用PCR、酶切、序列測定檢測基因克隆結(jié)果；利用SDS-PAGE技術(shù)檢測原核表達的結(jié)果，檢測結(jié)果表明獲得了序列正確的3種組合模式的抗原肽。
[0015]4、免疫小鼠，并檢測血清抗體效價，在抗體效價達到要求后獲取小鼠脾臟B淋巴細胞。
[0016]5、準備骨髓瘤細胞，并將骨髓瘤細胞與前面制備好的小鼠脾臟B淋巴細胞進行細胞融合。
[0017]6、進行雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)，并檢測雜交瘤細胞的抗體效價。
[0018]7、利用Western Blot技術(shù)檢測抗原的特異性結(jié)合，并用ELISA法檢測單克隆抗體的抗原性。
[0019]8、最后進打單克隆抗體亞型的鑒定。
[0020]本發(fā)明技術(shù)方案帶來的有益效果:
[0021]本發(fā)明采用單克隆抗體技術(shù)制備抗綿羊MSTN基因編碼蛋白的單克隆抗體，這種抗體只能特異地與抗原分子上的一個抗原決定簇結(jié)合反應，抗體成分均一、抗體的結(jié)構(gòu)、氨基酸順序、特異性等都是一致的，且在培養(yǎng)過程中只要不發(fā)生變異，不同時間內(nèi)分泌的抗體都能保持同樣的結(jié)構(gòu)和功能。
[0022]本發(fā)明應用于生產(chǎn)實踐，免疫綿羊后可以使綿羊MSTN基因失活，從而使綿羊產(chǎn)生雙肌表型，大大提高單位綿羊的產(chǎn)肉率。并且利用疫苗免疫的方法，在生產(chǎn)實踐中簡便易行，易于推廣，將有力的促進綿羊養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，給企業(yè)和農(nóng)牧民帶來巨大的經(jīng)濟效益。
[0023]下面結(jié)合附圖和實施例——以綿羊MSTN單克隆抗體疫苗制備為例，對本發(fā)明做進一步說明?！緦＠綀D】

【附圖說明】:
[0024]圖1.本發(fā)明實施例的MSTN單克隆抗體疫苗制備流程圖【具體實施方式】:
[0025]本實施例提供一種運用基因克隆與原核表達方法制備抗原肽，免疫并通過小鼠雜交瘤細胞與單克隆抗體技術(shù)制備針對綿羊MSTN基因不同抗原表位組合模式的單克隆抗體疫苗的具體方法。
[0026]圖1顯示了綿羊MSTN單克隆抗體疫苗的制備流程。
[0027]A.運用生物信息學法分析篩選綿羊MSTN基因B細胞抗原表位。
[0028]下表所不為:綿羊MSTN基因的3種抗原表位組合模式:
[0029]D6494-lhz-2-b QRDDSSDGSL-Linker-DLLAEVQEKP-Linker-PKRSRRDFGL
[0030]D6494-lhz-3-c SEQKENVEKK-Linker-KFSSKIQHNK-Linker-1SKDAIRQLL-Linker-K[0031 ] PMKDGTRYT-Linker-LWRQNNKSSR
[0032]D6494-lhz-4-d RLETAPNISK-Linker-GKIPGMVVDR-Linker-ENGHDLAVTF-Linker-L
[0033]DMNPGTGIff-Linker-TFPEPGEEGL-Linker-HQANPKGSAG-Linker-P
[0034]VKTPTTVFV
[0035]B.串聯(lián)這些表位，并全基因合成并表達其抗原肽。
[0036]1)人工分段合成3個MSTN抗原表位組合模式的核苷酸編碼序列(見A步驟上表組合模式)，分別命名為D6494-lhz-2-b、D6494-lhz-3-c、D6494-lhz-4-d，其大小分別約為100bp、160bp、300bp的小DNA片段。T4多核苷酸酶磷酸化5’末端，得到5’末端帶有BamHI和3’末端帶有EcoR I酶切位點的MSTN多表位免疫原基因。
[0037]2)將這3個MSTN抗原表位序列構(gòu)建到表達載體pET28a上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-D6494-lhz-2-b、pET-28a-D6494-lhz-3_c、pET-28a-D6494-lhz-4_d，進行 PCR 檢測，酶切鑒定，序列測定并分析，結(jié)果表明3個序列的表達載體構(gòu)建正確。
