針對cd70的抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及以高親和力與人CD70蛋白相結(jié)合并且展示出對腫瘤細胞生長之強效抑制的抗體及其抗原結(jié)合片段。
【專利說明】針對CD70的抗體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及抗體及其抗原結(jié)合片段，其以高親和力與人CD70蛋白相結(jié)合并且表現(xiàn)出對腫瘤細胞生長的強效抑制。
【背景技術(shù)】
[0002]細胞因子受體CD27是腫瘤壞死因子受體(TFNR)超家族的成員，其在細胞生長和分化以及凋亡中起作用。⑶27的配體是⑶70，屬于配體的腫瘤壞死因子家族。⑶70為193個氨基酸的多肽，其具有20個氨基酸的親水性N端結(jié)構(gòu)域和包含2個潛在的N連接糖基化位點的 C端結(jié)構(gòu)域(Goodwin, R.G.等(1993) Cel 173:447-56 ;Bowman 等(1994) Immunol 152:1756-61)。基于這些特性，確定⑶70是具有細胞外C端部分的II型跨膜蛋白。
[0003]⑶70在活化的T和B淋巴細胞以及樹突狀細胞上瞬時地存在(Hintzen等(1994)J.1mmunol.152:1762-1773 ；0shima 等(1998)Int.1mmunol.10:517-26 ；Tesselaar 等(2003) J.1mmunol.170:33-40)。除了在正常細胞上表達外，已經(jīng)在不同類型的癌癥中報道了⑶70的表達，所述癌癥包括腎細胞癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、腦腫瘤、白血病、淋巴瘤和鼻咽癌(Junker 等(2005)J Urol.173:2150-3 ；Sloan 等(2004)Am J Pathol.164:315-23 ；Held-Feindt 和 Mentlein (2002) Int J Cancer98:352-6 ；Hishima 等(2000) Am J SurgPathol.24:742-6 ;Lens 等(1999) Br J Haematol.106:491-503)。還提出了 CD70 與 CD27 的相互作用在細胞介導(dǎo)的自身免疫疾病和TNF-α產(chǎn)生的抑制中起作用(Nakajima等(2000)J.Neuroimmunol.109: 188-96)。
[0004]因此，⑶70代表了用于治療癌癥、自身免疫疾病和由⑶70表達而表征之多種其他疾病的靶標。
[0005]W02006 / 0044643 描述了包含抗體效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域(antibody effector domain)的⑶70抗體，其可介導(dǎo)ADCC、ADCPXDC或ADC中的一個或更多個并且在未與細胞抑制劑或細胞毒性劑綴合的情況下針對表達CD70的癌癥發(fā)揮細胞抑制或細胞毒性作用或者針對表達CD70的免疫性病癥發(fā)揮免疫抑制作用。本文中示例的抗體基于兩種單克隆抗體(稱為1F6和2F2)的抗原結(jié)合區(qū)域。
[0006]W02007 / 038637描述了與⑶70結(jié)合的全人單克隆抗體。這些抗體表征為以I X 10_7M或更少的Kd與人⑶70結(jié)合。所述抗體還與表達⑶70的腎細胞癌腫瘤細胞系(例如786-0)結(jié)合并且被其內(nèi)化。
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007]本文中提供的是抗體或其抗原結(jié)合片段(本文中稱為CD70抗體)，其與人CD70蛋白質(zhì)相結(jié)合并且表現(xiàn)出與現(xiàn)有技術(shù)中描述的CD70抗體不同的且通常優(yōu)越的特性。這些抗體的優(yōu)越特性對于在人治療(特別是治療表達CD70的癌癥以及免疫病癥)中的使用是有利的。
