大豆種子總蛋白質(zhì)的提取方法及其專用試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了大豆種子總蛋白質(zhì)的提取方法及其專用試劑。所述方法包括如下步驟：1）取大豆種子和溶液S1按1g:3ml的比例混合提取蛋白質(zhì)，收集所有物質(zhì)獲得混合物甲；2）向步驟1）的所述混合物甲中加入與步驟1）所述溶液S1體積相同的溶液S2再提取蛋白質(zhì)，收集所有物質(zhì)獲得混合物乙；3）將步驟2）所述混合物乙離心，取上清液用三氯乙酸沉淀，獲得所述大豆種子總蛋白質(zhì)。所述溶液S1和S2為專用試劑。使用本發(fā)明方法及試劑提取大豆種子蛋白質(zhì)量較好，純度較高，在進行雙向電泳分析時可得到900個蛋白點，一些低分子量、低豐度蛋白清晰可見。通過質(zhì)譜可鑒定363個蛋白點，遠遠高于現(xiàn)已報道的其他方法。本發(fā)明對植物蛋白質(zhì)組學(xué)的研究具有重大的應(yīng)用價值。
【專利說明】大豆種子總蛋白質(zhì)的提取方法及其專用試劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種大豆種子總蛋白質(zhì)的提取方法及其專用試劑。
【背景技術(shù)】
[0002]大豆是我國和世界上重要的經(jīng)濟作物，其種子油是人類與動物營養(yǎng)以及食品加工業(yè)植物食用油的重要來源，大豆油用量占全世界食用油的31%。同時，大豆種子也包含豐富的蛋白，是世界上植物蛋白的主要來源。鑒定大豆種子表達全蛋白，對于進一步解析大豆種子中蛋白和油積累機制有重要的參考作用。
[0003]蛋白質(zhì)是基因表達的產(chǎn)物，也是許多生理功能的主要執(zhí)行者和體現(xiàn)者，隨著功能基因組學(xué)的興起，蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)已成為生命科學(xué)研究的重點之一。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的宗旨是對組織或細胞的所有蛋白質(zhì)(至少是大部分)進行分離與鑒定。通過蛋白質(zhì)組的分析可以檢測生命活動變化過程中蛋白表達量及翻譯后修飾等變化，從而闡明其生物學(xué)功能的分子機制。蛋白樣品的提取和制備是進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析的關(guān)鍵步驟，蛋白樣品的純度和再溶性直接影響雙向電泳分離結(jié)果的清晰度和重復(fù)性。經(jīng)典雙向電泳(2-DE)的分離方法與程序主要適用于模式植物擬南芥與重要經(jīng)濟作物水稻的全蛋白分析。Toorchi等(J.Proteome Res.，2008，7:3035-3041)用三種不同的蛋白提取方法和兩種裂解液對水稻和大豆的各種組織進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn):大豆蛋白質(zhì)組凝膠圖譜的蛋白點數(shù)比水稻的少；蛋白提取方法與裂解液配方的不同嚴重影響大豆蛋白的溶解與分離；大豆和水稻對所有裂解液配方的敏感性不同。由此可見，探索、優(yōu)化大豆各種組織器官蛋白樣品制備的方法與程序是其蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展的前提與基礎(chǔ)。
[0004]大豆種子含有大約36%蛋白質(zhì)、30%碳水化合物、20%油脂、9%粗纖維和5%灰分。另外，在大豆種子中還存在大量的次生代謝產(chǎn)物。大豆次生代謝產(chǎn)物、脂質(zhì)、大量碳水化合物及酚類混合物等干擾物質(zhì)的廣泛存在不僅妨礙高質(zhì)量蛋白樣品的提取，也影響2-DE膠的分離效果，是導(dǎo)致條紋和污潰產(chǎn)生、影響高清晰度蛋白點數(shù)目的主要原因。高純度大豆全蛋白樣品的獲得是大豆蛋白質(zhì)組成功的關(guān)鍵。