[0038]3)將這3個表達載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中原核表達其蛋白，制作包涵體，超聲破細胞提取包涵體，用Ni親和柱純化這3個重組蛋白，進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果表明成功克隆并表達了所需抗原肽，其抗原肽分子量大小分別約為26kDa、28kDa、32kDa。至此獲得具有生物活性的免疫原，制備出了下面步驟中免疫用的抗原肽。
[0039]C、免疫動物，檢測效價，取其B淋巴細胞。
[0040]1)每個蛋白抗原肽分別與弗氏完全佐劑乳化皮下多點注射雌性BABL/c小鼠，50ug/只，然后每隔兩周后以弗氏不完全佐劑與抗原乳化后皮下注射免疫，直至尾靜脈采血測定抗體效價達到1: 218000，融合前3天空腹加強免疫。
[0041]2)成功免疫BABL/c小鼠，ELISA檢測小鼠血清效價高于32K，可以用于細胞融合實驗。
[0042]D、復蘇骨髓瘤細胞，細胞融合。
[0043]1)骨髓瘤細胞復蘇并擴大培養(yǎng)，備用。
[0044]2)上述免疫后的BABL/c小鼠取脾臟制備細胞懸液，并準備飼養(yǎng)層細胞。
[0045]3)將108脾細胞和107小鼠骨髓瘤細胞進行細胞融合。利用骨髓瘤細胞融合實驗進行細胞融合，每張96孔板的融合率分別為:90.6%、92.7%、82.3%、78.1%、87.5%。將雜交瘤細胞進行傳代培養(yǎng)。
[0046]E、HAT培養(yǎng)基篩選骨髓瘤細胞
[0047]包被前面表達的抗原肽，0.2 μ g/孔，作為一抗，HRP-標記的羊抗鼠IgG為二抗。篩選陽性克隆。
[0048]F、克隆化培養(yǎng) [0049]采用有限稀釋法對鑒定出來的陽性克隆細胞連續(xù)亞克隆，至每株細胞亞克隆陽性率達到100%，將細胞擴大培養(yǎng)后液氮凍存。
[0050]G、單克隆抗體制備
[0051]雜交瘤細胞經(jīng)過兩次檢測篩選和兩次克隆化培養(yǎng)后得到1株抗D6494-lhz-4-d、3株抗D6494-lhz-2-b、2株抗D6494_lhz-3-C單克隆抗體的雜交瘤細胞株。經(jīng)過反復凍存與復蘇后，仍能保持穩(wěn)定的抗體分泌能力。
[0052]H、單克隆抗體的純化與鑒定。
[0053]1)誘生腹水和抗體純化，小鼠腹腔接種已建株的雜交瘤細胞約2X106個，7天后采集腹水，純化并過分子篩柱收集蛋白。
[0054]2)間接ELISA法檢測雜交瘤細胞抗體效價，Western Blot檢測抗原抗體特異性結(jié)合以及間接ELISA法鑒定抗體抗原性。間接ELISA檢測單克隆抗體的腹水血清效價為:1: 128000, Western blot檢測特異性檢測良好。
[0055]3)單克隆抗體亞型鑒定。單克隆抗體亞型鑒定實驗結(jié)果顯示6株雜交瘤細胞分泌的抗體類型為IgG2b。
【權(quán)利要求】
1.一種制備綿羊MSTN基因單克隆抗體疫苗的方法，其特征在于，依下述方法步驟進行:(1) 利用生物信息學方法分析并篩選綿羊MSTN基因的抗原表位；(2)將這些抗原表位串聯(lián)成3種組合模式，人工合成這些綿羊MSTN基因抗原表位組合模式；(3)利用基因克隆與原核表達技術(shù)分別進行這些抗原表位組合模式的克隆與原核表達，利用PCR、酶切、序列測定檢測基因克隆結(jié)果；利用SDS-PAGE技術(shù)檢測原核表達的結(jié)果，檢測結(jié)果表明獲得了序列正確的3種組合模式的抗原肽；(4)免疫小鼠，并檢測血清抗體效價，在抗體效價達到要求后獲取小鼠脾臟B淋巴細胞；(5)準備骨髓瘤細胞，并將骨髓瘤細胞與前面制備好的小鼠脾臟B淋巴細胞進行細胞融合；(6)進行雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)，并檢測雜交瘤細胞的抗體效價；(7)利用WesternBlot技術(shù)檢測抗原的特異性結(jié)合，并用ELISA法檢測單克隆抗體的抗原性；(8)最后，進行單克隆抗體亞型的鑒定。
【文檔編號】C07K16/18GK103626869SQ201210295858
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年8月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月20日
【發(fā)明者】李樹偉 申請人:李樹偉