專利名稱：用于測量βig－h(huán)3蛋白質(zhì)的量的方法以及使用其的診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于測量βig-h3蛋白質(zhì)的量的方法以及使用其的診斷試劑盒。具體而言，本發(fā)明涉及通過βig-h3蛋白質(zhì)或βig-h3蛋白質(zhì)中fas-1結(jié)構(gòu)域的重組蛋白(包括其片段或其衍生物)與其配體之間的特異結(jié)合反應(yīng)來測量體液中βig-h3蛋白質(zhì)的量的方法，還涉及用于腎病、肝病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或心血管疾病的診斷試劑盒，其包含βig-h3蛋白質(zhì)或βig-h3蛋白質(zhì)中fas-1結(jié)構(gòu)域的重組蛋白(包括其片段或其衍生物)及其配體。
背景技術(shù)：
βig-h3是包括人黑素瘤細(xì)胞、乳房上皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞中由TGF-β誘導(dǎo)的胞外基質(zhì)蛋白。TGF-β(轉(zhuǎn)化生長因子-β)涉及多種細(xì)胞的生長和分化，而且哺乳動物具有三種TGF-β(TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)。已知TGF-β具有許多復(fù)雜的功能，諸如生長控制、免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)、刺激骨形成、誘導(dǎo)軟骨特異大分子、刺激傷口愈合等(Bennett，N.T.等人，Am.J.Surg.，1993，165，728)。TGF-β在傷口愈合過程中表達(dá)于上皮細(xì)胞中，可能是為了在上皮細(xì)胞再生過程中刺激角質(zhì)細(xì)胞中整合素的表達(dá)。最近關(guān)于TGF-β表達(dá)的研究揭示了，TGF-β3mRNA表達(dá)于正常皮膚的上皮細(xì)胞和急性或慢性傷口恢復(fù)中的上皮細(xì)胞，TGF-β1mRNA只表達(dá)于由急性傷口再生的上皮細(xì)胞中，而TGF-β2mRNA根本不表達(dá)(Schmid，P.等人，J.Pathol.，1993，171，191)。盡管關(guān)于上述機(jī)制的具體理論尚未建立，但是認(rèn)為TGF-β在上皮細(xì)胞再生中發(fā)揮重要作用。
βig-h3，即由TGF-β誘導(dǎo)的基因h3，是由Stonier等人首先發(fā)現(xiàn)的。確切的說，βig-h3是在搜索來自A549細(xì)胞系的cDNA文庫差異篩選數(shù)據(jù)的過程中發(fā)現(xiàn)的，A549細(xì)胞系是經(jīng)過TGF-β1處理的人肺腺癌細(xì)胞系，據(jù)報道在TGF-β1處理后兩天βig-h3升高了20倍(Stonier，J.等人，DNACell Biol.，1992，11，511)。還通過DNA測序確認(rèn)了βig-h3是由SEQ.ID.No 1所示的683個氨基酸組成的，具有氨基末端分泌序列和能夠進(jìn)行針對某些整合素的配體識別的羧基末端Arg-Gly-Asp(RGD)序列。
βig-h3包含四個同型內(nèi)部重復(fù)結(jié)構(gòu)域以及RGD基元，在哺乳動物、昆蟲、海膽、植物、酵母和細(xì)菌等物種的膜蛋白或分泌蛋白中都能觀察到這種高度保守的序列。諸如骨膜蛋白(periostin)、成束蛋白I、海膽HLC-2、海藻CAM和分支桿菌MPB70等蛋白質(zhì)也包含上述保守序列(Kawamoto，T.等人，Biochem.Biophys.Acta.，1998，1395，288)。在那些蛋白質(zhì)中非常保守的同型結(jié)構(gòu)域(在下文中稱為“fas-1結(jié)構(gòu)域”)由110-140個氨基酸組成，包含兩個各由10個氨基酸組成的非常保守的分支(H1和H2)。βig-h3、骨膜蛋白和成束蛋白I含有4個fas-1結(jié)構(gòu)域，HCL-2含有2個fas-1結(jié)構(gòu)域，而MPB70則只含有1個fas-1結(jié)構(gòu)域。已知那些蛋白質(zhì)中的一些可以作為細(xì)胞粘附分子而介導(dǎo)細(xì)胞的粘附和脫離，盡管尚未能夠完全解釋那些蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。例如，βig-h3、骨膜蛋白和成束蛋白I分別干預(yù)成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的粘附，而則證實海藻-CAM是在團(tuán)藻胚中駐留的細(xì)胞粘附分子(LeBaron，R.G.等人，J.Invest.Dermatol.，104，844，1995；Horiuchi，K.等人，J.Bone Miner.Res.，1999，14，1239；Huber，O.等人，EMBO J.，1994，13，4212)。
純化的βig-h3蛋白質(zhì)在無血清培養(yǎng)基中刺激皮膚成纖維細(xì)胞的粘附和鋪展，但是阻礙A549、HeLa和WI-38細(xì)胞的粘附。βig-h3尤其阻礙腫瘤細(xì)胞的生長、集落的形成和出現(xiàn)。事實上，通過用βig-h3表達(dá)載體轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞在裸鼠中的生長顯著降低，這在美國專利#5,714,588和#5,599,788中有明確敘述。此外，在那些專利中還敘述了通過用需要量的βig-h3接觸傷口來刺激受傷部位周圍的成纖維細(xì)胞擴(kuò)展和粘附的方法。因此，作為在許多細(xì)胞中由TGF-β高度誘導(dǎo)的細(xì)胞粘附分子，βig-h3在細(xì)胞生長、細(xì)胞分化、傷口愈合、形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞粘附中發(fā)揮重要作用。
盡管βig-h3是有效的有用物質(zhì)，然而因為人體內(nèi)只生成極少量的βig-h3，所以它的供應(yīng)是不足的。為了解決這個問題，通過遺傳工程在真核細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)βig-h3，從而開發(fā)了制備它的方法?？墒牵谀欠N情況中，生成βig-h3的細(xì)胞的生長比其它細(xì)胞慢得多，從而導(dǎo)致難以獲得足夠量的βig-h3生成細(xì)胞。因此，本發(fā)明人建立了一種純化方法，其中使用大腸桿菌作為宿主大量表達(dá)包含整個βig-h3蛋白質(zhì)或其一些結(jié)構(gòu)域的重組蛋白，證實了那些重組蛋白支持細(xì)胞粘附和鋪展，并申請了專利(韓國專利申請#2000-25664)。
細(xì)胞粘附分子βig-h3的細(xì)胞粘附活性首先報導(dǎo)于人的真皮成纖維細(xì)胞，然后在軟骨細(xì)胞、腹膜成纖維細(xì)胞和人MRC5成纖維細(xì)胞中也有這樣的報導(dǎo)。早期認(rèn)為βig-h3的細(xì)胞粘附活性是由βig-h3羧基末端的RGD基元介導(dǎo)的。但是后來報導(dǎo)RGD基元并非是刺激軟骨細(xì)胞鋪展所必需的，而且通過羧基末端加工使其中RGD基元缺失的成熟βig-h3能夠阻礙細(xì)胞粘附。因此，確認(rèn)了RGD基元并非βig-h3細(xì)胞粘附活性的必需介導(dǎo)物。最近的研究進(jìn)一步確認(rèn)了βig-h3通過與整合素α1β1獨立作用來刺激細(xì)胞粘附和鋪展，尤其是成纖維細(xì)胞的鋪展，而βig-h3的RGD基元并非由βig-h3介導(dǎo)的細(xì)胞鋪展所必需的(Ohno，S.等人，Biochim.Biophys.Acta，1999，1451，196)。此外，確認(rèn)了βig-h3中所包含的H1和H2肽不影響由βig-h3介導(dǎo)的細(xì)胞粘附，說明細(xì)胞粘附所需要的某些氨基酸并非位于H1和H2中而是在βig-h3的其它部位。為了支持上文，通過計算機(jī)分析了βig-h3的重復(fù)fas-1結(jié)構(gòu)域與其它蛋白質(zhì)的fas-1結(jié)構(gòu)域之間的同源性，從而確認(rèn)了βig-h3中除了H1和H2以外的許多其它保守氨基酸參與細(xì)胞粘附的事實。
因此，本發(fā)明人試圖尋找參與細(xì)胞粘附和脫離活性的保守基元，并制備包含它們的肽。結(jié)果是，本發(fā)明人使用稱為細(xì)胞粘附分子的βig-h3的第二個和第四個結(jié)構(gòu)域制備了通過與α3β1整合素一起作用來介導(dǎo)細(xì)胞粘附和脫離的肽NKDIL、EPDIM和它們的衍生物，并揭示了位于βig-h3第二個和第四個結(jié)構(gòu)域中H2區(qū)域附近的兩個非常保守的氨基酸，天冬氨酸(Asp)和異亮氨酸(Ile)是細(xì)胞粘附和脫離所必需的氨基酸，并申請了專利(韓國專利申請#2000-25665)。
今天，尚無βig-h3直接涉及疾病的報導(dǎo)，但是βig-h3似乎涉及一些人類癌癥。尚未能夠解釋βig-h3表達(dá)與腎病、肝病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和心血管疾病發(fā)展的關(guān)聯(lián)，同樣尚未報導(dǎo)通過測量體液中βig-h3蛋白質(zhì)的量即利用βig-h3蛋白質(zhì)診斷疾病的可能性。
由此，本發(fā)明人開發(fā)了使用通過將許多βig-h3或βig-h3的第四個fas-1結(jié)構(gòu)域連接起來而制備的重組蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白而測量βig-h3的量的方法，以及使用其的試劑盒。本發(fā)明人證實本發(fā)明的方法和試劑盒能夠有效的作為靈敏診斷方法，用于診斷腎病、肝病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或心血管疾病的損傷或發(fā)展程度，從而完成了本發(fā)明。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供使用βig-h3蛋白質(zhì)或包含βig-h3的fas-1結(jié)構(gòu)域的重組蛋白來測量βig-h3蛋白質(zhì)的量的方法，以及使用其的診斷試劑盒。
附圖簡述
圖1是顯示βig-h3重組蛋白的結(jié)構(gòu)的圖，I、II、III和IV各個結(jié)構(gòu)域； 和 堿基序列保守區(qū)域；Aβig-h3；B人βig-h3；C小鼠βig-h3。
圖2是顯示通過重復(fù)βig-h3 IV結(jié)構(gòu)域制備的βig-h3 D-IV重組蛋白的幾何結(jié)構(gòu)的圖，Aβig-h3；Bβig-h3 D-IV(1x)；Cβig-h3 D-IV(2x)；Dβig-h3 D-IV(3x)Eβig-h3 D-IV(4x)。
圖3是分離的βig-h3重組蛋白的電泳照片，1人βig-h3；2小鼠βig-h3。
圖4是βig-h3 D-IV(1x、2x、3x、4x)蛋白質(zhì)的電泳照片，1βig-h3 D-IV(1x)；2βig-h3 D-IV(2x)；3βig-h3 D-IV(3x)；4βig-h3 D-IV(4x)。
圖5是顯示使用一抗的Western印跡的結(jié)果的照片，由此確認(rèn)了人βig-h3和小鼠βig-h3，
1人βig-h3； 2小鼠βig-h3。
圖6是顯示酶聯(lián)免疫吸收測定法(ELISA)的原理的圖。
圖7是顯示一抗的數(shù)量比率的圖表，◆1∶200； ■1∶400； ▲1∶800；×1∶1600；※1∶2000；●1∶3200。
圖8是顯示二抗的數(shù)量比率的圖表，A將一抗固定在1∶1600，B將一抗固定在1∶2000，◆將二抗稀釋至1∶1000，■將二抗稀釋至1∶2000，●將二抗稀釋至1∶3000。
圖9是顯示人βig-h3蛋白質(zhì)的包被濃度的圖表，◆0.5μg/ml； ■1.0μg/ml。
圖10是顯示人βig-h3蛋白質(zhì)和小鼠βig-h3蛋白質(zhì)都可用作標(biāo)準(zhǔn)蛋白的圖表，這通過交叉測試得到了證實，◆人βig-h3蛋白質(zhì)包被濃度0.5μg/ml，抗人βig-h3一抗1∶2000，二抗1∶2000，■人βig-h3蛋白質(zhì)包被濃度0.5μg/ml，抗小鼠βig-h3一抗1∶2000，二抗1∶2000，▲小鼠βig-h3蛋白質(zhì)包被濃度0.5μg/ml，抗人βig-h3一抗1∶2000，二抗1∶2000，×小鼠βig-h3蛋白質(zhì)包被濃度0.5μg/ml，抗小鼠βig-h3一抗1∶2000，二抗1∶2000。
圖11是顯示重組βig-h3 D-IV(1x)蛋白質(zhì)和重組βig-h3 D-IV(4x)蛋白質(zhì)可以用作標(biāo)準(zhǔn)蛋白的圖表，這通過交叉測試得到了證實，A的◆βig-h3 D-IV(1x)包被濃度0.5μg/ml，抗人βig-h3一抗1∶2000，二抗1∶2000，A的■βig-h3 D-IV(4x)包被濃度0.5μg/ml，抗人βig-h3一抗1∶2000，二抗1∶2000，B的◆βig-h3 D-IV(1x)包被濃度0.5μg/ml，抗小鼠βig-h3一抗1∶2000，二抗1∶2000，B的■βig-h3 D-IV(4x)包被濃度0.5μg/ml，抗小鼠βig-h3一抗1∶2000，二抗1∶2000。
圖12是顯示腎組織中的βig-h3表達(dá)模式的免疫組織化學(xué)染色照片，A的S3近側(cè)腎小管細(xì)胞基底膜的表達(dá)模式，B的腎小球Bowman氏囊基底膜的表達(dá)模式，B的→皮質(zhì)厚升支細(xì)胞(cortical thick ascending limb cell)基底膜的表達(dá)模式。
圖13是顯示誘發(fā)糖尿病大鼠尿液中的βig-h3水平的圖表，■對照組，□通過鏈佐星(streptozotocin)處理誘發(fā)糖尿病的大鼠。
圖14是顯示圖13中誘發(fā)糖尿病大鼠的尿液中的βig-h3個體水平。