[0005]目前，在關(guān)于成熟大豆種子蛋白質(zhì)組學(xué)研究的相關(guān)報道中，Mooney等(Phytochemistry 2004，65，1733-1744)和Barbosa等(Planta 1988，175，485-492)分別鑒定了 44 個和 192 個蛋白點；另兩個研究(Natarajan, et al.，Anal.Biochem.2009，394，259-268; Krishnan, et al., Proteomics 2009, 9, 3174-88)通過去掉成熟大豆種子的高豐度儲藏蛋白，分別鑒定到107個和196個蛋白點。但是大豆成熟種子中的蛋白遠不止這些，進一步鑒定到更多的蛋白將會為大豆種子發(fā)育、成熟以及萌發(fā)等提供更多的參考資料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個目的是提供一種提取大豆種子總蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟:
[0007]1)取大豆種子和溶液SI按lg:3ml的比例混合提取蛋白質(zhì)，收集所有物質(zhì)獲得混合物甲；[0008]2)向步驟1)的所述混合物甲中加入與步驟I)所述溶液SI體積相同的溶液S2再提取蛋白質(zhì)，收集所有物質(zhì)獲得混合物乙；
[0009]3)將步驟2)所述混合物乙離心，取上清液用三氯乙酸沉淀，獲得所述大豆種子總蛋白質(zhì)；
[0010]所述溶液S1的溶劑為水，溶質(zhì)為蔗糖、Tris-HCl、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)和β -巰基乙醇，所述蔗糖、Tris-HCl、EGTA, PMSF和β -巰基乙醇在所述溶液S1中的濃度分別為170g/L、40mmol/L、20mmol/L、2mmol/L和5%(體積百分含量)；所述溶液S1的pH值為7.5 ;
[0011]所述溶液S2的溶劑為水，溶質(zhì)為蔗糖、Tris-HCl、EGTA、PMSF和聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-1OO)，所述蔗糖、Tris-HCl、EGTA, PMSF 和 TritonX-1O 在所述溶液 S2 中的濃度分別為170g/L、40mmol/L、20mmol/L、2mmol/L和4% (體積百分含量)；所述溶液S2的pH值為7.5。
[0012]在上述方法中，步驟I)中所述提取包括將所述大豆種子和所述溶液SI進行研磨的步驟，該研磨的時間為8—12分鐘，如10分鐘；
[0013]和/或，步驟2)中所述提取包括將所述混合物甲和所述溶液S2進行研磨的步驟，該研磨的時間為8—12分鐘，如10分鐘；
[0014]所述研磨的溫度為O°C ；
[0015]在上述方法中，步驟3)中所述離心的相對離心力可為lOOOOg，離心時間為10分鐘；所述離心的溫度為4°C。
[0016]在上述方法中，步驟3)中所述取上清液用三氯乙酸沉淀中三氯乙酸的使用終濃度為10%體積百分含量，所述沉淀的時間為25— 35分鐘，如30分鐘；所述沉淀的溫度條件為(TC。
[0017]在上述方法中，步驟3)中所述用三氯乙酸沉淀后，還包括將所述沉淀用溶液S3洗滌的步驟；所述溶液S3為二硫蘇糖醇(DTT)的丙酮溶液，所述溶液S3中，二硫蘇糖醇的含
量為2克/升。
[0018]在上述方法中，所述用溶液S3洗滌是按每克所述大豆種子加5mL所述溶液S3進行洗滌，所述洗滌的次數(shù)為4次以上。
[0019]本發(fā)明的另一個目的是提供一種植物總蛋白質(zhì)的提取試劑或試劑盒，包括分別獨立包裝的所述溶液SI和所述溶液S2。
[0020]在上述試劑或試劑盒中，還可包括獨立包裝的所述溶液S3。
[0021]當然，上述植物總蛋白質(zhì)的提取試劑或試劑盒可只由所述溶液S1、所述溶液S2和所述溶液S3組成。
[0022]本發(fā)明保護所述試劑或試劑盒在提取植物總蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。
[0023]在上述應(yīng)用中，所述植物可為大豆，所述提取的器官具體可為所述大豆的種子。
