專利名稱：一種抗cd20單克隆抗體及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥、生物技術(shù)等領(lǐng)域，具體地說是涉及單克隆抗體、抗體人源化等生物技術(shù)及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的一種抗體及其制備方法和用途，更具體地說是涉及一種單克隆抗體及其制備方法和用途，再具體地說是涉及一種用于抗CD20單克隆抗體(簡稱抗CD20單抗)及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
(一)抗⑶20單克隆抗體的研究概況 1、概述腫瘤的死亡率在全世界各種疾病的死亡率居榜首，惡性腫瘤已經(jīng)成為嚴(yán)重影響人類健康和生命的殺手。據(jù)不完全統(tǒng)計，在中國，每年有300余萬新發(fā)惡性腫瘤患者，其中130萬人死于惡性腫瘤。在美國，每年診斷為腫瘤的患者為100萬，死于腫瘤的患者達(dá)54. 7萬，用于腫瘤的治療費用1020億美元。資料顯示，今后10年抗腫瘤生物技術(shù)藥物會急劇增加，2007年美國共有400余種新藥在進(jìn)行抗腫瘤的臨床試驗，其中生物技術(shù)類產(chǎn)品占接近一半，可見，生物技術(shù)類抗腫瘤藥物在腫瘤的防治中具有十分重要的意義。非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin’s Lymphoma,或稱非何杰金氏淋巴瘤,簡稱NHL)是常見惡性血液病之一，且是臨床最常見的淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤，是由B淋巴細(xì)胞(簡稱B細(xì)胞)惡性增長引起的(B細(xì)胞來源約占85%)，好發(fā)于青壯年。近年來，NHL發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重危害著人類健康。本發(fā)明研究的CD20單抗是治療非何杰金氏淋巴瘤的一線藥物，是世界上銷售量最大的抗體之一，2010年全球銷售額達(dá)到66億美元。B淋巴細(xì)胞是體液免疫的起點，大部分的造血惡性腫瘤起源于此。因此，由B細(xì)胞和其對應(yīng)惡性腫瘤表達(dá)的細(xì)胞表面分子是免疫治療的重要靶標(biāo)。MS4A基因家族的B細(xì)胞特異成員⑶20在未成熟和成熟B細(xì)胞以及其對應(yīng)的惡性腫瘤表達(dá)(Tedder and Engel(1994) Immunol. Today 15:450-454)。近年來針對多種惡性腫瘤表面細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物的靶向性治療取得巨大進(jìn)步，應(yīng)用單克隆抗體治療非霍奇金淋巴瘤的臨床結(jié)果取得重大進(jìn)展，使得針對CD20的單克隆抗體治療非霍奇金淋巴瘤成為發(fā)展前景良好的一種新型抗腫瘤方法。2、CD20目前抗CD20單克隆抗體是治療B淋巴瘤的最有效的治療藥物，在治療NHL中有極其重要的地位。⑶20是一種分子量為33 37kD的磷酸化蛋白質(zhì)分子，是B淋巴細(xì)胞非糖基化四重跨膜磷蛋白，位于B淋巴細(xì)胞表面，即B淋巴細(xì)胞表面分化抗原，而在其他組織以及多能B淋巴干細(xì)胞均不表達(dá)。它主要參與調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞的增殖與分化，在免疫系統(tǒng)起重要作用，⑶20從前-B淋巴細(xì)胞階段開始表達(dá)，直到漿細(xì)胞階段才無⑶20表達(dá)(Stashenkop. , Nsdler LM, Hardy R, et al. Characterization of a human B lymphocyte-specificantigen. J.1mmun. 1980 ；125 :1678_1685)。CD20 和抗 CD20 抗體結(jié)合后不發(fā)生內(nèi)吞作用，因而細(xì)胞表面CD20數(shù)量并不因為抗體的結(jié)合而減少，在人體血清中無游離的CD20存在。⑶20抗原高表達(dá)于超過95%的正?；驉夯腂淋巴瘤細(xì)胞，沒有顯著內(nèi)吞和脫落(PressOff,FarrAG,Borroz KI et al.Endocytosis and Degradation of Monoclonal AntibodiesTargeting Human B-CellMalignancies. Cancer Res 1989 ;49 :4906-4912),因此CD20是治療B淋巴細(xì)胞瘤的理想靶點。3、⑶20基因的表達(dá)與調(diào)控⑶20是B細(xì)胞的重要分化抗原，首先在前-B細(xì)胞中表達(dá)。成熟的B細(xì)胞也表達(dá)⑶20，B細(xì)胞激活將產(chǎn)生⑶20的高表達(dá)，激活的扁桃體B細(xì)胞上的⑶20可以被沉降下來，而靜態(tài)的扁桃體B細(xì)胞卻不能，生發(fā)中心B細(xì)胞上的CD20分子也表現(xiàn)為高表達(dá)。熒光分析證實，處于生長進(jìn)化的B細(xì)胞均為⑶20高表達(dá)。B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化時，⑶20的表達(dá)為下降趨勢，⑶20在漿細(xì)胞中不表達(dá)。人⑶20基因為單拷貝基因，位于染色體Ilql2. 13. 1，長16kb，有8個外顯子，其中外顯子I含有轉(zhuǎn)錄的起始位點，外顯子III含有翻譯的起始位點，外顯子VmRNA在剪接時會被剪切下來，外顯子VIII編碼⑶20分子mRNA的3'端非翻譯區(qū)。⑶20分子的mRNA以三種形式存在第一種mRNA長2. 8kb，含有外顯子I到外顯子VIII的完整序列，這種mRNA為主要存在形式；第二種mR2NA由于外顯子I和外顯子III的剪接作用而缺少外顯子II，所以在長度上比前者短263bp ;第三種mRNA長3. 4kb，可能是外顯子I上游的某一段序列參與了外顯子I內(nèi)部的剪接而產(chǎn)生的，這種形式的mRNA較少。⑶20的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，PU.1和Pip是最重要的兩個轉(zhuǎn)錄因子，二者均結(jié)合在⑶20的啟動子區(qū)，只有結(jié)合了 Pip和PU.1的啟動子才具有啟動轉(zhuǎn)錄的功能。CD20的啟動子沒有TATA框，轉(zhuǎn)錄需要一個保守序列——NF2Y結(jié)合位點，約占啟動子的30%。B細(xì)胞分化成為漿細(xì)胞時，CD20 和 PU.1 的水平均下降(St eve Alas 等，Clin CancerRes, 2002，8 (3) :836-845)。