[0008]本文所述CD70抗體的特征為為對人CD70的極高的結(jié)合親合力。與對人治療提出的最強效現(xiàn)有技術(shù)CD70抗體(包括“全人”來源的現(xiàn)有技術(shù)CD70抗體)相比，本文中描述的所有優(yōu)選實施方案對重組人CD70表現(xiàn)出顯著更高的結(jié)合親和力(如通過本文中描述的Biacore?表面等離子體共振測量的)。另外，當與對人治療提出的現(xiàn)有技術(shù)CD70抗體相比時，本文中描述的CD70抗體的所有優(yōu)選實施方案表現(xiàn)出與人細胞系(尤其是人癌細胞系)表面上表達之CD70的優(yōu)越(即更高親和力)結(jié)合。與細胞表面CD70的該優(yōu)越結(jié)合對于以“低拷貝數(shù)”表達CD70的人癌細胞系尤其相關(guān)并且與抗體在人治療中的使用直接相關(guān)。更進一步地，當與對人治療用途提出的現(xiàn)有技術(shù)CD70抗體相比時，本文中描述的CD70抗體的一些優(yōu)選實施方案表現(xiàn)出與分離自人患者之癌細胞(特別是分離自慢性淋巴細胞性白血病(CLL)患者的癌細胞)實質(zhì)上提高的結(jié)合。
[0009]因此，在本發(fā)明的第一方面中，提供了與人CD70相結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或抗原結(jié)合片段包含至少一個重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和至少一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，其中，當作為Fab片段使用本文中描述的標準Biacore?方案測試時，所述VH和VL結(jié)構(gòu)域?qū)θ薈D70表現(xiàn)出少于7X ΙΟ、—1的解離速率(off-rate)(由Biacore?測量的koff) ο
[0010]在一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體或抗原結(jié)合片段包含至少一個重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和至少一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，其中所述VH和VL結(jié)構(gòu)域?qū)θ薈D70表現(xiàn)出5X ΙΟ?或更少或者2Χ ΙΟ?或更少或者I X ΙΟΛ—1或更少的解離速率。最優(yōu)選地，當作為Fab片段測試時，所述⑶70抗體將對⑶70表現(xiàn)出0.4Χ ΙΟ、—1至4.8Χ 的解離速率。
[0011]還提供了與人⑶70相結(jié)合的抗體，所述抗體包含兩個Fab區(qū)，其中每個Fab區(qū)均與人⑶70相結(jié)合，并且當作為Fab片段測試時，對人⑶70表現(xiàn)出5X 10-4s-1或更少或者2Χ10?或更少或者ΙΧΙΟΛ1-1或更少且優(yōu)選0.4 X KT4S4至4.8 X 10?的解離速率。所述兩個Fab區(qū)在結(jié)合特性方面(例如對人CD70的親和力)可以不同或者可以是相同的。所述兩個Fab區(qū)可以與人CD70上同一表位或重疊表位相結(jié)合或者它們可以與人CD70上不同的非重疊表位相結(jié)合。在氨基酸序列方面，所述兩個Fab區(qū)可以在VH和VL結(jié)構(gòu)域之一或兩個中彼此不同。
[0012]除了對⑶70的極其高結(jié)合親和力之外，本文中提供的⑶70抗體的一些優(yōu)選實施方案可表現(xiàn)出對CD70與其配體CD27之相互作用的強效阻斷或抑制。表現(xiàn)出與CD70之高親和力結(jié)合和⑶70 /⑶27相互作用之強效阻斷二者的優(yōu)選⑶70抗體作為用于治療疾病適應(yīng)征(indication)的治療劑是特別有利的，所述疾病適應(yīng)癥中⑶70 /⑶27信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的阻斷增強治療功效(例如除通過CD70抗體的效應(yīng)子功能介導(dǎo)細胞殺傷外)，例如共表達CD70和CD27的自身免疫疾病和癌癥。
[0013]不是所有本文中描述的CD70抗體除了與CD70的高親和力結(jié)合之外還表現(xiàn)出⑶70 /⑶27相互作用的強效阻斷。本文中還描述了這樣的許多⑶70抗體，其表現(xiàn)出與⑶70以非常高的親和力結(jié)合但是沒有顯示出對⑶70 /⑶27相互作用的顯著阻斷。這些抗體的特性在本文中的其他部分描述。高親和力非阻斷性CD70抗體的可獲得性可以增加/延伸治療可能性的范圍。
[0014]本文中描述的對人CD70表現(xiàn)出非常高結(jié)合親和力的CD70抗體的一些優(yōu)選實施方案還表征為對在人治療中使用提出之現(xiàn)有技術(shù)CD70抗體未表現(xiàn)出的結(jié)合特性的組合。因此，本文中描述的一些優(yōu)選CD70抗體的特征為:
[0015](a)與人 CD70 中的氨基酸序列 HIQVTLAICSS (SEQ ID NO:342)結(jié)合；