[0024]大豆種子中含有高豐度的7S和IlS蛋白，掩蓋了低豐度種子蛋白的提取和分析。使用本發(fā)明的方法和試劑提取大豆種子蛋白質(zhì)量較好，純度較高，在進行雙向電泳分析后共得到900個蛋白點，一些低分子量、低豐度蛋白清晰可見。通過串聯(lián)質(zhì)譜分析，共鑒定到大豆種子中的363個蛋白點，遠遠高于現(xiàn)已報道的其他方法。本發(fā)明對植物蛋白質(zhì)組學(xué)的研究具有重大的應(yīng)用價值?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0025]圖1為本發(fā)明方法提取大豆種子總蛋白質(zhì)的雙向電泳圖。
[0026]圖2為對照I提取大豆種子總蛋白質(zhì)的雙向電泳圖。
[0027]圖3為對照2 (普通酚法)提取大豆種子總蛋白質(zhì)的雙向電泳圖。
[0028]圖4為酶解一個蛋白點獲得的MALD1-T0F/T0F 二級質(zhì)譜圖。其中，橫坐標為核質(zhì)t匕，縱坐標為相對離子豐度。
[0029]圖5為將一個質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用Mascot軟件在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行檢索鑒定的結(jié)果?！揪唧w實施方式】
[0030]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0031]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0032]實施例1、大豆種子總蛋白質(zhì)的提取
[0033]一、本發(fā)明的提取方法和試劑 [0034]取0.4g大豆成熟種子中黃13(王連錚，趙容娟，農(nóng)業(yè)科技通訊，2005，6:40)，砸碎，加入1.2ml溶液SI，冰上研磨10分鐘，再加入1.2ml溶液S2，繼續(xù)研磨10分鐘；將所有研磨物移至離心管中，4°C、10000g、離心10分鐘；取上清液加入終濃度為10%的三氯乙酸，冰上放置半小時；4°C、15000g、離心10分鐘，取沉淀加2mL溶液S3進行洗滌，共洗滌四次(多次大體積洗滌沉淀，可最大限度去除蛋白中的雜質(zhì))，將沉淀在超凈臺內(nèi)吹干，獲得總蛋白質(zhì)I，_20°C保存。
[0035]所述溶液SI的溶劑為水，溶質(zhì)為蔗糖、Tris-HCl、EGTA (乙二醇二乙醚二胺四乙酸)、PMSF (苯甲基磺酰氟)和β -巰基乙醇，所述蔗糖、Tris-HCl、EGTA、PMSF和β -巰基乙醇在所述溶液SI中的濃度分別為170g/L、40mmol/L、20mmol/L、2mmol/L、和5%體積百分含量；所述溶液SI的pH值為7.5。
[0036]所述溶液S2的溶劑為水，溶質(zhì)為蔗糖、Tris-HCl、EGTA (乙二醇二乙醚二胺四乙酸)、PMSF (苯甲基磺酰氟)和TritonX-1OO (聚乙二醇辛基苯基醚)，所述蔗糖、Tris-HCl、EGTA、PMSF 和 TritonX-1OO 在所述溶液 S2 中的濃度分別為 170g/L、40mmol/L、20mmol/L、2mmol/L和4%體積百分含量；所述溶液S2的pH值為7.5。
[0037]所述溶液S3為二硫蘇糖醇(DTT)的丙酮溶液，所述溶液S3中，二硫蘇糖醇的含量為2克/升。
[0038]二、對照 I
[0039]取0.4g大豆成熟種子中黃13，砸碎，加入1.5ml所述溶液SI，冰上研磨10分鐘，再加入1.5ml所述溶液S2，繼續(xù)研磨10分鐘；將所有研磨物移至離心管中，4°C、lOOOOg、離心10分鐘；取上清液加入終濃度為10%的三氯乙酸，冰上放置半小時；4°C、15000g、離心10分鐘，取沉淀加2mL所述溶液S3進行洗滌，共洗滌四次，將沉淀在超凈臺內(nèi)吹干，獲得總蛋白質(zhì)II，-20°C保存。
[0040]三、對照2 (普通酚法)
[0041]取大豆成熟種子中黃13的籽粒I粒，加5倍體積提取緩沖液(0.lmol/L Tris-HCl(ρΗ8.8)，IOmmoI/L EDTA, 0.4% 體積百分含量的 β _ 巰基乙醇，0.9mol/L 蔗糖，0.5%PVP)研磨；12000r/min離心10min，取上清液，加入等體積的水飽和酚(pH8.0)，充分振蕩，靜置1Omin后，12000r/min離心5min ;取酹相液體,加入5倍體積0.lmol/L乙醇銨,置于-20°C下30min, 12000r/min離心10min,去上清,充分洗漆沉淀4次以上，除盡乙醇銨,冷凍抽干，所得干粉為粗蛋白，即總蛋白質(zhì)III。