圖15是顯示由每個正常大鼠、腎單位劑量不足大鼠、慢性排斥大鼠、復(fù)發(fā)性GN大鼠和顯示CyA毒性的大鼠獲得的尿液中的βig-h3水平的圖表。
圖16的圖表顯示了由于在腎移植后再次形成病灶性部分腎小球硬化癥(focal segmental glomerulosclerosis)(FSGS)而接受了血漿取出法處理的患者的每日尿樣測量得到的不同βig-h3蛋白質(zhì)濃度。
圖17的圖表顯示了活著的供體、死去的供體、劑量不足和排斥患者在腎移植之前和之后的尿液中測量得到的βig-h3蛋白質(zhì)濃度。
圖18是顯示誘發(fā)糖尿病小鼠損傷血管中的βig-h3蛋白質(zhì)表達(dá)模式的免疫組織化學(xué)染色照片，A正常血管，B損傷血管，L內(nèi)腔。
圖19的圖表顯示了血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)物中的βig-h3蛋白質(zhì)表達(dá)模式，*p＜0.05；**p＜0.01。
發(fā)明詳述為了實現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明提供了用于測量βig-h3蛋白質(zhì)的量的方法。
本發(fā)明還提供了使用其且用于腎病、肝病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或心血管疾病的診斷試劑盒。
本發(fā)明的其它特征將在下文中出現(xiàn)。
本發(fā)明用于測量βig-h3的量的方法包括一下步驟1)制備βig-h3蛋白質(zhì)或包含βig-h3 fas-1結(jié)構(gòu)域的重組蛋白、其片段或衍生物；2)制備針對上文步驟1的上述重組蛋白、其片段或衍生物的特異配體；和3)通過使用上文步驟2的配體與上文步驟1的重組蛋白、其片段或衍生物的結(jié)合反應(yīng)的方法來測量樣品中βig-h3蛋白質(zhì)的量。
在步驟1中，βig-h3蛋白質(zhì)或是具有SEQ.ID.No 3所示氨基酸序列的人βig-h3蛋白質(zhì)或是具有SEQ.ID.No 5所示氨基酸序列的小鼠βig-h3蛋白質(zhì)。圖1顯示了人和小鼠βig-h3蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)元件。圖1中的斜線陰影區(qū)和交叉線陰影區(qū)顯示重復(fù)的fas-1結(jié)構(gòu)域I、II、III和IV的非常保守的序列，而空白區(qū)表示RGD基元。
βig-h3蛋白質(zhì)含有4個fas-1結(jié)構(gòu)域。對于上文步驟1的βig-h3fas-1結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選選擇βig-h3蛋白質(zhì)第一個至第四個fas-1結(jié)構(gòu)域中的一個或超過兩個，更優(yōu)選使用第四個fas-1結(jié)構(gòu)域。第四個fas-1結(jié)構(gòu)域可以獨立使用，或者作為許多fas-1結(jié)構(gòu)域重復(fù)連接的重組蛋白。對于重組蛋白，需要聯(lián)合1-10個fas-1結(jié)構(gòu)域，更優(yōu)選使用1-4個fas-1結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明人提供了只使用第四個fas-1結(jié)構(gòu)域和分別通過連接2個、3個和4個βig-h3第四個結(jié)構(gòu)域制備的重組蛋白的實例。
本發(fā)明人制備了由SEQ.ID.No 7、No 8、No 9和No 10每個所示的蛋白質(zhì)，它們分別具有1個、2個、3個和4個包含βig-h3第502-632位氨基酸的第四個fas-1結(jié)構(gòu)域，并將它們命名為“βig-h3 D-IV(1x)”、“βig-h3 D-IV(2x)”、“βig-h3 D-IV(3x)”和“βig-h3 D-IV(4x)”(見圖4)。
βig-h3蛋白質(zhì)中與配體發(fā)生特異結(jié)合反應(yīng)的部位即表位和蛋白質(zhì)中包含蛋白酶水解的肽的任何其它部分都可作為重組蛋白的片段?？梢酝ㄟ^包括磷酸化或糖基化在內(nèi)的共價鍵以及包括離子鍵、配位鍵、氫鍵、疏水鍵或范德華鍵在內(nèi)的非共價鍵來制備本發(fā)明重組蛋白的衍生物。如果上述重組蛋白衍生物的片段能夠與配體特異結(jié)合，那么它們也將包括在本發(fā)明蛋白質(zhì)的范圍之內(nèi)。
為了制備本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)蛋白，可以通過常規(guī)方法來進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化。
在步驟2中，可以通過觀察配體與步驟1的蛋白質(zhì)或重組蛋白的結(jié)合反應(yīng)來確認(rèn)特異結(jié)合βig-h3、βig-h3 fas-1結(jié)構(gòu)域、其片段或衍生物的配體。配體有許多種類，諸如抗體、RNA、DNA、包括脂類、蛋白質(zhì)或有機(jī)鹽的有機(jī)化合物、或包括金屬離子或無機(jī)鹽的無機(jī)化合物，優(yōu)選的配體是使用步驟1的蛋白質(zhì)或重組蛋白(包括片段或衍生物)作為抗原制備的步驟2中針對βig-h3或βig-h3 fas-1結(jié)構(gòu)域的一抗。可以通過常規(guī)方法來制備一抗，而且可以使用單克隆抗體或多克隆抗體。
在步驟3中，通過配體與βig-h3蛋白質(zhì)、它的片段或衍生物的特異結(jié)合反應(yīng)來測量樣品中所包含的βig-h3蛋白質(zhì)的量。在發(fā)生配體結(jié)合反應(yīng)的部位，甚至可以使用那些片段或衍生物的片段。優(yōu)選使用采用抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的定量測定法，所述結(jié)合反應(yīng)中以βig-h3蛋白質(zhì)作為抗原。更優(yōu)選的是由下組選擇一種方法免疫印跡(Current Protocols inMolecular Biology，第2卷，第10.8章；David等，Cells，(a LaboratoryManual)，第1卷，第73章)、免疫沉淀(Current Protocols in MolecularBiology，第2卷，第10.16章；Cells(a Laboratory Manual)，第1卷，第72章)、ELISA(Current Protocols in Molecular Biology，第2卷，第11.2章；ELISA Theory and Practice，John R.Crowther；The ELISAGuidebook，John R.Crowther)、RIA(放射免疫測定法)(Nuklearmedizin，1986年8月，25(4)125-127，Tumor markers as target substancesin the radioimmunologic detection of malignancies。von Kleist S；Mariani G.Ann Oncol，1999，10增刊437-40)、蛋白質(zhì)芯片(DanielFigeys等人，Electrophoresis，2001，22，208-216；Albala JS.，ExpertRev Mol Diagn，2001年7月，1(2)145-152)、快速測定法(KasaharaY和Ashihara Y，Clinical Chimica Acta，267，1997，87-102；韓國專利申請#2000-46639)或微陣列(Vivian G.Cheung等人，NatureGenetics，1999，21，15-19；Robert J.Lipshutz等人，Nature Genetics，1999，21，20-24；Christine Debouck和Peter N.Goodfellow，NatureGenetics，1999，21，48-50；DNA Microarrays，M.Schena)，而且ELISA是最優(yōu)選的方法。還有可能使用生物學(xué)微芯片和自動化微陣系統(tǒng)以及ELISA進(jìn)行大規(guī)模樣品分析，而且可以由此開發(fā)出使用尿液的簡單的自我診斷方法。
依照本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，使用ELISA通過競爭測定法測量βig-h3蛋白質(zhì)的量的方法包括以下步驟1)用βig-h3蛋白質(zhì)或包含βig-h3 fas-1結(jié)構(gòu)域的重組蛋白、它的片段或衍生物包被基質(zhì)；2)使針對上文步驟1的蛋白質(zhì)、它的片段或衍生物的抗體與樣品反應(yīng)；3)將上文步驟2的反應(yīng)物加到步驟1的包被蛋白質(zhì)上，并等待反應(yīng)進(jìn)行，然后對其進(jìn)行清洗；和4)將二抗加到上文步驟3的反應(yīng)物上，進(jìn)行進(jìn)一步的反應(yīng)，然后測量OD。
所有種類的常用基質(zhì)都可用作上文步驟1的基質(zhì)，尤其是硝酸纖維素膜、聚乙烯板(例如96孔板)、聚苯乙烯板和載玻片可以用作基質(zhì)。
用顯色酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、放射性同位素或金屬螯合物標(biāo)記上文步驟4的二抗。每一種常用標(biāo)記物都可用于本發(fā)明，而且過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、辣根過氧化物酶、觸酶(catalse)和乙酰膽堿酯酶是優(yōu)選的顯色酶。對于熒光物質(zhì)，優(yōu)選使用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiochanate)、藻膽蛋白、若丹明、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、正鄰苯二醛等。
作為顯色酶或熒光物質(zhì)以外的另一種二抗標(biāo)記物，優(yōu)選使用發(fā)光物質(zhì)諸如異魯米諾、光澤精、魯米諾、吖啶鎓酯(acridiniumester)、imidasol、吖啶鹽、熒光素、熒光素酶和水母發(fā)光蛋白，或者放射性同位素諸如125I、127I、131I、14C、3H、32P和35S。另外，還可以將小分子半抗原像生物素、二硝基苯基、pyridoxil或熒光胺與抗體綴合。
在步驟4中使用顯色酶的情況中，應(yīng)當(dāng)使用呈色底物來測量酶的活性，而且能夠由二抗所結(jié)合的酶顯色的每一種物質(zhì)都可以用作呈色底物。優(yōu)選使用4-氯-1-萘酚(4CN)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、氨基乙基咔唑(AEC)、2，2’-連氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、鄰苯二胺(OPD)和四甲基聯(lián)苯胺(TMB)作為呈色底物。
作為上文步驟2的范例，可以使用患有βig-h3相關(guān)疾病患者所有種類的體液。尤其優(yōu)選患有腎病、肝病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或心血管疾病患者的尿液、血液或滑液。
為了確認(rèn)本發(fā)明用于測量βig-h3蛋白質(zhì)的量的方法是否是正確的，本發(fā)明人使用包含小鼠βig-h3或βig-h3第四個fas-1結(jié)構(gòu)域的重組蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，并將結(jié)果與使用人βig-h3作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。
為了本發(fā)明用于測量βig-h3的方法確定人βig-h3蛋白質(zhì)的最佳包被濃度和抗體的數(shù)量比率?？谷甩耰g-h3一抗的最佳數(shù)量比率是1∶1600和1∶2000(見圖7)，而二抗的最佳數(shù)量比率是1∶2000(見圖8)。人βig-h3蛋白質(zhì)的合適濃度是1.0μg/ml和0.5μg/ml，但是更優(yōu)選0.5μg/ml作為包被濃度(見圖9)。
因此，本發(fā)明人決定了人βig-h3標(biāo)準(zhǔn)蛋白的最佳包被濃度是0.5μg/ml，而抗人βig-h3一抗和二抗的最佳稀釋比率皆為1∶2000。
本發(fā)明人還確定了使用小鼠βig-h3、重組βig-h3 D-IV(1x)、βig-h3D-IV(2x)、βig-h3 D-IV(3x)和βig-h3 D-IV(4x)時蛋白質(zhì)的濃度以及一抗和二抗的數(shù)量比率。確切的說，將每種蛋白質(zhì)的包被濃度都調(diào)整至0.5μg/ml，將抗人βig-h3一抗和二抗均稀釋至1∶2000，并進(jìn)行定量測定法。同樣，將抗小鼠βig-h3一抗和二抗均稀釋至1∶2000，并進(jìn)行定量測定法。
結(jié)果是，所有情況都得到了直線圖，說明上述比率是最佳的，而且它們的測量范圍在11ng/ml和900ng/ml之間，意味著在此測量范圍內(nèi)沒有太大差異(見圖11和圖12)。
根據(jù)上述結(jié)果，證實了標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)可以是人βig-h3、小鼠βig-h3、重組βig-h3 D-IV(1x)、βig-h3 D-TV(2x)、βig-h3 D-IV(3x)和βig-h3 D-IV(4x)中的任一種，而且抗人βig-h3抗體或抗小鼠βig-h3抗體可以用作一抗。
在本發(fā)明中，標(biāo)準(zhǔn)蛋白的優(yōu)選包被濃度是0.1-2.0μg/ml，更優(yōu)選0.5-1.0μg/ml。一抗和二抗的優(yōu)選稀釋比率是1∶400-1∶3200，更優(yōu)選1∶2000。