⑶20的表達(dá)因淋巴瘤細(xì)胞的不同而有所差異，例如⑶20在慢性B淋巴白血病細(xì)胞中的表達(dá)遠(yuǎn)低于正常的B細(xì)胞和其他B淋巴瘤細(xì)胞，⑶20的表達(dá)高低在一定程度上決定了抗體和補(bǔ)體殺傷瘤細(xì)胞的程度(Perz J等,Leuk Lymphoma, 2002，43 (I) : 149-151 )。細(xì)胞的生長因子能夠調(diào)節(jié)一些瘤細(xì)胞中 CD20 的表達(dá)(Golay J 等，Blood, 2001，98(12) : 3383-3389)。IL24、TNF2 a、GM2CSF上調(diào)慢性B淋巴白血病細(xì)胞的⑶20的表達(dá)，Sivaraman等發(fā)現(xiàn)慢性B淋巴白血病細(xì)胞與500u/ml的IFN2 α作用24小時后，細(xì)胞表面的⑶20分子明顯增加，作用72小時CD20增加的程度低于24小時，這說明這種刺激作用經(jīng)歷一個峰值后將隨著時間的延長而下降。Morikawa等發(fā)現(xiàn)，抗⑶5抗體的加入可以使膜⑶20的數(shù)量下降，這說明⑶5可能也參與了 CD20 表達(dá)的調(diào)節(jié)(Morikawa K 等，Scand J Im munol, 2002，55 (I) :44-52)。亦有研究表明離子射線也可持續(xù)上調(diào)CD20的表達(dá)。4、CD20分子的功能 ⑶20的生理作用至今尚未闡明，根據(jù)⑶20與抗⑶20的抗體結(jié)合后B細(xì)胞產(chǎn)生的一系列的生物學(xué)反應(yīng)，推測CD20可能參與B細(xì)胞的增殖、分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和鈣離子的跨膜傳遞?？笴D20的抗體對B細(xì)胞增殖的影響因抗體種類而異，抗體IF5可刺激B細(xì)胞由GO期進(jìn)入Gl期，而抗體BI抑制B細(xì)胞由Gl期進(jìn)入S/G2+M期?？耿?0的抗體還抑制B細(xì)胞的分化和EB病毒誘導(dǎo)Ig的分泌。CD20的胞內(nèi)區(qū)與酪氨酸蛋白激酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶為非共價結(jié)合，⑶20與抗⑶20結(jié)合將激活這些激酶，誘導(dǎo)PLC Y的磷酸化。同時上調(diào)C2myc和B2myb的mRNA水平，增加⑶18、⑶58和MHCII家族蛋白的表達(dá)。越來越多的證據(jù)表明，CD20是調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞生命與分化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要分子?？笴D20的抗體可直接抑制B細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其凋亡的發(fā)生，該凋亡的發(fā)生與鈣離子相關(guān)。細(xì)胞中鈣離子濃度低時，細(xì)胞沿循細(xì)胞周期生長，CD20與抗體交聯(lián)形成后，在漿膜上形成鈣離子通道，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度增加，抑制B細(xì)胞從Gl期進(jìn)入S/G2+M期，從而引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生(Shan D et al. CancerI mmu no Im munother, 2000，48 (12) : 73-76)。二級抗體(如羊抗人抗體)或表達(dá) FcRI β 細(xì)胞可增強(qiáng)上述B細(xì)胞的凋亡的發(fā)生，該凋亡與細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度增加和PTK及其底物的磷酸化有著密切關(guān)系(Bt ephan M 等，Cancer Res, 2000，60:7170-7176)。實驗證明，CD20與抗CD20抗體及二級抗體的超級結(jié)合能夠啟動并增強(qiáng)PTK信號通路，底物PLC Y的磷酸化程度與CD20的交聯(lián)程度有密切依賴關(guān)系，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲存鈣的釋放使細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度快速增加，同時胱天蛋白酶(caspase)發(fā)生活化。對于耐藥的B細(xì)胞瘤，⑶20與抗⑶20抗體的結(jié)合增加活性氧的爆發(fā)(St eve Alas 等，Clin Cancer Res, 2002，8 (3) :836-845)。以上說明CD20分子本身是一個鈣泵，CD20的激活是調(diào)節(jié)內(nèi)源性鈣離子變化的又一個影響因素，并通過鈣離子變化直接調(diào)節(jié)鈣離子通道活性。
5、抗⑶20單克隆抗體研究進(jìn)展多數(shù)的人B細(xì)胞譜系惡性腫瘤表達(dá)CD20 (Anderson等，Blood, 198463 :1424)。基于抗⑶20嵌合體或放射標(biāo)記單克隆抗體的療法已經(jīng)用于非霍奇金淋巴瘤(Press等，Hematology，2001，221-240 ;Kaminski 等，N. Engl. J. Med. 1993329:459-465)。 臨床研究表明抗CD20單克隆抗體治療hia改善類風(fēng)濕性該關(guān)節(jié)炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜和溶血性貧血以及其他免疫介導(dǎo)的疾病臨床表現(xiàn)(Sliverman等，ArthritisRheum. , 2002, 48:1484-1492;Enwards 等，Rheumatology,2001, 40:1-7)。應(yīng)用競爭性假設(shè)解釋抗⑶20單克隆抗體的體內(nèi)(in vivo)治療效果。在一個模型中，⑶20作為膜整合的靶標(biāo)用于通過天然免疫系統(tǒng)的活化或效應(yīng)子機(jī)制的啟動產(chǎn)生單克隆抗體介導(dǎo)的 B 細(xì)胞消除(Reff 等,Blood, 1994, 83:435-445;Maloney 等 Blood, 1998,90 2188-2195;Maloney 等，J. Clin. Oncol. 1997，15:3266-3274)。