[0016](b)與恒河猴(Macaca mulatta)和食蟹猴(Macaca cynomolgus)的 CD70 同源物有交叉反應(yīng)性；
[0017](c)與天然人⑶70和熱變性重組人⑶70 二者結(jié)合。
[0018]對在人治療中使用所提出之現(xiàn)有技術(shù)抗體未表現(xiàn)出的結(jié)合特性的該組合表明與CD70上的新表位的結(jié)合，所述新表位與現(xiàn)有技術(shù)CD70抗體結(jié)合的表位不同。[0019]在人藥物開發(fā)的情況中，一些優(yōu)選的⑶70抗體表現(xiàn)的結(jié)合特性的組合是有利的。尤其是，與猴CD70同源物的交叉反應(yīng)使得能夠在靈長類動物模型中對在人治療中使用提出的⑶70抗體進行毒理學(xué)研究。
[0020]本文中描述的一些優(yōu)選⑶70抗體還表現(xiàn)出與作為治療性抗體產(chǎn)品進行商業(yè)制造相關(guān)的有利特性。如本文中別處討論的，本文中提供的一些優(yōu)選CD70抗體在用于商業(yè)制備臨床級治療性抗體產(chǎn)品的重組表達系統(tǒng)中表現(xiàn)出極高水平的表達。采用一些優(yōu)選CD70抗體可實現(xiàn)的表達水平遠遠超過了甚至對于“全人”治療性抗體產(chǎn)品通常實現(xiàn)的水平。另外，一些優(yōu)選的CD70抗體產(chǎn)品(以適合用于在人治療中使用的形式重組表達產(chǎn)生)表現(xiàn)出顯著的熱穩(wěn)定性，其優(yōu)于通常的治療性抗體產(chǎn)品。
[0021]本文中提供的對人CD70具有優(yōu)越的結(jié)合親和力以及上文所列的其他有利特性的CD70抗體為駱駝科動物(camelid)來源的(例如，大羊駝(llama)來源的)。駱駝科動物來源的CD70抗體可以是分離的或重組表達的單克隆抗體。一些優(yōu)選的實施方案可以是人源化(或種系化)單克隆抗體(例如駱駝科動物來源之抗體的人源化變體)、嵌合抗體(例如駱駝科動物-人嵌合抗體)或人源化嵌合抗體(例如包含駱駝科動物VH和VL結(jié)構(gòu)域之人源化變體以及人抗體之恒定結(jié)構(gòu)域的嵌合抗體)。
[0022]駱駝科動物來源的⑶70抗體可包含從駱駝科(Camelidae)家族物種的VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域獲得的至少一個高變環(huán)或互補決定區(qū)。在一個特定的實施方案中，CD70抗體或其抗原結(jié)合片段可包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，其中所述VH和VL結(jié)構(gòu)域或者其一個或更多個CDR是駱駝科動物來源的。在一些特定的實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段可包含大羊駝VH和VL結(jié)構(gòu)域或大羊駝VH和VL結(jié)構(gòu)域的人種系化變體。該抗體或抗原結(jié)合片段可表現(xiàn)出本文所定義的“高人同源性”。
[0023]本文中描述的駱駝科動物來源的CD70抗體通常表現(xiàn)出與最接近的匹配人抗體種系序列具有至少 90% (例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% )序列同一性的VH和/或VL區(qū)氨基酸序列。
[0024]本發(fā)明的又一些優(yōu)選實施方案包括駱駝科動物來源之CD70抗體的人源化(或人種系化)變體。尤其是，本發(fā)明提供了本文中所述大羊駝來源之CD70抗體的人源化或人種系化變體。
[0025]在本發(fā)明的又一個方面中，提供了結(jié)合人CD70的嵌合駱駝科動物-人抗體，其中所述抗體的抗原結(jié)合部分(例如其VH和/或VL結(jié)構(gòu)域或CDR)是駱駝科動物來源的并且所述抗體的恒定區(qū)來源于人抗體。尤其是，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD70的嵌合大羊駝-人抗體。
[0026]在本發(fā)明的又一個方面中，提供了結(jié)合人CD70的嵌合駱駝科動物-人抗體的人源化變體，其中所述抗體的抗原結(jié)合部分(例如其VH和/或VL結(jié)構(gòu)域或CDR)是駱駝科動物來源之序列的人源化變體,并且抗體的恒定區(qū)來源于人抗體。尤其是,本發(fā)明提供了結(jié)合人CD70的嵌合大羊駝-人抗體的人源化變體。