本發(fā)明提供了用于腎病、肝病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或心血管疾病的診斷試劑盒，由此可以通過測量患者體液中βig-h3蛋白質(zhì)的量來診斷疾病。
本發(fā)明的診斷試劑盒包含βig-h3蛋白質(zhì)或βig-h3蛋白質(zhì)fas-1結(jié)構(gòu)域的重組蛋白(包括其片段或其衍生物)及其配體。此時，作為優(yōu)選的特異配體，使用針對βig-h3蛋白質(zhì)或βig-h3 fas-1結(jié)構(gòu)域的抗體。試劑盒可以額外包含緩沖液、二抗、清洗液或呈色底物。
通過測量體液中βig-h3蛋白質(zhì)的量，本發(fā)明的診斷試劑盒可用于診斷多種疾病，諸如腎病、肝病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或心血管疾病。
根據(jù)βig-h3表達(dá)是由在腎病發(fā)展中發(fā)揮重要作用的TGF-β所誘導(dǎo)的這一事實，有可能通過測量βig-h3蛋白質(zhì)的量來診斷腎病。為了證明這一點，測量糖尿病患者尿液中βig-h3的量。結(jié)果是，包括微蛋白尿癥在內(nèi)的糖尿病樣腎病患者尿液中βig-h3的量比正常人高大約5倍。一些未患腎病的糖尿病患者也顯示βig-h3的量比正常的高。根據(jù)上述結(jié)果，尿液中的βig-h3水平似乎反映了腎臟損傷的程度，而一些未患腎病的糖尿病患者所具有的高水平βig-h3則說明他們的腎早已受到一定程度的損傷，盡管尚未顯示任何臨床癥狀。因此，測量患者尿液中βig-h3的量是一種高度靈敏且重要的診斷方法，它能夠反映早期的腎臟損傷。
為了確認(rèn)糖尿病患者尿液中的βig-h3濃度是否能夠反映早期的腎臟損傷，測量了糖尿病動物中的βig-h3濃度。結(jié)果是，在誘發(fā)糖尿病5天后βig-h3濃度升高了4倍(見圖13)。觀察誘發(fā)糖尿病后各個個體中βig-h3濃度的變化，發(fā)現(xiàn)誘發(fā)糖尿病后導(dǎo)致尿液中的βig-h3濃度大大升高(見圖14)。在誘發(fā)糖尿病后第5天，血尿和肌酸是正常的，而且腎組織看上去是正常的。由此，在誘發(fā)糖尿病第5天尿液中βig-h3量的大大增加說明腎臟早已受到微小損傷，而這是常規(guī)測試方法所檢測不到的。
本發(fā)明人還通過測量腎移植患者在手術(shù)之前和之后尿液中βig-h3的量而證實了腎臟損傷與βig-h3濃度之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果是，手術(shù)前患者的高濃度βig-h3在手術(shù)成功后逐漸下降。但是在5號患者的情況中，他的腎功能甚至在手術(shù)后也未恢復(fù)，βig-h3濃度仍然很高(見圖2)。根據(jù)所有上述結(jié)果，可以肯定βig-h3濃度靈敏的反映了腎臟損傷的程度。
本發(fā)明人還測量了腎衰竭患者尿液中的βig-h3濃度。結(jié)果是，所有那些腎衰竭患者都顯示他們的尿樣中有高濃度的βig-h3。由此，再次證實了尿液中βig-h3的量靈敏的反映了甚至早期的腎臟損傷，因而測量βig-h3的量對于多種腎病而言是非常重要的診斷方法(見表3)。
確定慢性肝炎患者是否會發(fā)展成肝硬化患者是非常重要的，但是至今尚無辦法。形成肝硬化最最重要的因素是TGF-β。因此，由TGF-β誘導(dǎo)表達(dá)的βig-h3在血液中的濃度可能隨著肝硬化的發(fā)展而升高。如果是這樣，那么βig-h3的量也能夠反映肝硬化的程度。事實上，通過對肝炎患者肝組織的免疫組織學(xué)測試證實了βig-h3表達(dá)隨著肝硬化的惡化而增強(qiáng)。本發(fā)明人根據(jù)慢性肝炎患者的活組織檢查結(jié)果將患者的狀況細(xì)分成幾個等級和階段，并調(diào)查了各個階段和等級的血液βig-h3濃度。慢性肝炎患者顯示血液βig-h3濃度比正常人高。較低階段和等級的βig-h3濃度證實比較高階段和等級高(見表5)。第3等級和第3階段患者的狀況是已經(jīng)形成了嚴(yán)重的肝硬化，而且它的活性早已經(jīng)過峰值。同時，第1和2等級以及第1和2階段的患者顯示炎癥反應(yīng)發(fā)展非?；钴S的狀況。由此，βig-h3濃度意味著肝硬化活性，因而可以通過定期測量血液βig-h3濃度來觀察肝硬化的發(fā)展。
還測量了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者和骨關(guān)節(jié)炎患者滑液中的βig-h3濃度。結(jié)果是，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑液中觀察到高2倍的βig-h3濃度，說明測量滑液中的βig-h3濃度可能是診斷骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效方法(見表6)。
另外，通過免疫組織化學(xué)方法調(diào)查了糖尿病小鼠正常和損傷血管中的βig-h3表達(dá)模式，從而證實了βig-h3表達(dá)與心血管疾病之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果是，βig-h3蛋白質(zhì)在糖尿病小鼠損傷血管中的表達(dá)大大高于正常血管(見圖18)。根據(jù)βig-h3表達(dá)是由在血管病發(fā)展中發(fā)揮重要作用的TGF-β所誘導(dǎo)的這一事實，調(diào)查了形成血管的血管平滑肌細(xì)胞中由TGF-β誘導(dǎo)的βig-h3表達(dá)。結(jié)果是，證實了βig-h3表達(dá)隨著TGF-β1的量的增加而增加(見圖19)。
血液和組織中的βig-h3表達(dá)反映了它們的損傷。由此，證實了本發(fā)明用于測量βig-h3蛋白質(zhì)的量的方法能夠有效用于多種血管病的診斷。
因此，本發(fā)明測量βig-h3蛋白質(zhì)的量的診斷試劑盒在使用中非常有效，因為它反映了腎病、肝病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或心血管疾病的損傷和發(fā)展程度。
實施例下面的實施例舉例說明了本發(fā)明的實踐和當(dāng)前優(yōu)選實施方案。
然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員在考慮了本公開內(nèi)容后，可以在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)進(jìn)行修改和改進(jìn)。
實施例1標(biāo)準(zhǔn)蛋白和一抗的制備<1-1>人βig-h3和小鼠βig-h3的分離本發(fā)明人已制備了人和小鼠βig-h3蛋白質(zhì)。圖1顯示了人和小鼠βig-h3蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)元件。圖1中的斜線陰影區(qū)和交叉線陰影區(qū)顯示重復(fù)的fas-1結(jié)構(gòu)域I、II、III和IV中非常保守的序列，而空白區(qū)表示RGD基元。
用Nde I和BglII消化具有克隆到pBluescript SK(-)載體中由SEQ.ID.No 2所示堿基序列的βig-h3 cDNA(pBS βig-h3；通過克隆人皮膚乳頭瘤細(xì)胞的cDNA得到的)，從而制備了具有平末端的DNA片段。將上述DNA片段亞克隆到pET-29β載體(購自Novagen)的EcoRV和EcoRI位點中。分離具有SEQ.ID.No 3所示βig-h3第69-653位氨基酸的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并命名為人βig-h3。
接著，用NamHI和Xho I消化βig-h3 cDNA，從而制備了具有SEQ.ID.No 4所示堿基序列的DNA片段。將上述DNA片段亞克隆到pET-29β載體的BamHI和Xho I位點中。分離具有SEQ.ID.No 5所示βig-h3第23-641位氨基酸的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并命名為小鼠βig-h3。
為了表達(dá)上述人和小鼠βig-h3蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化子在含卡那霉素(50g/ml)的LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)至它們的OD595達(dá)到0.5-0.6。在培養(yǎng)過程中，通過使用1mM異丙基-β-D-(-)-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)于37℃處理3小時來誘導(dǎo)βig-h3蛋白質(zhì)的表達(dá)。
將大腸桿菌細(xì)胞沉淀重懸于細(xì)胞裂解緩沖液(50mM Tris-HCl pH8.0、100mM NaCl、1mM EDTA、1％Triton X-100、1mM甲苯磺酰氟化物(下文稱為“PMSF”)和0.5mM DTT)，然后通過超聲處理進(jìn)行破碎。將該流程重復(fù)5次。
將上述溶液離心，并將含有βig-h3的不溶性內(nèi)含體溶于含0.5MNaCl、5mM咪唑和8M尿素的20mM Tris-HCl緩沖液中。使用Ni-NTA樹脂(Qiagen)純化蛋白質(zhì)。為了純化，將蛋白質(zhì)接連在尿素濃度由高至低的含50mM NaCl的20mM Tris-HCl緩沖液中透析，并通過SDS-PAGE確認(rèn)結(jié)果。
結(jié)果是，證實了本發(fā)明的人βig-h3和小鼠βig-h3蛋白質(zhì)得到了純化(圖2)。
<1-2>βig-h3 D-IV(1x)和βig-h3 D-IV(4x)的構(gòu)建和分離通過PCR擴(kuò)增SEQ.ID.No 6所示DNA片段，該片段編碼第四個結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于SEQ.ID.No 1所示人βig-h3的第498-637位氨基酸。將PCR產(chǎn)物克隆到pET-29β載體中以構(gòu)建第四個結(jié)構(gòu)域的表達(dá)載體。本發(fā)明人將第四個結(jié)構(gòu)域的表達(dá)載體命名為“βig-h3 D-IV”。
通過PCR合成對應(yīng)于第四個結(jié)構(gòu)域的堿基序列，并使用Klenow片段將PCR產(chǎn)物的3’末端補平。將該PCR產(chǎn)物插入上述表達(dá)載體pβig-h3 D-IV的EcoRV位點，并命名為pβig-h3 D-IV(2x)。用EcoR V和Xho I消化pβig-h3 D-IV(2x)的插入片段，并使用Klenow片段將片段的3’末端補平。將該片段插入pβig-h3 D-IV的EcoRV位點，并命名為pβig-h3 D-IV(3x)。同樣，將具有補平的3’末端的片段插入pβig-h3 D-IV(2x)的EcoR V位點，并命名為pβig-h3 D-IV(4x)(圖3)。通過將6個組氨酸殘基連接到DNA片段的羧基末端而制備了His標(biāo)簽，從而能夠用Ni-NTA樹脂(Qiagen)純化蛋白質(zhì)。
用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化子在含卡那霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。將大腸桿菌細(xì)胞沉淀重懸于細(xì)胞裂解緩沖液(50mM Tris-HCl pH8.0、100mM NaCl、1mM EDTA、1％TritonX-100、1mM甲苯磺酰氟化物(下文稱為“PMSF”)和0.5mM DTT)，然后通過超聲處理進(jìn)行破碎。將該流程重復(fù)5次。將上述溶液離心以獲得上清液。使用Ni-NTA樹脂(Qiagen)由上清液純化蛋白質(zhì)，并通過SDS-PAGE確認(rèn)。
結(jié)果是，證實了具有SEQ.ID.No 7所示氨基酸序列的βig-h3 D-IV(1x)、具有SEQ.ID.No 8所示氨基酸序列的βig-h3 D-IV(2x)、具有SEQ.ID.No 9所示氨基酸序列的βig-h3 D-IV(3x)、和具有SEQ.ID.No10所示氨基酸序列的βig-h3 D-IV(4x)，這些蛋白質(zhì)都得到了表達(dá)。所有上述蛋白質(zhì)都包含人βig-h3的第四個結(jié)構(gòu)域(圖4)。
<1-3>一抗的制備和分離使用實施例<1-1>中分離的人βig-h3和小鼠βig-h3蛋白質(zhì)作為抗原來制備一抗。將蛋白質(zhì)皮下注射到兔的背部。對于第一次注射，將200μg蛋白質(zhì)與弗氏完全佐劑混合，然后注射。對于第2次至第5次注射，將100μg蛋白質(zhì)與弗氏不完全佐劑混合，然后間隔3周注射。收集靜脈血，并于室溫放置2小時。離心(10,000xg，10分鐘)后，獲得含有一抗的上清液。將上清液保存于-20℃以待進(jìn)一步使用(圖5)。
實施例2人βig-h3蛋白質(zhì)的包被濃度和抗體的數(shù)量比率的確定<2-1>一抗的數(shù)量比率的確定為了確定抗人βig-h3蛋白質(zhì)一抗的數(shù)量比率，用20mM碳酸鹽-碳酸氫鹽溶液(pH9.6，含0.02％疊氮化鈉)稀釋人βig-h3(0.5μg/ml)。將βig-h3溶液加到96孔板的各個孔中(200μl/孔)，并于4℃包被過夜。用稀釋液(鹽水-磷酸鹽緩沖液/吐溫80)將抗人βig-h3一抗梯度稀釋至1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶2000和1∶3200，并加到經(jīng)過包被的96孔板中。將二抗(1∶5000)也加到其中，并于室溫反應(yīng)1.5小時。將底物溶液(如下制備將鄰苯二胺溶于甲醇(10mg/ml)，用蒸餾水稀釋至1∶100，并與10μl 30％過氧化氫溶液混合)也加到其中，并于室溫反應(yīng)1小時。加入50μl 8N硫酸溶液終止反應(yīng)，并進(jìn)行ELISA(O.D 492nm)。