目前，經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市用于治療NHL的抗CD20的單抗有Rituximab、Zevalin,Bexxar等，Rituximab (利妥昔單抗，商品名美羅華；后簡稱美羅華)是第一個是上市的抗CD20的單克隆抗體類藥物，是一種嵌合體人IgGl抗人CD20單克隆抗體，能高效誘導(dǎo)補(bǔ)體(C)激活的經(jīng)典途徑和對新鮮分離的淋巴瘤細(xì)胞和B細(xì)胞系的補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(Reff等，Blood, 1994，83 :435-445 ；Golay 等，Blood, 98 :3383-3389 ；Cragg 等 Blood, 2003，101 1045-1052 ；Di Gaetano 等 J.1mmunl. 2003, 171:1581-1587;Bellosillo 等，Blood, 2001,98:2771-2777)。美羅華還在病人(van der Klok 等，Br. J. Hematol. 2001，115:807-811)和靈長類(Kennedy等，Blood，2003，101 :1071-1079)體內(nèi)激活補(bǔ)體。此外，包括CD59在內(nèi)的補(bǔ)體調(diào)解蛋白的腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)和抗⑶20治療的抗性相關(guān)(Golay等，Blood, 98 3383-3389 ;Treon 等 J.1mmunotheraphy，200124:263-271 )。雖然許多人認(rèn)為補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性是美羅華在體外(i η V i tr ο )和體內(nèi)消除人淋巴瘤細(xì)胞中所使用的主要用途(Go I ay等，Blood, 98 :3383-3389 ;Cragg 等 Blood，2003，101 :1045-1052 ；Di Gaetano 等 J.1mmunl 2003，171:1581-1587;Golay 等，Blood, 95 :3900-3908 ；Di Gaetano 等 J. Hematol. 2001，I14:800-809;Weiner Blood 2003,101 :788)，但是其他人發(fā)現(xiàn)，根據(jù)腫瘤細(xì)胞對補(bǔ)體介導(dǎo)裂解的易感性以及補(bǔ)體抑制劑CD46、CD55和CD59在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)不能預(yù)測美羅華的治療效果(Weng和Levy，Blood，2001，98 :1352_1357)。因為與臨床使用的同種型不同的嵌合體抗⑶20單克隆抗體不能在非人或靈長類中消除正常的B細(xì)胞(Anderson等，Biochem.Soc. Transac.，1997，25 =705-708),并且抗CD20單克隆抗體的抗腫瘤效應(yīng)部分地依賴通過IgG 的 Fe 受體(FcyR)的免疫激活(Clynes 等，Nature Med. ,2000,6 :443-446),所以其他的抗體依賴作用也是重要的。此外，抗⑶20單克隆抗體處理改變了跨膜Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)和B細(xì)胞功能，這些擾亂了細(xì)胞周期進(jìn)程(Tedder和Engel, Immunol. Today, 1994, 15:450-454)并且能夠誘導(dǎo)B細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡(Shan等，Blood, 1998，91 :1644_1652)。單獨使用美羅華治療復(fù)發(fā)以及難治的非霍奇金淋巴瘤有效率達(dá)50%左右，若與化療藥物聯(lián)用，則有效率可達(dá)909^100%。同時，美羅華會帶來一系列的不良反應(yīng)，諸如脫發(fā)、惡心、嘔吐、血細(xì)胞減少等，且有輕微的發(fā)熱、寒顫等。但美羅華仍由其在治療非霍奇金淋巴瘤上表現(xiàn)的良好療效和低毒副作用，已成為美國銷售額最大的抗腫瘤藥物之一，2008年銷售額近30億，年增長率14%。但這些藥物治療費用較高，致使中國很多患者難以接受治療。因此，研究療效好、治療成本低的藥物對提高非霍奇金淋巴瘤患者的生活質(zhì)量具有重大意義。此外，研發(fā)對人免疫原性更小，表達(dá)量更高，以及具有其他優(yōu)良特性的抗CD20單克隆抗體或多克隆抗體， 更成為目前的研究重點。(二)真核細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)自20世紀(jì)70年代基因工程技術(shù)誕生以來，基因表達(dá)技術(shù)已滲透到生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域。并隨著人類基因組計劃實施的進(jìn)行，在技術(shù)方法上得到了很大發(fā)展，時至今日已取得令人矚目的成就。隨著人類基因組計劃的完成，越來越多的基因被發(fā)現(xiàn)，其中多數(shù)基因功能不明。利用表達(dá)系統(tǒng)在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。在各種表達(dá)系統(tǒng)中，最早被采用進(jìn)行研究的是原核表達(dá)系統(tǒng)，這也是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。該項技術(shù)的主要方法是將已克隆入目的基因DNA段的載體(一般為質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化細(xì)菌(通常選用的是大腸桿菌)，通過IPTG誘導(dǎo)并最終純化獲得所需的目的蛋白。其優(yōu)點在于能夠在較短時間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物，而且所需的成本相對比較低廉。但與此同時原核表達(dá)系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點如通常使用的表達(dá)系統(tǒng)無法對表達(dá)時間及表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，有些基因的持續(xù)表達(dá)可能會對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，過量表達(dá)可能導(dǎo)致非生理反應(yīng)，目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難；而且原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低。為克服上述不足，許多學(xué)者將原核基因調(diào)控系統(tǒng)引入真核基因調(diào)控領(lǐng)域，其優(yōu)點是a)根據(jù)原核生物蛋白與靶DNA間作用的高度特異性設(shè)計，而靶DNA與真核基因調(diào)控序列基本無同源性，故不存在基因的非特異性激活或抑制；b)能誘導(dǎo)基因高效表達(dá)，可達(dá)105倍，為其他系統(tǒng)所不及；c)能嚴(yán)格調(diào)控基因表達(dá)，即不僅可控制基因表達(dá)的“開關(guān)”，還可人為地調(diào)控基因