[0027]通過參照特定結(jié)構(gòu)特征在以下限定⑶70抗體或其抗原結(jié)合片段的一些優(yōu)選(但非限制性)實施方案，所述結(jié)構(gòu)特征即CDR(SEQ ID NO:49~59、262或263(重鏈CDR3)或者 SEQ ID 勵:26~37、249、258 或 259(重鏈0?2)或者 SEQ ID NO: 10 ~20、248、256 或257(重鏈CDR1)中的一個或更多個，或者SEQ ID NO:148~168、271或273 (輕鏈CDR3)或者 SEQ ID NO:109 ~128 或 270 (輕鏈 CDR2)或者 SEQ ID NO:77 ~95 或 250 ~253、267 或268(輕鏈CDR1)所示的CDR序列之一)或整個可變結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:177~188、212~223、274 或 275(VH)或 SEQ ID NO:189 ~211、230 ~245、276 或 277 (VL)中的一個或更多個)的具體氨基酸序列。當作為Fab片段測試時，所有這些抗體均以高親和力與人CD70相結(jié)合，并且對人⑶70表現(xiàn)出5X ΙΟΛ-1或更少、通常為0.4 X IOV1至4.8Χ lO^s—1的解離速率。
[0028]本發(fā)明還提供了本文所限定的這些抗體的人源化/種系化變體以及親和變體和包含保守氨基酸替換的變體。特別提供的是與人抗體恒定結(jié)構(gòu)域(特別是人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)融合的、包含駱駝科動物來源之VH和VL結(jié)構(gòu)域或其人種系化變體的嵌合抗體。上文定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域可用作單結(jié)構(gòu)域抗體或者可包含在常規(guī)四鏈抗體或其他抗原結(jié)合蛋白內(nèi)，例如Fab、Fab’、F(ab’) 2、雙特異性Fab’以及Fv片段、雙抗體(diabodies)、線性抗體、單鏈抗體分子、單鏈可變片段(scFv)和多特異性抗體。
[0029]CD70抗體的一些優(yōu)選實施方案為包含這樣的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含可變重鏈⑶R3、可變重鏈⑶R2和可變重鏈⑶Rl，其中所述可變重鏈CDR3包含選自以下的 氨基酸序列:
[0030]SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:5USEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:262和SEQ ID NO:263及所示序列中任一個的序列變體，其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換；
[0031]所述可變重鏈⑶R2任選地包含選自以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:306 [X1X2X3X4XXX7XsXaYYADSVKXinI的氨基酸序列，其中
[0032]X1是任意氨基酸，優(yōu)選為D、T、S或E，
[0033]X2是任意氨基酸，優(yōu)選為I，
[0034]X3是任意氨基酸，優(yōu)選為N、S、T或Y，
[0035]X4是任意氨基酸，優(yōu)選為N、M、S或T，
[0036]X5是任意氨基酸，優(yōu)選為E、D、Y或H，
[0037]X6是任意氨基酸，優(yōu)選為G、D、S或N，
[0038]X7是任意氨基酸，優(yōu)選為G、Y、S、D或M，
[0039]X8是任意氨基酸，優(yōu)選為T、E、S、N、Y或R，
[0040]X9是任意氨基酸，優(yōu)選為T、A或R，并且
[0041]Xltl是任意氨基酸，優(yōu)選為G或S，
[0042]以及 SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:258和SEQ ID NO:259及所示序列中任一個之序列變體的氨基酸序列，其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換；以及
[0043]所述可變重鏈⑶Rl任選地包含選自以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:307 1-Χ,YYMNl的氨基酸序列，其中
[0044]X1是任意氨基酸，優(yōu)選為V、G或Α，