結(jié)果是，證實了抗人βig-h3一抗的最佳數(shù)量比率是1∶1600和1∶2000(圖7)。
<2-2>二抗的數(shù)量比率的確定為了確定二抗的數(shù)量比率，用人βig-h3蛋白質(zhì)(0.5μg/ml)包被平板。將抗人βig-h3一抗加到其中(1∶1600和1∶2000)。加入二抗(分別為1∶1000、1∶2000和1∶3000)并進(jìn)行反應(yīng)。使用與上文實施例<2-1>相同的方法進(jìn)行ELISA。
結(jié)果是，證實了二抗的最佳數(shù)量比率是1∶2000(圖8)。
<2-3>人βig-h3蛋白質(zhì)的包被濃度的確定為了確定人βig-h3蛋白質(zhì)的包被濃度，將抗人βig-h3一抗稀釋至1∶2000，將二抗稀釋至1∶2000，用人βig-h3蛋白質(zhì)(分別為0.5μg/ml和1.0μg/ml)包被平板，然后進(jìn)行ELISA。
結(jié)果是，證實了1.0μg/ml和0.5μg/ml都是人βig-h3蛋白質(zhì)的合適濃度，但是0.5μg/ml作為包被濃度來說是更優(yōu)選的，因為該濃度下R2值最接近1(圖9)。
根據(jù)上述結(jié)果，本發(fā)明人決定了人βig-h3標(biāo)準(zhǔn)蛋白的最佳包被濃度是0.5μg/ml，而抗人βig-h3一抗和二抗的最佳稀釋比率皆為1∶2000。
通過由下文<數(shù)學(xué)公式1>表述的Robard公式(Robard，1971)，將由上述結(jié)果獲得的數(shù)值進(jìn)行l(wèi)og轉(zhuǎn)化。結(jié)果是，由11ng/ml至900ng/ml形成一條線，這是測量的可能范圍。還證實了甚至10ng/ml的范圍在上述反應(yīng)條件下仍有可能進(jìn)行測量(圖10)。
<數(shù)學(xué)公式1>
log b＝log eb/(100-b)在上文公式中，b表示相對于各個濃度的不含任何抗原的孔的OD的百分比。
實施例3通過交叉測試測量小鼠βig-h3、重組βig-h3 D-IV(1x)和βig-h3 D-IV(4x)的數(shù)量范圍本發(fā)明人還使用小鼠βig-h3、重組βig-h3 D-IV(1x)和βig-h3 D-IV(4x)確定了蛋白質(zhì)的濃度以及一抗和二抗的數(shù)量比率。具體而言，就是確定了實驗中各種蛋白質(zhì)的包被濃度均為0.5μg/ml，而且抗人βig-h3一抗和二抗的數(shù)量比率均為1∶2000。將抗小鼠βig-h3一抗和二抗的數(shù)量比率也均調(diào)整為1∶2000。
結(jié)果是，所有情況都得到了直線圖，說明上述比率是最佳的，而且它們的范圍在11ng/ml和900ng/ml之間，意味著在此測量范圍內(nèi)沒有太大差異(圖11和圖12)。
根據(jù)上述結(jié)果，證實了標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)可以是人βig-h3、小鼠βig-h3、重組βig-h3 D-IV(1x)和βig-h3 D-IV(4x)中的任一種，而抗人βig-h3抗體或抗小鼠βig-h3抗體可以用作一抗。
實施例4腎病與βig-h3表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)<4-1>測量糖尿病患者中的βig-h3根據(jù)βig-h3表達(dá)是由在腎病發(fā)展中發(fā)揮重要作用的TGF-β所誘導(dǎo)的這一事實，本發(fā)明人已證實了腎病與βig-h3表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)。為了證明這一點，測量糖尿病患者尿液中βig-h3的量。具體而言，就是將110μl糖尿病患者的尿液與110μl一抗(1∶1000)在圓底平板中混合，并于37℃保溫1小時。將200μl上述混合物添加到經(jīng)βig-h3包被的平板上，并于室溫反應(yīng)30分鐘。加入二抗-底物終止液終止反應(yīng)，并進(jìn)行ELISA(O.D492nm)。
<表1>
糖尿病患者尿液中的βig-h3濃度
結(jié)果是，包括微蛋白尿的糖尿病樣腎病患者尿液中βig-h3的量比正常人高大約5倍。一些未患腎病的糖尿病患者也顯示βig-h3的量比正常的高。根據(jù)上述結(jié)果，尿液中的βig-h3水平似乎反映了腎臟損傷的程度，而一些未患腎病的糖尿病患者所具有的高水平βig-h3則說明他們的腎早已受到一定程度的損傷，盡管尚未顯示任何臨床癥狀。因此，測量患者尿液中βig-h3的量是一種高度靈敏且重要的診斷方法，它能夠反映早期的腎臟損傷。
<4-2>測量糖尿病動物模型中的βig-h3為了確認(rèn)糖尿病患者尿液中的βig-h3濃度是否能夠反映早期的腎臟損傷，本發(fā)明人測量了糖尿病動物中βig-h3的量。
通過將一種誘發(fā)糖尿病的藥物鏈佐星(60mg/kg)注射到大鼠的腹膜腔內(nèi)，在Sprague-Dawley(SD)大鼠中誘發(fā)了糖尿病。通過測量大鼠的血糖而確認(rèn)誘發(fā)了糖尿病。在誘發(fā)糖尿病后第5天由大鼠采集尿樣，并使用與實施例<4-1>相同的方法測量βig-h3的量。
結(jié)果是，在誘發(fā)糖尿病5天后βig-h3的量增加了4倍(56.9±6.4ng/mg肌酸230.4±131.8ng/mg肌酸，圖13)。觀察誘發(fā)糖尿病后各個個體中βig-h3量的變化，發(fā)現(xiàn)誘發(fā)糖尿病后導(dǎo)致尿液中βig-h3的量大大增加(圖14)。在誘發(fā)糖尿病后第5天，血尿和肌酸是正常的，而且腎組織看上去是正常的。因此，在誘發(fā)糖尿病第5天尿液中βig-h3量的大大增加說明腎臟早已受到微小損傷，而這是常規(guī)方法所檢測不到的。
<4-3>測量腎移植患者中的βig-h3本發(fā)明人通過測量患者在腎移植之前和之后尿液中βig-h3的量而證實了腎臟損傷與βig-h3的量之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果見表2。
<表2>
患者在腎移植之前和之后βig-h3濃度的變化
結(jié)果是，手術(shù)前患者的高βig-h3量在手術(shù)成功后逐漸下降。但是在5號患者的情況中，他的腎功能甚至在腎移植之后也未恢復(fù)，βig-h3的量仍然很高。根據(jù)所有上述結(jié)果，可以肯定βig-h3的量靈敏的反映了腎臟損傷的程度。
<4-4>測量腎衰竭患者中的βig-h3本發(fā)明人測量了腎衰竭患者尿液中βig-h3的量。結(jié)果是，所有那些患者都顯示他們的尿樣中有大量的βig-h3(表3)。
<表3>
腎衰竭患者尿液中的βig-h3濃度
<4-5>測量腎相關(guān)疾病患者中的βig-h3為了調(diào)查腎病患者中βig-h3的表達(dá)是否不同，本發(fā)明人使用與實施例<4-1>相同的方法測量了由腎移植后顯示正常癥狀的患者、所移植的腎臟較小的患者、顯示慢性排斥的患者、腎盂炎復(fù)發(fā)的患者和具有cyclosphorine毒性的患者采集的尿液中的βig-h3濃度。
結(jié)果是，腎移植后癥狀正常的患者顯示βig-h3濃度平均為34.9ng/mg肌酸，而有慢性排斥、復(fù)發(fā)性腎盂炎和cyclosphorine毒性的患者都顯示βig-h3濃度大大增加(分別為140.8、175.4和90.9ng/mg肌酸)(圖15，表4)。
<表4>
本發(fā)明人還調(diào)查了復(fù)發(fā)腎病患者中升高的βig-h3濃度在治療生效時是否再次下降。結(jié)果，通過血漿交換來治療腎移植后復(fù)發(fā)性腎盂炎的患者的尿液βig-h3濃度逐漸降低，說明尿液βig-h3濃度在治療生效時下降。因此，βig-h3濃度可以用作治療反應(yīng)的標(biāo)志(圖16)。
<4-6>分析腎移植對βig-h3濃度的影響為了調(diào)查腎移植后尿液βig-h3濃度的變化，本發(fā)明人測量了接受腎移植患者每天的尿液βig-h3濃度。
結(jié)果是，不管腎是來自活著的人還是腦死亡的人，成功接受腎移植的患者的尿液βig-h3濃度都逐漸下降。確切的說，對于接受來自活著的人的腎，尿液βig-h3濃度在移植后4-5天內(nèi)恢復(fù)到正常水平，而對于接受來自腦死亡的人的腎，βig-h3濃度在6-7天內(nèi)恢復(fù)到正常水平(圖17)。
此外，對于接受小腎的患者，尿液βig-h3濃度在移植后恢復(fù)到正常水平，盡管他們的血液肌酸值仍然偏高，說明移植的腎工作正常，盡管它因尺寸較小而不能將廢棄產(chǎn)物徹底過濾掉。無論如何，反映腎臟損傷程度的βig-h3濃度恢復(fù)到了正常水平(圖17)。同時，腎移植不成功的患者的尿液βig-h3濃度則波動很大。
根據(jù)這些結(jié)果，尿液βig-h3濃度可以作為早期腎病診斷的有效標(biāo)志，用于檢測腎病的發(fā)展和用于確定治療效果，因為βig-h3濃度很好的反映了腎臟損傷。
因此，本發(fā)明人證實了尿液βig-h3濃度靈敏的反映了早期的腎臟損傷，而且對于診斷多種腎病而言是重要且有用的。
實施例5肝病與βig-h3表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)確定慢性肝炎患者是否會發(fā)展成肝硬化患者是非常重要的，但是至今尚無辦法。形成肝硬化最最重要的因素是TGF-β。因此，由TGF-β誘導(dǎo)表達(dá)的βig-h3在血液中的濃度可能隨著肝硬化的發(fā)展而升高。如果是這樣，那么βig-h3的量也能夠反映肝硬化的程度。事實上，通過對肝炎患者肝組織的免疫組織學(xué)測試證實了βig-h3表達(dá)隨著肝硬化的惡化而增強(qiáng)。本發(fā)明人根據(jù)慢性肝炎患者的活組織檢查結(jié)果將患者的狀況細(xì)分成幾個等級和階段，并調(diào)查了各個階段和等級的血液βig-h3濃度。具體而言，本發(fā)明人由慢性肝炎患者采集了血液，并使用與實施例<4-1>相同的方法測量了βig-h3的量。結(jié)果見表5。
<表5>慢性肝炎患者血液中βig-h3的濃度
結(jié)果是，慢性肝炎患者顯示血液βig-h3濃度比正常人高，而且較低階段和等級(1和2)的βig-h3濃度證實比較高階段和等級(3)高。第3等級和第3階段患者的狀況是已經(jīng)形成了嚴(yán)重的肝硬化，而且它的活性早已經(jīng)過峰值。同時，第1和2等級以及第1和2階段的患者顯示炎癥反應(yīng)發(fā)展非常活躍的狀況。因此，βig-h3濃度意味著肝硬化活性，因而可以通過定期測量血液βig-h3濃度來觀察肝硬化的發(fā)展。
實施例6類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與βig-h3表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)使用與實施例<4-1>相同的方法，本發(fā)明人通過測量骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑液中βig-h3的量證實了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與βig-h3表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)(表6)。
<表6>
滑液中的βig-h3濃度
結(jié)果是，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑液中觀察到高2倍的βig-h3濃度，說明測量滑液中的βig-h3濃度可能是診斷骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效方法。
實施例7心血管疾病與βig-h3表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)<7-1>測量誘發(fā)糖尿病小鼠的損傷血管中的βig-h3本發(fā)明人通過免疫組織化學(xué)方法調(diào)查了糖尿病小鼠正常和損傷血管中的βig-h3表達(dá)模式，從而證實了βig-h3表達(dá)與心血管疾病之間的關(guān)聯(lián)。
結(jié)果是，βig-h3蛋白質(zhì)在糖尿病小鼠損傷血管中的表達(dá)大大高于正常血管(圖18)。
<7-2>測量血管平滑肌細(xì)胞中由TGF-β誘導(dǎo)的βig-h3表達(dá)根據(jù)βig-h3表達(dá)是由在血管病發(fā)展中發(fā)揮重要作用的TGF-β所誘導(dǎo)的這一事實，本發(fā)明人試圖確認(rèn)βig-h3表達(dá)與心血管疾病之間的關(guān)聯(lián)。具體而言，本發(fā)明人使用與實施例<4-1>相同的方法測量了形成血管的血管平滑肌細(xì)胞中由TGF-β1誘導(dǎo)的βig-h3表達(dá)模式。
結(jié)果是，證實了βig-h3表達(dá)隨著TGF-β1的量的增加而增加(圖19)。
根據(jù)上述結(jié)果，證實了血液和組織中的βig-h3表達(dá)反映了它們的損傷。因此，本發(fā)明用于測量βig-h3蛋白質(zhì)的量的方法能夠有效用于多種心血管疾病的診斷。
工業(yè)應(yīng)用如上所述，本發(fā)明用于測量βig-h3蛋白質(zhì)的量的方法在用于測量各種體液中的βig-h3濃度時花費不多且非常精確，在本發(fā)明方法中使用人βig-h3、小鼠βig-h3、βig-h3 D-IV(1x)或βig-h3 D-IV(4x)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。βig-h3的量靈敏的反映了早期的TGF-β相關(guān)疾病，諸如腎病、肝病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和心血管疾病，使得本發(fā)明的方法能夠有效的用于檢查那些疾病的損傷和發(fā)展及其診斷。