表達(dá)量。因此，利用真核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)目的蛋白越來越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。1、酵母表達(dá)系統(tǒng)
最早應(yīng)用于基因工程的酵母是釀酒酵母，后來人們又相繼開發(fā)了裂殖酵母、克魯維酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha,Candida Bodini,Pichia Pastris3種。以Pichia Pastoris應(yīng)用最多。甲醇酵母的表達(dá)載體為整合型質(zhì)粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中。大部分甲醇酵母的表達(dá)載體中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因-1 (簡稱A0xl)，在該基因的啟動子(簡稱PAX0I)作用下，外源基因得以表達(dá)。PAXOI是一個強(qiáng)啟動子，在以葡萄糖或甘油為碳源時。甲醇酵母中AOxl基因的表達(dá)受到抑制，而在以甲醇為唯一碳源時PAXOI可被誘導(dǎo)激活，因而外源基因可在其控制下表達(dá)，將目的基因多拷貝整合入酵母染色體后可以提高外源蛋白的表達(dá)水平及產(chǎn)量。此外甲醇酵母的表達(dá)載體都為E. coli/Pichia Pastoris的穿梭載體，其中含有E. coli復(fù)制起點和篩選標(biāo)志,可在獲得克隆后采用E. coli細(xì)胞大量擴(kuò)增.目前，將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入酵母菌的方法主要有原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電擊法及氯化鋰法等。甲醇酵母一般先在含甘油的培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)至高·濃度。再以甲醇為碳源。誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白。這樣可以大大提高表達(dá)產(chǎn)量。利用甲醇酵母表達(dá)外源性蛋白質(zhì)其產(chǎn)量往往可達(dá)克級。與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動物細(xì)胞，不會發(fā)生超糖基化。利用PAXOI表達(dá)外源蛋白時，一般需很長時間才能達(dá)到峰值水平，而甲醇是高毒性、高危險性化工產(chǎn)品。使得實驗操作過程中存在不小的危害性。且不宜于食品等蛋白生產(chǎn)。因此那些不需要甲醇誘導(dǎo)的啟動子受到青睞包括GAP、FLD1、PEX8、YPTI等多種。利用三磷酸甘油醛脫氫酶(簡稱GAP)啟動子代替PAX0I，不需要甲醇誘導(dǎo)。培養(yǎng)過程中無需更換碳源，操作更為簡便，可縮短外源蛋白到達(dá)峰值水平的時間。酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種后起的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，由于兼具原核以及真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點，正在基因工程領(lǐng)域中得到日益廣泛的應(yīng)用。2、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)通常采用目宿銀紋夜蛾桿狀病毒(簡稱=AcNPV)作為表達(dá)載體。在AcNPV感染昆蟲細(xì)胞的后期，核多角體基因可編碼產(chǎn)生多角體蛋白，該蛋白包裹病毒顆粒可形成包涵體。核多角體基因啟動子具有極強(qiáng)的啟動蛋白表達(dá)能力，故常被用來構(gòu)建桿狀病毒傳遞質(zhì)粒?？寺∪胪庠椿虻膫鬟f質(zhì)粒與野生型AcNPV共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞后可發(fā)生同源重組，重組后多角體基因被破壞，因而在感染細(xì)胞中不能形成包涵體，利用這一特點可挑選出含重組桿狀病毒的昆蟲細(xì)胞但效率比較低，且載體構(gòu)建時間長，一般需要4 6周。此外，昆蟲細(xì)胞不能表達(dá)帶有完整N聯(lián)聚糖的真核糖蛋白。在病毒感染晚期，由于大量外源蛋白的表達(dá)引起昆蟲細(xì)胞的裂解，胞質(zhì)內(nèi)的物質(zhì)釋放出來，與目的蛋白混在一起，從而使蛋白的純化工作變得很困難，另外水解酶的釋放會降解重組蛋白。為了克服以上這些困難，科學(xué)工作者先后嘗試用絲蛾肌動蛋白基因啟動子或桿狀病毒ie-Ι基因啟動子表達(dá)外源蛋白，但效果都不明顯。Farrel等(Farrel等，Biotech, and Bioeng. ,1998,60 (6) :656-663)介紹了一種新型的鱗翅目昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要包括3個調(diào)節(jié)外源蛋白表達(dá)序列(l)Bombyx mori的肌動蛋白基因啟動子；(2)Bombyx mori的核型多角體病毒(BmNPV)的立早基因ie_l (編碼俄IE-1蛋白，該蛋白是種轉(zhuǎn)錄激活因子，可在體外激活肌動蛋白基因啟動子)；(3) BmNPV的同源重復(fù)序列3 (HR3)可作為肌動蛋白基因啟動子的增強(qiáng)子。三者協(xié)同作用，可使轉(zhuǎn)錄活性提高1000倍以上，從而大大地提高外源蛋白的表達(dá)水平。另外目前還有一種新型的宿主范圍廣的雜合核多角體病毒(HyNPV)被應(yīng)用于昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建，該病毒由AcNPV及Bni’ qP發(fā)展而來。一般情況下桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)所能表達(dá)的外源蛋白只有少部分是分泌性的，大部分為非分泌性。為了解決這個問題將Hsp70 (熱休克蛋白70)與外源蛋白共表達(dá)可明顯提高重組蛋白的分泌水平，這是因為分泌性多肽被翻譯后必須到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行加工才能被分泌至胞外。