[0042]實施例2、蛋白質(zhì)雙向電泳、染色及凝膠掃描分析
[0043]將實施例1獲得的總蛋白質(zhì)1、II和III分別進行蛋白質(zhì)雙向電泳、染色及凝膠掃描分析，結(jié)果分別如圖1、圖2和圖3所示。圖1中蛋白點分散較好，橫紋和縱紋較少，蛋白點較多，共得到蛋白點900個；由于研磨時產(chǎn)生較多氣泡，導(dǎo)致蛋白氧化、降解，圖2中雙向電泳結(jié)果有較多橫紋和縱紋，共得到蛋白點530個；圖3中共得到蛋白點410個。
[0044]上述蛋白質(zhì)雙向電泳及凝膠染色獲得圖1-3結(jié)果的具體方法如下:
[0045]1、第一向等電聚焦電泳
[0046]取6mg 總蛋白質(zhì) I、II 或III,加入 200 μl 的 lysis buffer (含 7mol/L 的尿素(urea), 2mol/L 的硫代尿素(thoiurea), 4% (w/v)CHAPS, 2%Ampholine (ρΗ3.5-10), 1% (w/v)DTT)，震蕩器上震蕩溶解后，15000Xg、4°C、離心0.5小時，取上清液用于上樣。使用IPG預(yù)制膠條(11cm，pH4— 7，GE公司，貨號18-1016-60)在20°C下進行等電聚焦電泳:300V1小時，600V1小時，1000V1小時，8000V5小時。
[0047]2、第二向 SDS-PAGE 電泳
[0048]步驟I的等電聚焦完成后，將IPG膠條取出，用濾紙吸去附著的礦物油，放在平衡緩沖液a (1%DTT, 50mM/L Tris-HCl, 6M/L尿素，30%甘油，2.5%SDS)中，置于搖床上平衡15min后，轉(zhuǎn)入平衡緩沖液b (2.5%碘乙酰胺，50mM/L Tris-HCl, 6M/L尿素，30%甘油，
2.5%SDS)中平衡15min。將平衡好的膠條轉(zhuǎn)移到第二向垂直板膠(16%分離膠，4%濃縮膠)的上端，用1%的瓊脂糖密封，使用電泳液(pH為8.8)恒定電流25mA下進行SDS-PAGE凝膠電泳4小時。
[0049]所述16%分離膠中含16%丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺、0.37M/L Tris,0.1%SDS、
0.1%TEMED和0.07%過硫酸胺；
[0050]所述4%濃縮膠中含4%丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺，0.1M/L Tris, 0.1%SDS,
0.3%TEMED和0.05%過硫酸胺；
[0051]所述電泳液中含0.3%Tris、l.44g/L甘氨酸和0.1%SDS。
[0052]3、凝膠染色和脫色
[0053]電泳完成后，取下凝膠，置于固定液中固定40min;將固定好的凝膠置于考馬斯亮藍R250染色液中，室溫染色45min以上；倒出染色液,加入脫色液脫色30分鐘后更換脫色液，繼續(xù)脫色2小時左右，其間更換數(shù)次脫色液，至凝膠背景合適，蛋白點鮮明為止。固定、染色以及脫色過程均在脫色搖床上晃動進行。
[0054]所述固定液中含40%乙醇和10%乙酸。
[0055]所述考馬斯亮藍R250染色液中含0.116%考馬斯亮藍R250，25%乙醇和8%乙酸。
[0056]所述脫色液中含25%乙醇和8%乙酸。
[0057]4、蛋白質(zhì)凝膠的掃描及圖像分析
[0058]將步驟3處理后的凝膠用UMAX Power Look2100XL掃描儀(MaxiumTech, Taipei, China)直接掃描，掃描參數(shù)設(shè)置為256階灰度、300dpi透射掃描，圖像保存為TIF 格式。掃描后的圖像用 ImageMaster 2D Platinum 軟件(Amersham Bioscience)進行分析，將處理和對照的凝膠(每個處理三張凝膠)用軟件轉(zhuǎn)換成*.mel的文件，輸入到軟件界面。調(diào)整最佳的對比度。檢測點的參數(shù)設(shè)定為Smooth5, Min Area 50和Saliency2,進行點的檢測，統(tǒng)計每張凝膠中的蛋白點個數(shù)。將檢測到的蛋白點標記、挖膠，進行實施例3的質(zhì)譜分析。
[0059]實施例3、蛋白點的質(zhì)譜分析