序列表<110>再生生命工學(xué)會社<120>用于測量βig-h3蛋白質(zhì)的量的方法及使用其的診斷試劑盒<130>2fpo-10-14<160>10<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>683<212>PRT<213>人<400>1Met Ala Leu Phe Val Arg Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu15 10 15Gly Pro Ala Ala Thr Leu Ala Gly Pro Ala Lys Ser Pro Tyr Gln Leu20 25 30Val Leu Gln His Ser Arg Leu Arg Gly Arg Gln His Gly Pro Asn Val354045Cys Ala Val Gln Lys Val Ile Gly Thr Asn Arg Lys Tyr Phe Thr Asn50 5560Cys Lys Gln Trp Tyr Gln Arg Lys Ile Cys Gly Lys Ser Thr Val Ile657075 80Ser Tyr Glu Cys Cys Pro Gly Tyr Glu Lys Val Pro Gly Glu Lys Gly85 90 95Cys Pro Ala Ala Leu Pro Leu Ser Asn Leu Tyr Glu Thr Leu Gly Val100 105 110Val Gly Ser Thr Thr Thr Gln Leu Tyr Thr Asp Arg Thr Glu Lys Leu115 120 125Arg Pro Glu Met Glu Gly Pro Gly Ser Phe Thr Ile Phe Ala Pro Ser130 135 140Asn Glu Ala Trp Ala Ser Leu Pro Ala Glu Val Leu Asp Ser Leu Val
145 150 155 160Ser Asn Val Asn Ile Glu Leu Leu Asn Ala Leu Arg Tyr His Met Val165 170 175Gly Arg Arg Val Leu Thr Asp Glu Leu Lys His Gly Met Thr Leu Thr180 185 190Ser Met Tyr Gln Asn Ser Asn Ile Gln Ile His His Tyr Pro Asn Gly195 200 205Ile Val Thr Val Asn Cys Ala Arg Leu Leu Lys Ala Asp His His Ala210 215 220Thr Asn Gly Val Val His Leu Ile Asp Lys Val Ile Ser Thr Ile Thr225 230 235 240Asn Asn Ile Gln Gln Ile Ile Glu Ile Glu Asp Thr Phe Glu Thr Leu245 250 255Arg Ala Ala Val Ala Ala Ser Gly Leu Asn Thr Met Leu Glu Gly Asn260 265270Gly Gln Tyr Thr Leu Leu Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Ile275 280285Pro Ser Glu Thr Leu Asn Arg Ile Leu Gly Asp Pro Glu Ala Leu Arg290 295300Asp Leu Leu Asn Asn His Ile Leu Lys Ser Ala Met Cys Ala Glu Ala305 310 315 320Ile Val Ala Gly Leu Ser Val Glu Thr Leu Glu Gly Thr Thr Leu Glu325 330 335Val Gly Cys Ser Gly Asp Met Leu Thr Ile Asn Gly Lys Ala Ile Ile340 345 350Ser Asn Lys Asp Ile Leu Ala Thr Asn Gly Val Ile His Tyr Ile Asp355 360 365Glu Leu Leu Ile Pro Asp Ser Ala Lys Thr Leu Phe Glu Leu Ala Ala370 375 380Glu Ser Asp Val Ser Thr Ala Ile Asp Leu Phe Arg Gln Ala Gly Leu385 390 395 400
Gly Asn His Leu Ser Gly Ser Glu Arg Leu Thr Leu Leu Ala Pro Leu405 410 415Asn Ser Val Phe Lys Asp Gly Thr Pro Pro Ile Asp Ala His Thr Arg420 425 430Asn Leu Leu Arg Asn His Ile Ile Lys Asp Gln Leu Ala Ser Lys Tyr435440 445Leu Tyr His Gly Gln Thr Leu Glu Thr Leu Gly Gly Lys Lys Leu Arg450455 460Val Phe Val Tyr Arg Asn Ser Leu Cys Ile Glu Asn Ser Cys Ile Ala465 470 475 480Ala His Asp Lys Arg Gly Arg Tyr Gly Thr Leu Phe Thr Met Asp Arg485 490 495Val Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp500 505 510Asn Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr515 520 525Glu Thr Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn530 535 540Glu Ala Phe Arg Ala Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly545 550 555 560Asp Ala Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu565 570 575Ile Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu580 585 590Gln Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val595 600 605Asn Lys Glu Pro Val Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val610 615 620Val His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn Arg Pro Gln625 630 635 640Glu Arg Gly Asp Glu Leu Ala Asp Ser Ala Leu Glu Ile Phe Lys Gln645 650 655
Ala Ser Ala Phe Ser Arg Ala Ser Gln Arg Ser Val Arg Leu Ala Pro660 665 670Val Tyr Gln Lys Leu Leu Glu Arg Met Lys His675 680<210>2<211>2691<212>DNA<213>人<400>2gcttgcccgt cggtcgctag ctcgctcggt gcgcgtcgtc ccgctccatg gcgctcttcg 60tgcggctgct ggctctcgcc ctggctctgg ccctgggccc cgccgcgacc ctggcgggtc120ccgccaagtc gccctaccag ctggtgctgc agcacagcag gctccggggc cgccagcacg180gccccaacgt gtgtgctgtg cagaaggtta ttggcactaa taggaagtac ttcaccaact240gcaagcagtg gtaccaaagg aaaatctgtg gcaaatcaac agtcatcagc tacgagtgct300gtcctggata tgaaaaggtc cctggggaga agggctgtcc agcagcccta ccactctcaa360acctttacga gaccctggga gtcgttggat ccaccaccac tcagctgtac acggaccgca420cggagaagct gaggcctgag atggaggggc ccggcagctt caccatcttc gcccctagca480acgaggcctg ggcctccttg ccagctgaag tgctggactc cctggtcagc aatgtcaaca540ttgagctgct caatgccctc cgctaccata tggtgggcag gcgagtcctg actgatgagc600tgaaacacgg catgaccctc acctctatgt accagaattc caacatccag atccaccact660atcctaatgg gattgtaact gtgaactgtg cccggctcct gaaagccgac caccatgcaa720ccaacggggt ggtgcacctc atcgataagg tcatctccac catcaccaac aacatccagc780agatcattga gatcgaggac acctttgaga cccttcgggc tgctgtggct gcatcagggc840tcaacacgat gcttgaaggt aacggccagt acacgctttt ggccccgacc aatgaggcct900tcgagaagat ccctagtgag actttgaacc gtatcctggg cgacccagaa gccctgagag960acctgctgaa caaccacatc ttgaagtcag ctatgtgtgc tgaagccatc gttgcggggc 1020
tgtctgtaga gaccctggag ggcacgacac tggaggtggg ctgcagcggg gacatgctca 1080ctatcaacgg gaaggcgatc atctccaata aagacatcct agccaccaac ggggtgatcc 1140actacattga tgagctactc atcccagact cagccaagac actatttgaa ttggctgcag 1200agtctgatgt gtccacagcc attgaccttt tcagacaagc cggcctcggc aatcatctct 1260ctggaagtga gcggttgacc ctcctggctc ccctgaattc tgtattcaaa gatggaaccc 1320ctccaattga tgcccataca aggaatttgc ttcggaacca cataattaaa gaccagctgg 1380cctctaagta tctgtaccat ggacagaccc tggaaactct gggcggcaaa aaactgagag 1440tttttgttta tcgtaatagc ctctgcattg agaacagctg catcgcggcc cacgacaaga 1500gggggaggta cgggaccctg ttcacgatgg accgggtgct gaccccccca atggggactg 1560tcatggatgt cctgaaggga gacaatcgct ttagcatgct ggtagctgcc atccagtctg 1620caggactgac ggagaccctc aaccgggaag gagtctacac agtctttgct cccacaaatg 1680aagccttccg agccctgcca ccaagagaac ggagcagact cttgggagat gccaaggaac 1740ttgccaacat cctgaaatac cacattggtg atgaaatcct ggttagcgga ggcatcgggg 1800ccctggtgcg gctaaagtct ctccaaggtg acaagctgga agtcagcttg aaaaacaatg 1860tggtgagtgt caacaaggag cctgttgccg agcctgacat catggccaca aatggcgtgg 1920tccatgtcat caccaatgtt ctgcagcctc cagccaacag acctcaggaa agaggggatg 1980aacttgcaga ctctgcgctt gagatcttca aacaagcatc agcgttttcc agggcttccc 2040agaggtctgt gcgactagcc cctgtctatc aaaagttatt agagaggatg aagcattagc 2100ttgaagcact acaggaggaa tgcaccacgg cagctctccg ccaatttctc tcagatttcc 2160acagagactg tttgaatgtt ttcaaaacca agtatcacac tttaatgtac atgggccgca 2220ccataatgag atgtgagcct tgtgcatgtg ggggaggagg gagagagatg tactttttaa 2280atcatgttcc ccctaaacat ggctgttaac ccactgcatg cagaaacttg gatgtcactg 2340cctgacattc acttccagag aggacctatc ccaaatgtgg aattgactgc ctatgccaag 2400