如果到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)前，前體多肽就伸展開來，暴露出疏水殘基，殘基間的相互作用可引起多肽的凝聚，這對最終的表達(dá)水平有很大影響。而Hsp70是一種分子伴侶，能夠與新翻譯的多肽結(jié)合，抑制前體肽的凝聚使前體肽順利到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行加工，從而提高蛋白的分泌水平。 最近，人們又構(gòu)建了桿狀病毒-S2表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能將重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞，以前人們認(rèn)為桿狀病毒僅能在鱗翅目昆蟲細(xì)胞(如sf9、sf21)中復(fù)制，不能在其他昆蟲細(xì)胞(如果蠅細(xì)胞)中復(fù)制，然而目前研究表明在一定條件下，桿狀病毒也能感染果蠅細(xì)胞。在果蠅細(xì)胞中，桿狀病毒的多角體基因啟動子幾乎不發(fā)生作用。桿狀病毒-S2表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體利用的是果蠅啟動子如Hsp70啟動子、肌動蛋白5C啟動子、金屬硫蛋白基因啟動子等，其中，Hsp70啟動子的作用最強(qiáng)。重組桿狀病毒感染S2細(xì)胞后不會引起宿主細(xì)胞的裂解，且蛋白表達(dá)水平與鱗翅目細(xì)胞相似，因此，桿狀病毒-S2系統(tǒng)是一個很有應(yīng)用前景的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，特別是桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)由于其操作安全，表達(dá)量高，目前與酵母表達(dá)系統(tǒng)一樣被廣泛應(yīng)用于基因工程的各個領(lǐng)域中。3、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)由哺乳動物細(xì)胞翻譯后再加工修飾產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)，在活性方面遠(yuǎn)勝于原核表達(dá)系統(tǒng)及酵母、昆蟲細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)，更接近于天然蛋白質(zhì)。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體包含原核序列、啟動子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記基因、終止子和多聚核苷酸信號等。將外源基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞主要通過2類方法一是感染性病毒顆粒感染宿主細(xì)胞，二是通過脂質(zhì)體法、顯微注射法、磷酸鈣共沉淀法及DEAE —葡聚糖法等非病毒載體的方式將基因?qū)氲郊?xì)胞中。外源基因的體外表達(dá)一般采用質(zhì)粒表達(dá)載體，如將重組質(zhì)粒導(dǎo)入CHO細(xì)胞可建立高效穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)，而利用COS細(xì)胞可建立瞬時表達(dá)系統(tǒng)。目前，病毒載體已成為動物體內(nèi)表達(dá)外源基因的有力工具，在臨床基因治療的探索中也發(fā)揮了重要作用。痘苗病毒由于其基因的分子量相當(dāng)大(約187kb)，利用它作為載體可同時插入幾種外源基因，從而構(gòu)建多價疫苗。另外，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染效率高，某些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系也可通過其導(dǎo)入外源基因，但要注意的是逆轉(zhuǎn)錄病毒可整合入宿主細(xì)胞染色體，具有潛在的危險性。由于腺病毒易于培養(yǎng)、純化，宿主范圍廣，故采用該類病毒構(gòu)建的載體被廣泛應(yīng)用腺病毒載體的構(gòu)建依賴于腺病毒穿梭質(zhì)粒和包裝載體之間的同源重組。但是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的這種同源重組效率很低，利用細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建重組體效率會大大提高，即將外源基因插入到腺病毒穿梭質(zhì)粒中，形成轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，將其線性化后與腺病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸埃希菌。另一種方法是通過CrelaxP系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒載體，在轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒中都插入IaxP位點，然后將兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染表達(dá)Cre重組酶的哺乳動物細(xì)胞，通過Cre介導(dǎo)兩個IaxP位點之間的DNA發(fā)生重組，可獲得重組腺病毒，這種重組效率比一般的細(xì)胞內(nèi)同源效率高30倍。最近，人們在桿狀病毒中插入巨細(xì)胞病毒的啟動子建立了高效的基因轉(zhuǎn)移載體。由于桿狀病毒是昆蟲病毒，在哺乳動物細(xì)胞中不會引起病毒基因的表達(dá)，而且載體的構(gòu)建容易，因而利用桿狀病毒進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移為發(fā)明人提供了很好的途徑。利用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)外源基因時，大多數(shù)情況下不需要誘導(dǎo)，但當(dāng)表達(dá)產(chǎn)物對細(xì)胞有毒性時應(yīng)采取誘導(dǎo)，這樣可避免表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生早期就對細(xì)胞產(chǎn)生影響。哺乳動物細(xì)胞中用到的誘導(dǎo)型載體主要與啟動子有關(guān)如熱休克蛋白啟動子可在高溫下被誘導(dǎo)，還有重金屬、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的啟動子。