[0060]將實施例1獲得的總蛋白質(zhì)I經(jīng)實施例2電泳及分析獲得的蛋白點(共900個)分別進行質(zhì)譜分析，共鑒定到363個蛋白點，其中使用MALDI TOF MS鑒定到126個蛋白點，使用MALD1-T0F/T0F鑒定到172個蛋白點，使用LC-MS/MS鑒定到65個蛋白點，具體方法如下:
[0061]1、膠內(nèi)酶解
[0062]將含目的蛋白點的凝膠塊切成Imm2左右的小塊，加脫色液(50%乙腈，50mMNH4HCO3) 800 μ 1，40°C脫色2小時，中間更換一次脫色液。吸去脫色液，用200 μ I HPLC水沖洗，震蕩Imin，之后吸去HPLC /K，再加200 μ I HPLC水沖洗，震蕩Imin。吸去HPLC /K，將膠塊真空干燥后，加入15—20 μ I胰蛋白酶工作液(0.lU/μ l，Promega，貨號:V5280)，4°C放置0.5小時，以使干膠塊充分吸脹。37°C酶解16小時，獲得酶解液保存于-20°C下備用。
[0063]2、質(zhì)譜鑒定
[0064]將步驟I獲得的酶解液與飽和的基質(zhì)溶液(溶質(zhì)為α-氰基-4-羥基肉桂酸，溶劑為I %三氟乙酸和50%乙腈)均勻混合，在點樣板上共結(jié)晶后用MALD1-T0F-MS質(zhì)譜儀(Shimadzu Biotech, Kyoto, Japan)或 MALD1-TOF/TOF 質(zhì)譜儀(UltrafIeXtreme, BrukerDaltonics, Billerica, MA, USA)或LC-MS/MS質(zhì)譜儀(Waters Ltd., Manchester, UK)進行串聯(lián)質(zhì)譜分析，具體操作按照說明書進行。圖4為酶解其中一個蛋白點，經(jīng)MALD1-T0F/T0F質(zhì)譜儀分析，獲得的VPSGTTYYVVNPDNNENLR肽段的二級質(zhì)譜圖，數(shù)據(jù)庫檢索匹配情況良好，其中y離子系列可以全部檢出。
[0065]3、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索
[0066]將經(jīng)步驟2質(zhì)譜分析后得到肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide massfingerprinting, PMF)數(shù)據(jù)，利用 Mascot 軟件(Matrix Science Ltd.，London, UK)在 NCBI數(shù)據(jù)庫中進行檢索鑒定蛋白。對于檢索的結(jié)果，軟件提供一個可信度分值(M0WSE Score),當檢索到的蛋白分值大于該值時結(jié)果是可信的(即在P < 0.05水平顯著)。當出現(xiàn)多個大于標準可信度分值的結(jié)果時候，選取得分最大的結(jié)果，同時參考其匹配肽段的序列覆蓋率(sequence coverage)以及分子量、等電點等參數(shù)來加以確定。
[0067]圖5為圖4所做質(zhì)譜蛋白點經(jīng)Mascot軟件比對后的結(jié)果，圖5結(jié)果表明，該蛋白點是大豆中β_伴球蛋白的α亞單位,共比對到11個肽段,其中唯一(unique)的肽段有7個，得分(Score)為1095分，遠遠高于其可信度分值48分的標準。
[0068] 在前人關(guān)于成熟大豆種子蛋白質(zhì)組學(xué)研究的相關(guān)報道中，Mooney等(Phytochemistry2004,65, 1733-1744)使用酚法提取大豆種子蛋白，使用肽質(zhì)量指紋圖譜法鑒定了44 個蛋白點；Barbosa 等(Anal.Bioanal.Chem.2012,402:299 - 314)通過醋酸銨沉淀法提取蛋白，使用MALD1-T0F-MS和Q-T0F-MS/MS質(zhì)譜法鑒定了 192個蛋白點；Natarajan等(Anal.Biochem.2009, 394，259-268)使用 30% 異丙醇富集低豐度蛋白，使用 MALD1-T0F-MS和 LC-MS/MS 質(zhì)譜法鑒定了 107 個蛋白點；Krishnan 等(Proteomics2009, 9，3174-88)使用IOmM鈣離子沉淀去除成熟大豆種子中87%的高豐度儲藏蛋白，使用MALD1-TOF-MS質(zhì)譜法鑒定了 196個蛋白點。而使用本發(fā)明方法提取蛋白，經(jīng)膠內(nèi)酶解和MALD1-TOF/TOF質(zhì)譜分析，共鑒定到大豆種子中 363個表達蛋白，遠遠高于現(xiàn)已報道的其他方法。