tccctggaaa aggagcttca gtattgtggg gctcataaaa catgaatcaa gcaatccagc 2460ctcatgggaa gtcctggcac agtttttgta aagcccttgc acagctggag aaatggcatc 2520attataagct atgagttgaa atgttctgtc aaatgtgtct cacatctaca cgtggcttgg 2580aggcttttat ggggccctgt ccaggtagaa aagaaatggt atgtagagct tagatttccc 2640tattgtgaca gagccatggt gtgtttgtaa taataaaacc aaagaaacat a 2691<210>3<211>585<212>PRT<213>人<220>
<221>肽<222>(1)..(585)<223>人ID No.1的69-653氨基酸序列<400>3Tyr Gln Arg Lys Ile Cys Gly Lys Ser Thr Val Ile Ser Tyr Glu Cys1 5 10 15Cys Pro Gly Tyr Glu Lys Val Pro Gly Glu Lys Gly Cys Pro Ala Ala20 25 30Leu Pro Leu Ser Asn Leu Tyr Glu Thr Leu Gly Val Val Gly Ser Thr3540 45Thr Thr Gln Leu Tyr Thr Asp Arg Thr Glu Lys Leu Arg Pro Glu Met50 5560Glu Gly Pro Gly Ser Phe Thr Ile Phe Ala Pro Ser Asn Glu Ala Trp65 70 7580Ala Ser Leu Pro Ala Glu Val Leu Asp Ser Leu Val Ser Asn Val Asn85 9095Ile Glu Leu Leu Asn Ala Leu Arg Tyr His Met Val Gly Arg Arg Val100 105 110Leu Thr Asp Glu Leu Lys His Gly Met Thr Leu Thr Ser Met Tyr Gln115 120 125
Asn Ser Asn Ile Gln Ile His His Tyr Pro Asn Gly Ile Val Thr Val130 135 140Asn Cys Ala Arg Leu Leu Lys Ala Asp His His Ala Thr Asn Gly Val145 150 155 160Val His Leu Ile Asp Lys Val Ile Ser Thr Ile Thr Asn Asn Ile Gln165 170 175Gln Ile Ile Glu Ile Glu Asp Thr Phe Glu Thr Leu Arg Ala Ala Val180 185 190Ala Ala Ser Gly Leu Asn Thr Met Leu Glu Gly Asn Gly Gln Tyr Thr195 200 205Leu Leu Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Ile Pro Ser Glu Thr210 215 220Leu Asn Arg Ile Leu Gly Asp Pro Glu Ala Leu Arg Asp Leu Leu Asn225 230 235 240Asn His Ile Leu Lys Ser Ala Met Cys Ala Glu Ala Ile Val Ala Gly245 250 255Leu Ser Val Glu Thr Leu Glu Gly Thr Thr Leu Glu Val GIy Cys Ser260 265 270Gly Asp Met Leu Thr Ile Asn Gly Lys Ala Ile Ile Ser Asn Lys Asp275 280 285Ile Leu Ala Thr Asn Gly Val Ile His Tyr Ile Asp Glu Leu Leu Ile290 295 300Pro Asp Ser Ala Lys Thr Leu Phe Glu Leu Ala Ala Glu Ser Asp Val305 310 315 320Ser Thr Ala Ile Asp Leu Phe Arg Gln Ala Gly Leu Gly Asn His Leu325 330 335Ser Gly Ser Glu Arg Leu Thr Leu Leu Ala Pro Leu Asn Ser Val Phe340 345 350Lys Asp Gly Thr Pro Pro Ile Asp Ala His Thr Arg Asn Leu Leu Arg355 360 365Asn His Ile Ile Lys Asp Gln Leu Ala Ser Lys Tyr Leu Tyr His Gly370 375 380
Gln Thr Leu Glu Thr Leu Gly Gly Lys Lys Leu Arg Val Phe Val Tyr385 390 395 400Arg Asn Ser Leu Cys Ile Glu Asn Ser Cys Ile Ala Ala His Asp Lys405 410 415Arg Gly Arg Tyr Gly Thr Leu Phe Thr Met Asp Arg Val Leu Thr Pro420 425 430Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp Asn Arg Phe Ser435 440 445Met Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr Glu Thr Leu Asn450 455 460Arg Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Arg465 470 475 480Ala Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp Ala Lys Glu485 490 495Leu Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile Leu Val Ser500 505 510Gly Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln Gly Asp Lys515 520 525Leu Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn Lys Glu Pro530 535 540Val Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val His Val Ile545 550 555 560Thr Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn Arg Pro Gln Glu Arg Gly Asp565 570 575Glu Leu Ala Asp Ser Ala Leu Glu Ile580 585<210>4<211>1857<212>DNA<213>小鼠腦池內(nèi)A-顆粒<400>4
gcaggtcccg ccaagtcacc ctaccagctg gtgctgcagc atagccggct ccggggtcgc 60cagcacggcc ccaatgtatg tgctgtgcag aaggtcattg gcaccaacaa gaaatacttc120accaactgca agcagtggta ccagaggaag atctgcggca agtcgacagt catcagttat180gagtgctgtc ctggatatga aaaggtccca ggagagaaag gttgcccagc agctcttccg240ctctcaaatc tgtatgagac catgggagtt gtgggatcga ccaccacaca gctgtataca300gaccgcacag aaaagctgag gcctgagatg gagggacccg gaagcttcac catctttgct360cctagcaatg aggcctggtc ttccttgcct gcggaagtgc tggactccct ggtgagcaac420gtcaacatcg aactgctcaa tgctctccgc taccacatgg tggacaggcg ggtcctgacc480gatgagctca agcacggcat gaccctcacc tccatgtacc agaattccaa catccagatc540catcactatc ccaatgggat tgtaactgtt aactgtgccc ggctgctgaa ggctgaccac600catgcgacca acggcgtggt gcatctcatt gacaaggtca tttccaccat caccaacaac660atccagcaga tcattgaaat cgaggacacc tttgagacac ttcgggccgc cgtggctgca720tcaggactca ataccgtgct ggagggcgac ggccagttca cactcttggc cccaaccaac780gaggcctttg agaagatccc tgccgagacc ttgaaccgca tcctgggtga cccagaggca840ctgagagacc tgctaaacaa ccacatcctg aagtcagcca tgtgtgctga ggccattgta900gctggaatgt ccatggagac cctggggggc accacactgg aggtgggctg cagtggggac960aagctcacca tcaacgggaa ggctgtcatc tccaacaaag acatcctggc caccaacggt 1020gtcattcatt tcattgatga gctgcttatc ccagattcag ccaagacact gcttgagctg 1080gctggggaat ctgacgtctc cactgccatt gacatcctca aacaagctgg cctcgatact 1140catctctctg ggaaagaaca gttgaccttc ctggcccccc tgaattctgt gttcaaagat 1200ggtgtccctc gcatcgacgc ccagatgaag actttgcttc tgaaccacat ggtcaaagaa 1260cagttggcct ccaagtatct gtactctgga cagacactgg acacgctggg tggcaaaaag 1320ctgcgagtct ttgtttatcg aaatagcctc tgcattgaaa acagctgcat tgctgcccat 1380gataagaggg gacggtttgg gaccctgttc accatggacc ggatgttgac acccccaatg 1440
gggacagtta tggatgtcct gaagggagac aatcgtttta gcatgctggt ggccgccatc 1500cagtctgcag gactcatgga gatcctcaac cgggaagggg tctacactgt ttttgctccc 1560accaatgaag cgttccaagc catgcctcca gaagaactga acaaactctt ggcaaatgcc 1620aaggaactta ccaacatcct gaagtaccac attggtgatg aaatcctggt tagcggaggc 1680atcggggccc tggtgcggct gaagtctctc caaggggaca aactggaagt cagctcgaaa 1740aacaatgtag tgagtgtcaa taaggagcct gttgccgaaa ccgacatcat ggccacaaac 1800ggtgtggtct atgccatcaa cactgttctg cagccgccag ccaaccgacc acaagaa 1857<210>5<211>609<212>PRT<213>小鼠腦池內(nèi)A-顆粒<220>
<221>肽<222>(1)..(609)<223>小鼠的23-641氨基酸序列<400>5Ala Gly Pro Ala Lys Ser Pro Tyr Gln Leu Val Leu Gln His Ser Arg15 10 15Leu Arg Gly Arg Gln His Gly Pro Asn Val Cys Ala Val Gln Lys Val20 25 30Ile Gly Thr Asn Arg Lys Tyr Phe Thr Asn Cys Lys Gln Trp Tyr Gln3540 45Arg Lys Ile Cys Gly Lys Ser Thr Val Ile Ser Tyr Glu Cys Cys Pro50 5560Gly Tyr Glu Lys Val Pro Gly Glu Lys Gly Cys Pro Ala Ala Leu Pro65 70 7580Leu Ser Asn Leu Tyr Glu Thr Leu Gly Val Val Gly Ser Thr Thr Thr85 9095Gln Leu Tyr Thr Asp Arg Thr Glu Lys Leu Arg Pro Glu Met Glu Gly