但這些系統(tǒng)存在一些共同的缺陷，如誘導(dǎo)表達(dá)特異性差；當(dāng)系統(tǒng)處于關(guān)閉狀態(tài)時表達(dá)有泄漏誘導(dǎo)劑本身有毒性，常對細(xì)胞造成損傷等。為此，Gossen等構(gòu)建了受四環(huán)素負(fù)調(diào)節(jié)的Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)由調(diào)節(jié)質(zhì)粒和反應(yīng)質(zhì)粒組成。調(diào)節(jié)質(zhì)粒中具有編碼轉(zhuǎn)錄激活因子(簡稱fIA)的序列，在沒有四環(huán)素或強(qiáng)力毒素存在的情況下tTA可引起下游目的基因表達(dá)。隨后Gossen等又對tTA的氨基酸序列進(jìn)行了改造，構(gòu)建了受四環(huán)素正調(diào)節(jié)的Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)在沒有四 環(huán)素的情況下啟動子不被激活，而在加入四環(huán)素或強(qiáng)力毒素后目的基因高效表達(dá)(Gossen等，Science, 1995,268 (5218) :1766-1769 ;Gossen 等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 1992,89
(12):5547-5551)。四環(huán)素誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的哺乳動物細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有嚴(yán)密、高效可控制性強(qiáng)的優(yōu)點。外源蛋白的表達(dá)會對哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，因此利用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)外源基因時，一個主要問題便是外源基因不能持久穩(wěn)定地表達(dá)。Mielke等(Mielke等，Gene,2000,254 (1-2) :1_8)構(gòu)建了一種能夠在哺乳動物中穩(wěn)定表達(dá)異二聚體蛋白的載體系統(tǒng)，在這個系統(tǒng)中，編碼抗體重鏈和輕鏈的cDNA及嘌呤霉素抗性基因被轉(zhuǎn)錄成三順反子mRNA。內(nèi)部的順反子通過內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(簡稱=IREs)介導(dǎo)進(jìn)行翻譯，通過持續(xù)選擇壓力，無需繁瑣的篩選過程，便可獲得持久、穩(wěn)定表達(dá)抗體分子的重組體。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)常用的宿主細(xì)胞有CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3等，不同的宿主細(xì)胞對蛋白表達(dá)水平和蛋白質(zhì)的糖基化有不同的影響，因此在選擇宿主細(xì)胞時應(yīng)根據(jù)具體情況而定。利用基因工程技術(shù)表達(dá)外源蛋白。其產(chǎn)量還不高，難以滿足大規(guī)模的實際應(yīng)用。通過轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)可從動物的乳汁或植物的葉組織中很方便地獲得大量較純的生物活性物質(zhì)，但目前這項技術(shù)還不很成熟，有待進(jìn)一步研究。由哺乳動物細(xì)胞翻譯后再加工修飾產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)，在活性方面遠(yuǎn)勝于原核表達(dá)系統(tǒng)及酵母、昆蟲細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)(Mielke等，Gene，2000，254 (1-2): 1-8)。VanderGeld等利用不同的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了蛋白激酶(簡稱PR30)，并對它們的抗原性進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的PR3具有與抗PR3抗體結(jié)合的所有表位，在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的PR3具有大部分表位，而在甲醇酵母中表達(dá)的PR3只具有少數(shù)幾個表位(VanderGeld 等，J.1mmunol. Meth.，2000，244 (1-2) :117_132)。哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)更接近于天然蛋白質(zhì)，但其表達(dá)量低、操作繁瑣。因此，研發(fā)一種表達(dá)量更高，操作簡便的哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，具有巨大的應(yīng)用空間；并且可以提供成本更低的基因工程類藥物，具有巨大的社會意義和經(jīng)濟(jì)價值。(三)哺乳動物細(xì)胞無血清培養(yǎng)基1、細(xì)胞培養(yǎng)基概述及優(yōu)缺點分析
細(xì)胞培養(yǎng)基是細(xì)胞體外培養(yǎng)的最重要因素。無血清培養(yǎng)基是繼天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基之后的第三類培養(yǎng)基。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)基相比，無血清培養(yǎng)基是一種不含有動物血清或其他生物提取液，但仍可以維持細(xì)胞在體外較長時間生長、繁殖的一種培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基由于其組成成分相對清楚，制備過程簡單，在現(xiàn)代生物技術(shù)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。無血清培養(yǎng)技術(shù)也是闡明細(xì)胞生長、增殖、分化及基因表達(dá)調(diào)控的基礎(chǔ)研究問題的有力工具。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加相應(yīng)量的血清或組織提取物，其中最常用于培養(yǎng)基的血清是一種組分很不明確的混合物。所以常規(guī)血清細(xì)胞培養(yǎng)基存在以下缺點(I)血清來自于動物體，其對細(xì)胞在體外培養(yǎng)時的主要作用是提供生長因子、激素、結(jié)合蛋白，并提供保護(hù)作用，但同時也有細(xì)胞生長抑制因子和毒性因子，所以存在潛在