【權(quán)利要求】
1.一種提取大豆種子總蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟: 1)取大豆種子和溶液SI按lg:3ml的比例混合提取蛋白質(zhì)，收集所有物質(zhì)獲得混合物甲； 2)向步驟I)的所述混合物甲中加入與步驟I)所述溶液SI體積相同的溶液S2再提取蛋白質(zhì)，收集所有物質(zhì)獲得混合物乙； 3)將步驟2)所述混合物乙離心，取上清液用三氯乙酸沉淀，獲得所述大豆種子總蛋白質(zhì)； 所述溶液SI的溶劑為水，溶質(zhì)為蔗糖、Tris-HCl、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、苯甲基磺酰氟和巰基乙醇，所述蔗糖、Tris-HCl、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、苯甲基磺酰氟和β -巰基乙醇在所述溶液SI中的濃度分別為170g/L、40mmol/L、20mmol/L、2mmol/L和5%體積百分含量；所述溶液SI的pH值為7.5 ; 所述溶液S2的溶劑為水，溶質(zhì)為蔗糖、Tris-HCl、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、苯甲基磺酰氟和聚乙二醇辛基苯基醚，所述蔗糖、Tris-HCl、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、苯甲基磺酰氟和聚乙二醇辛基苯基醚在所述溶液S2中的濃度分別為170g/L、40mmOl/L、20mmOl/L、2mmol/L和4%體積百分含量；所述溶液S2的pH值為7.5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟I)中所述提取包括將所述大豆種子和所述溶液SI進行研磨的步驟,該研磨的時間為8— 12分鐘,如10分鐘； 和/或，步驟2)中所述提取包括將所述混合物甲和所述溶液S2進行研磨的步驟，該研磨的時間為8 —12分鐘，如10分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟3)中所述離心的相對離心力為lOOOOg，離心時間為10分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1一3中任一所述的方法，其特征在于:步驟3)中所述取上清液用三氯乙酸沉淀中三氯乙酸的使用終濃度為10%體積百分含量，所述沉淀的時間為25— 35分鐘，如30分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1一4中任一所述的方法，其特征在于:步驟3)中所述用三氯乙酸沉淀后，還包括將所述沉淀用溶液S3洗滌的步驟；所述溶液S3為二硫蘇糖醇的丙酮溶液，所述溶液S3中二硫蘇糖醇的含量為2克/升。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述用溶液S3洗滌按每克所述大豆種子加5mL所述溶液S3的比例進行，所述洗滌的次數(shù)為4次以上。
7.植物總蛋白質(zhì)的提取試劑或試劑盒，包括分別獨立包裝的權(quán)利要求1中的所述溶液SI和所述溶液S2。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑或試劑盒，其特征在于:所述試劑或試劑盒包括獨立包裝的權(quán)利要求5中的所述溶液S3。
9.權(quán)利要求7或8所述試劑或試劑盒在提取植物總蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于:所述植物為大豆，所述提取的器官為所述大豆的種子。
【文檔編號】C07K1/30GK103897018SQ201210576800
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月26日
【發(fā)明者】曲樂慶, 徐秀蘋 申請人:中國科學(xué)院植物研究所