100 105 110Pro Gly Ser Phe Thr Ile Phe Ala Pro Ser Asn Glu Ala Trp Ala Ser115 120 125Leu Pro Ala Glu Val Leu Asp Ser Leu Val Ser Asn Val Asn Ile Glu130 135 140Leu Leu Asn Ala Leu Arg Tyr His Met Val Gly Arg Arg Val Leu Thr145 150 155 160Asp Glu Leu Lys His Gly Met Thr Leu Thr Ser Met Tyr Gln Asn Ser165 170 175Asn Ile Gln Ile His His Tyr Pro Asn Gly Ile Val Thr Val Asn Cys180 185 190Ala Arg Leu Leu Lys Ala Asp His His Ala Thr Asn Gly Val Val His195 200 205Leu Ile Asp Lys Val Ile Ser Thr Ile Thr Asn Asn Ile Gln Gln Ile210 215 220Ile Glu Ile Glu Asp Thr Phe Glu Thr Leu Arg Ala Ala Val Ala Ala225 230 235 240Ser Gly Leu Asn Thr Met Leu Glu Gly Asn Gly Gln Tyr Thr Leu Leu245 250 255Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Ile Pro Ser Glu Thr Leu Asn260 265 270Arg Ile Leu Gly Asp Pro Glu Ala Leu Arg Asp Leu Leu Asn Asn His275 280 285Ile Leu Lys Ser Ala Met Cys Ala Glu Ala Ile Val Ala Gly Leu Ser290 295 300Val Glu Thr Leu Glu Gly Thr Thr Leu Glu Val Gly Cys Ser Gly Asp305 310 315 320Met Leu Thr Ile Asn Gly Lys Ala Ile Ile Ser Asn Lys Asp Ile Leu325 330 335Ala Thr Asn Gly Val Ile His Tyr Ile Asp Glu Leu Leu Ile Pro Asp340 345 350
Ser Ala Lys Thr Leu Phe Glu Leu Ala Ala Glu Ser Asp Val Ser Thr355 360 365Ala Ile Asp Leu Phe Arg Gln Ala Gly Leu Gly Asn His Leu Ser Gly370 375 380Ser Glu Arg Leu Thr Leu Leu Ala Pro Leu Asn Ser Val Phe Lys Asp385 390 395 400Gly Thr Pro Pro Ile Asp Ala His Thr Arg Asn Leu Leu Arg Asn His405 410 415Ile Ile Lys Asp Gln Leu Ala Ser Lys Tyr Leu Tyr His Gly Gln Thr420 425 430Leu Glu Thr Leu Gly Gly Lys Lys Leu Arg Val Phe Val Tyr Arg Asn435 440 445Ser Leu Cys Ile Glu Asn Ser Cys Ile Ala Ala His Asp Lys Arg Gly450 455 460Arg Tyr Gly Thr Leu Phe Thr Met Asp Arg Val Leu Thr Pro Pro Met465 470 475 480Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp Asn Arg Phe Ser Met Leu485 490 495Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr Glu Thr Leu Asn Arg Glu500 505 510Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Arg Ala Leu515 520 525Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp Ala Lys Glu Leu Ala530 535 540Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile Leu Val Ser Gly Gly545 550 555 560Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln Gly Asp Lys Leu Glu565 570 575Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn Lys Glu Pro Val Ala580 585 590Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val His Val Ile Thr Asn595 600 605
Val<210>6<211>391<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>βig-h3 D-IV<400>6gtttgggacc ctgttcacca tggaccggat gttgacaccc ccaatgggga cagttatgga 60tgtcctgaag ggagacaatc gttttagcat gctggtggcc gccatccagt ctgcaggact120catggagatc ctcaaccggg aaggggtcta cactgttttt gctcccacca atgaagcgtt180ccaagccatg cctccagaag aactgaacaa actcttggca aatgccaagg aacttaccaa240catcctgaag taccacattg gtgatgaaat cctggttagc ggaggcatcg gggccctggt300gcggctgaag tctctccaag gggacaaact ggaagtcagc tcgaaaaaca atgtagtgag360tgtcaataag gagcctgttg ccgaaaccga c 391<210>7<211>140<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>βig-h3 D-IV(1x)氨基酸序列<400>7Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp Asn15 1015Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr Glu20 25 30Thr Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Glu
35 40 45Ala Phe Arg Ala Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp50 55 60Ala Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile65 70 75 80Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln85 90 95Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn100 105 110Lys Glu Pro Val Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val115 120 125His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn130 135 140<210>8<211>280<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>βig-h3 D-IV(2x)氨基酸序列<400>8Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp Asn15 10 15Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr Glu2025 30Thr Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Glu3540 45Ala Phe Arg Ala Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp50 55 60Ala Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile65 70 75 80Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln
85 9095Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn100 105 110Lys Glu Pro Val Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val115 120 125His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn Leu Thr Pro Pro130 135 140Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp Asn Arg Phe Ser Met145 150 155 160Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr Glu Thr Leu Asn Arg165 170 175Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Arg Ala180 185 190Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp Ala Lys Glu Leu195 200 205Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile Leu Val Ser Gly210 215 220Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln Gly Asp Lys Leu225 230 235 240Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn Lys Glu Pro Val245 250 255Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val His Val Ile Thr260 265 270Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn275 280<210>9<211>420<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>βig-h3 D-IV(3x)氨基酸序列
<400>9Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp Asn15 1015Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr Glu20 25 30Thr Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Glu35 4045Ala Phe Arg Ala Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp50 55 60Ala Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile65 70 75 80Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln8590 95Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn100 105 110Lys Glu Pro Val Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val115120 125His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn Leu Thr Pro Pro130 135 140Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp Asn Arg Phe Ser Met145 150 155 160Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr Glu Thr Leu Asn Arg165 170 175Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Arg Ala180 185 190Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp Ala Lys Glu Leu195 200 205Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile Leu Val Ser Gly210 215 220Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln Gly Asp Lys Leu225 230 235 240
Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn Lys Glu Pro Val245 250 255Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val His Val Ile Thr260 265 270Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val275 280 285Met Asp Val Leu Lys Gly Asp Asn Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala290 295 300Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr Glu Thr Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr305 310 315 320Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Arg Ala Leu Pro Pro Arg325 330 335Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp Ala Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu340 345 350Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala355 360 365Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Leu370 375 380Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn Lys Glu Pro Val Ala Glu Pro Asp385 390 395 400Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln405 410 415Pro Pro Ala Asn420<210>10<211>560<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>βig-h3 D-IV(4x)氨基酸序列<400>10
Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp Asn15 1015Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr Glu20 25 30Thr Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Glu35 40 45Ala Phe Arg Ala Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp50 55 60Ala Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile65 70 7580Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln85 9095Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn100 105 110Lys Glu Pro Val Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val115 120 125His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn Leu Thr Pro Pro130 135 140Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp Asn Arg Phe Ser Met145 150 155 160Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr Glu Thr Leu Asn Arg165 170 175Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Arg Ala180 185 190Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp Ala Lys Glu Leu195 200 205Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile Leu Val Ser Gly210 215 220Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln Gly Asp Lys Leu225 230 235 240Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn Lys Glu Pro Val245 250 255
Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val His Val Ile Thr260 265 270Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val275 280 285Met Asp Val Leu Lys Gly Asp Asn Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala290 295 300Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr Glu Thr Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr305 310 315 320Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Arg Ala Leu Pro Pro Arg325 330 335Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp Ala Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu340 345 350Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala355 360 365Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Leu370 375 380Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn Lys Glu Pro Val Ala Glu Pro Asp385 390 395 400Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln405 410 415Pro Pro Ala Asn Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu420 425 430Lys Gly Asp Asn Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala435 440 445Gly Leu Thr Glu Thr Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala450 455 460Pro Thr Asn Glu Ala Phe Arg Ala Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg465 470 475 480Leu Leu Gly Asp Ala Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile485 490 495Gly Asp Glu Ile Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu
500 505 510Lys Ser Leu Gln Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val515520 525Val Ser Val Asn Lys Glu Pro Val Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr530 535 540Asn Gly Val Val His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn545 550 555 560
權(quán)利要求
1.一種用于測量βig-h3蛋白質(zhì)的量的方法，其包括以下步驟1)制備βig-h3或βig-h3 fas-1結(jié)構(gòu)域的重組蛋白、其片段或衍生物；2)制備針對上述步驟1的上述重組蛋白、其片段或衍生物的特異配體；和3)通過使用上述步驟2的配體與上述步驟1的重組蛋白、其片段或衍生物的結(jié)合反應(yīng)的方法來測量樣品的βig-h3蛋白質(zhì)的量。
2.權(quán)利要求1中所述的用于測量βig-h3蛋白質(zhì)的量的方法，其中步驟1)的配體選自由抗體，RNA，DNA，脂類，蛋白質(zhì)，有機(jī)化合物和無機(jī)化合物組成的組。
3.權(quán)利要求1中所述的用于測量βig-h3蛋白質(zhì)的量的方法，其中步驟3)的特異結(jié)合反應(yīng)是抗原—抗體反應(yīng)。
4.權(quán)利要求3中所述的用于測量βig-h3蛋白質(zhì)的量的方法，其中抗原—抗體反應(yīng)是通過一種方法進(jìn)行的，所述方法選自免疫印跡，免疫沉淀，ELISA，RIA，蛋白質(zhì)芯片，快速測定法和微陣列組成的組。
5.權(quán)利要求3中所述的用于測量βig-h3蛋白質(zhì)的量的方法，其中步驟3)的抗原—抗體反應(yīng)包括以下步驟1)用由βig-h3蛋白質(zhì)或βig-h3 fas-1結(jié)構(gòu)域制備的重組蛋白、其片段或衍生物包被基質(zhì)；2)使針對上述步驟1的蛋白質(zhì)、其片段或衍生物的抗體與樣品反應(yīng)；3)將上述步驟2的反應(yīng)物加到步驟1的包被蛋白質(zhì)上，并等待反應(yīng)，然后對其進(jìn)行清洗；和4)將二抗加到上述步驟3的反應(yīng)物上，以進(jìn)一步的反應(yīng)，然后測量OD。
6.權(quán)利要求1-5之任一項中所述的用于測量βig-h3蛋白質(zhì)的量的方法，其中βig-h3蛋白質(zhì)是具有SEQ.ID.NO 3所示氨基酸序列的人βig-h3蛋白質(zhì)或具有SEQ.ID.NO 5所示氨基酸序列的小鼠βig-h3蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求1-5之任一項中所述的用于測量βig-h3蛋白質(zhì)的量的方法，其中重復(fù)連接了1或2-10個βig-h3蛋白質(zhì)的第四個fas-1結(jié)構(gòu)域。
8.權(quán)利要求7中所述的用于測量βig-h3蛋白質(zhì)的量的方法，其中βig-h3的fas-1結(jié)構(gòu)域選自由SEQ.ID.No 7，No 8，No 9和No 10所示序列組成的組。
9.權(quán)利要求1中所述的用于測量βig-h3蛋白質(zhì)的量的方法，其中所述樣品可以是任何體液，其包括尿液，血液或滑液。
10.一種用于腎病，肝病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或心血管疾病的診斷試劑盒，其包含βig-h3蛋白質(zhì)或βig-h3蛋白質(zhì)中fas-1結(jié)構(gòu)域的重組蛋白(包括其片段或其衍生物)及其配體。
11.權(quán)利要求10中所述的診斷試劑盒，其中所述配體選自由特異結(jié)合βig-h3蛋白質(zhì)，βig-h3的fas-1結(jié)構(gòu)域，其片段或衍生物的抗體，RNA，DNA，脂類，蛋白質(zhì)，有機(jī)化合物和無機(jī)化合物組成的組。
12.權(quán)利要求11中所述的診斷試劑盒，其中所述配體是抗體。
13.權(quán)利要求12中所述的診斷試劑盒，其中所述試劑盒還額外包含緩沖液，二抗，清洗液，終止液或呈色底物。
14.權(quán)利要求10中所述的診斷試劑盒，其中βig-h3蛋白質(zhì)是具有SEQ.ID.NO 3所示氨基酸序列的人βig-h3蛋白質(zhì)或具有SEQ.ID.NO 5所示氨基酸序列的小鼠βig-h3蛋白質(zhì)。
15.權(quán)利要求10中所述的診斷試劑盒，其中重復(fù)連接了1或2-10個βig-h3蛋白質(zhì)的第四個fas-1結(jié)構(gòu)域。
16.權(quán)利要求15中所述的診斷試劑盒，其中βig-h3的fas-1結(jié)構(gòu)域選自由SEQ.ID.No 7，No 8，No 9和No 10所示序列組成的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于測量 βig－h(huán)3蛋白質(zhì)的量的方法以及使用該方法的診斷試劑盒。具體而言，本發(fā)明涉及通過βig－h(huán)3蛋白質(zhì)或βig－h(huán)3蛋白質(zhì)中fas－1結(jié)構(gòu)域的重組蛋白(包括其片段或其衍生物)與其配體之間的特異結(jié)合反應(yīng)來測量體液中βig－h(huán)3蛋白質(zhì)的量的方法，還涉及用于腎病、肝病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或心血管疾病的診斷試劑盒，其包含βig－h(huán)3蛋白質(zhì)或βig－h(huán)3蛋白質(zhì)中fas－1結(jié)構(gòu)域的重組蛋白(包括其片段或其衍生物)及其配體。本發(fā)明的方法和試劑盒能夠有效的作為用于診斷腎病、肝病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或心血管疾病的損傷和發(fā)展程度的靈敏診斷方法。
文檔編號C07K14/435GK1625687SQ02828782
公開日2005年6月8日 申請日期2002年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月19日
發(fā)明者金仁山, 裴宗燮 申請人:再生生命工學(xué)會社