毒性。 (2)由于動物血清提取的局限，使其應(yīng)用于培養(yǎng)基的價格格外昂貴。(3)動物血清提取的局限，也給細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化帶來困難，同時也存在細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)產(chǎn)品分離純化難的問題，具有潛在的細(xì)胞毒性作用，給規(guī)?；囵B(yǎng)細(xì)胞增加了難度(Even M S，Sandusky C B, Barnard N D. Serum free hydridomaculture : ethical, scientific and safety considerations[J] . TrendsinBiotechnology,2006, 24(3):105-108.)。由于上述常規(guī)血清細(xì)胞培養(yǎng)基存在的諸多問題，促使發(fā)明人改進(jìn)培養(yǎng)方法，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基來替代。細(xì)胞工程中無血清培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用，在很大程度上可以避免含血清培養(yǎng)所帶來的不利。無血清培養(yǎng)基具有以下明顯的優(yōu)缺點無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點①可避免血清批次間的質(zhì)量變動，提高細(xì)胞培養(yǎng)和實驗結(jié)果的重復(fù)性。②避免血清對細(xì)胞的毒性作用和血清源性污染。③避免血清組分對實驗研究的影響。④有利于體外培養(yǎng)細(xì)胞的分化。⑤可提高產(chǎn)品的表達(dá)水平并使細(xì)胞產(chǎn)品易于純化。缺點①細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中易受某些機(jī)械因素和化學(xué)因素的影響，培養(yǎng)基的保存和應(yīng)用不如傳統(tǒng)的合成培養(yǎng)基方便。②成本較高。③針對性很強(qiáng)，一種無血清培養(yǎng)基僅適合某一類細(xì)胞的培養(yǎng)。2、無血清培養(yǎng)基的發(fā)展概述從1975年垂體細(xì)胞株Gh3在無血清介質(zhì)中生長獲得成功到現(xiàn)在，無血清培養(yǎng)基的發(fā)展大致經(jīng)歷了 3代。第I代無血清培養(yǎng)基不含血清，但含有大量成分不明確的動、植物蛋白。因此，其不利于目標(biāo)蛋白的分離純化，成本也較高。第2代無血清培養(yǎng)基是基于生產(chǎn)重組藥物的安全考慮而開發(fā)的，其主要特點是完全不用動物來源蛋白，稱之為無血清，無動物衍生蛋白培養(yǎng)基。它的優(yōu)點是既可降低生產(chǎn)成本，又能加快報批的速度。
由于生物工程的要求，第3代無血清培養(yǎng)基近年已出現(xiàn)，即完全沒有蛋白或含量極低，組成成分全為化學(xué)已知物的培養(yǎng)基，稱之為雙無培養(yǎng)基。其優(yōu)點在于細(xì)胞培養(yǎng)與生產(chǎn)很容易做到恒定，目標(biāo)蛋白的分離純化更為容易，細(xì)胞培養(yǎng)基的原材料成本大為下降，生產(chǎn)中品質(zhì)管理更加容易。但其對培養(yǎng)的細(xì)胞具有很高的特異性。目前預(yù)測第4代無血清培養(yǎng)基將會進(jìn)入研究與開發(fā)，這將是一種無血清、無蛋白、又可以高溫消毒的適合于許多種不同細(xì)胞生長的全能型培養(yǎng)基。小結(jié)可見表I (陳峰，無血清培養(yǎng)基的主要補(bǔ)充印子及研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué)，2006，18 (4):10-13)。由上可知，第四代培養(yǎng)基的研制開發(fā)并投入市場將成為發(fā)展趨勢。表1、無血清培養(yǎng)基的發(fā)展過程
權(quán)利要求
1.一種抗CD20單克隆抗體，其特征在于，所述的該抗CD20單克隆抗體是按照以下方法制備得到的 (O構(gòu)建一個獨特的PMED高效哺乳動物細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)； (2)建立一個懸浮細(xì)胞、無血清培養(yǎng)馴化體系，通過轉(zhuǎn)染將⑶20單抗基因整合到CHO細(xì)胞的基因組中，通過逐步增加MTX的濃度使整合在細(xì)胞內(nèi)的目的蛋白基因拷貝數(shù)大量擴(kuò)增，篩選CHO細(xì)胞亞克隆，獲得高表達(dá)工程細(xì)胞株，并建立三級種子細(xì)胞庫； (3)建立適合哺乳動物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，使用該無血清CD培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO工程細(xì)胞株； (4)建立哺乳動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)及蛋白純化體系，利用哺乳動物細(xì)胞大規(guī)模發(fā)酵及純化平臺，獲得外源蛋白的大規(guī)模表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗CD20單克隆抗體，其特征在于，所述的該抗CD20單克隆抗體的有關(guān)測定情況如下 (1)N端氨基酸序列測定 測序結(jié)果為 Leu-Pro-Ala-Gln-Val-Ala-Phe-Thr-Pro-Tyr-Ala-Pro-Glu-Pro-Gly，該結(jié)果與文獻(xiàn)報道的美羅華一致； (2)C端搭配序列測定 測序結(jié)果為 Lys-Gly-Pro-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Thr-Tyr-His-Asn-His,該結(jié)果與文獻(xiàn)報道的美羅華一致； (3)肽圖分析 肽譜與對照品美羅華一致； (4)分子量測定 測得的分子量還原型介于6317KD，非還原型約為150KD，與對照品及文獻(xiàn)報道的美羅華一致； (5)等電點測定 測得的等電點分布在4. 8±0. 5內(nèi)，與對照品及文獻(xiàn)報道的美羅華一致。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗CD20單克隆抗體，其特征在于，所述的CHO工程細(xì)胞株是中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO DG44。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗CD20單克隆抗體，其特征在于，所述的無血清培養(yǎng)基是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充因子構(gòu)成； 所述的補(bǔ)充因子由無機(jī)鹽類、氨基酸、維生素、其他物質(zhì)組成，其含量分別為O.ΟΟΓΟ. 9%、0· ΟΟΓΟ. 035%、O. ΟΟΓΟ. 06%、O. 00Γ0. 4%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗CD20單克隆抗體，其特征在于，所述的無機(jī)鹽類是包括無水氯化鈣、七水硫酸亞鐵、氯化鉀、氯化鎂、無水硫酸鎂、氯化鈉、無水磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉或七水硫酸鋅中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗CD20單克隆抗體，其特征在于，所述的氨基酸是包括L-精氨酸鹽酸鹽、L-胱氨酸鹽酸鹽、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-組氨酸鹽酸鹽、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸鹽酸鹽、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨酸、L-天門冬酰胺、L-天門冬氨酸、L-半胱氨酸鹽酸鹽、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸或L-纈氨酸中的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗CD20單克隆抗體，其特征在于，所述的維生素是包括硫辛酸、維生素H、D-泛酸鈣、氯化膽堿、葉酸、i_肌醇、煙酰胺、鹽酸吡哆醛、鹽酸吡哆醇、核黃素、鹽酸硫胺或維生素B12中的一種或多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗CD20單克隆抗體，其特征在于，所述的其他物質(zhì)是包括D-葡萄糖、次黃嘌呤、酚紅或胸苷等中的一種或多種。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗CD20單克隆抗體，其特征在于，所述的無血清培養(yǎng)基用于培養(yǎng)CHO細(xì)胞，具體步驟包括 (1)在本發(fā)明所述的無血清培養(yǎng)基中接種CHO細(xì)胞； (2)在適合生長的條件下培養(yǎng)CHO細(xì)胞一段時間。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗CD20單克隆抗體，其特征在于，所述的適合生長的條件是37±2°C, 5± 1% 二氧化碳,所述的一段時間是1-3周。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗CD20單克隆抗體用于制備抗CD20產(chǎn)品。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的抗CD20產(chǎn)品是一種直接用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究B細(xì)胞相關(guān)的惡性疾病及其直接相關(guān)疾病的產(chǎn)品。
13.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗CD20單克隆抗體的組合物用于制備抗CD20產(chǎn)品。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的抗CD20產(chǎn)品是一種直接用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究B細(xì)胞相關(guān)的惡性疾病及其直接相關(guān)疾病的產(chǎn)品。
15.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗CD20單克隆抗體用于制備抗非霍奇金淋巴瘤產(chǎn)品。
16.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗CD20單克隆抗體的組合物用于制備抗非霍奇金淋巴瘤產(chǎn)品。
17.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗CD20單克隆抗體用于制備治療自身性免疫病的藥物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的自身性免疫病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、特發(fā)性血小板減少紫癜和溶血性貧血。
19.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗CD20單克隆抗體的組合物用于制備治療自身性免疫病的藥物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的自身性免疫病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、特發(fā)性血小板減少紫癜和溶血性貧血。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于抗CD20單抗及其制備方法和用途。采用中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO DG44制備得到與美羅華一致的抗CD20單抗，建立了300L真核細(xì)胞大規(guī)模高表達(dá)生產(chǎn)工藝，蛋白表達(dá)量在1.2g/L以上；蛋白純化得率提高至60%以上。本發(fā)明安全有效，實用性較強(qiáng)，價廉，方便快捷，其制備工藝簡便、容易操作，使用簡便、療效顯著，為治療B細(xì)胞誘導(dǎo)的惡性腫瘤、特別是非霍奇金淋巴瘤，以及自身免疫性疾病、腎衰、乙肝和丙肝、糖尿病等提供了一種新的藥物來源，適于醫(yī)藥、生物技術(shù)領(lǐng)域等工業(yè)和行業(yè)的大規(guī)模生產(chǎn)和商業(yè)應(yīng)用，應(yīng)用前景良好，具有顯著的社會效益、經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號C07K16/28GK103012590SQ20121035603
公開日2013年4月3日 申請日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者宋華, 白文, 肖鐘熙 申請人:上海瀚康生物醫(yī)藥科技有限公司