[0045]SEQ ID NO:3081-Χ,XoAMSl 的氨基酸序列，其中
[0046]X1是任意氨基酸，優(yōu)選為D、T、S、N或G并且
[0047]X2是任意氨基酸，優(yōu)選為Y、S或P，
[0048]以及 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO:256和SEQ ID NO:257及所示序列中任一個之序列變體的氨基酸序列，其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換。
[0049]重鏈可變結(jié)構(gòu)域可包含與可變重鏈⑶R2序列(HCDR2)中任一個和可變重鏈⑶Rl序列(HCDRl)中任一個相組合的所列可變重鏈⑶R3序列(HCDR3)中的任一個。然而，HCDR3和HCDR2和HCDRl的某些組合是尤其優(yōu)選的，這些是來源于單一常見VH結(jié)構(gòu)域的“天然”組合。這些優(yōu)選的組合列于表6和表14A中。
[0050]所述抗體或其抗原結(jié)合片段可額外地包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，其與VH結(jié)構(gòu)域配對以形成抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域是包含可變輕鏈CDR3、可變輕鏈CDR2和可變輕鏈⑶Rl的那些，其中所述可變輕鏈⑶R3包含選自以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:148,SEQ ID NO: 149,SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 153,SEQID NO:154,SEQ ID NO: 155,SEQ ID NO: 156,SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158,SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:271 和 SEQID NO:273及所示序列中任一個之序列變體，其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換；
[0051 ] 所述可變輕鏈⑶R2任選地包含選自以下的氨基酸序列:
[0052](a) SEQ ID NO:310 1-Χ,TXoMSl 的氨基酸序列，其中
[0053]X1是任意氨基酸，優(yōu)選為N或S，
[0054]X2是任意氨基酸，優(yōu)選為N、S或Α，并且
[0055]X3是任意氨基酸，優(yōu)選為S、N或Τ，
[0056](b) SEQ ID NO: 311 [YYSdSX1X2X3QX4S]的氨基酸序列，其中
[0057]X1是任意氨基酸，優(yōu)選為Y、V或L，
[0058]X2是任意氨基酸，優(yōu)選為K或S，
[0059]X3是任意氨基酸，優(yōu)選為H或N，并且
[0060]X4是任意氨基酸，優(yōu)選為G或S
[0061](C)SEQ ID NO:312[X1MX2NEES]的氨基酸序列，其中
[0062]X1是任意氨基酸，優(yōu)選為V、I或Y，并且
[0063]X2是任意氨基酸，優(yōu)選為N或T，
[0064](d)SEQ ID NO:313TGDNX1XJLl 的氨基酸序列，其中
[0065]X1是任意氨基酸，優(yōu)選為Y，并且[0066]X2是任意氨基酸，優(yōu)選為R或M，
[0067](e) SEQ ID NO =SHtX1DDX2RPS]的氨基酸序列，其中
[0068]X1是任意氨基酸，優(yōu)選為D或G，并且
[0069]X2是任意氨基酸，優(yōu)選為S或I，
[0070]以及 SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO:120 和 SEQ ID NO:270 及所示
序列中任一個之序列變體的氨基酸序列，其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換；并且
[0071 ]所述可變輕鏈⑶Rl任選地包含選自以下的氨基酸序列:
[0072](a) SEQ ID NO:315「GIXSGSXJXXXYPXJ 的氨基酸序列，其中
[0073]X1是任意氨基酸，優(yōu)選為S或T，
[0074]X2是任意氨基酸，優(yōu)選為V或A，
[0075]X3是任意氨基酸，優(yōu)選為S或T，
[0076]X4是任意氨基酸，優(yōu)選為S、T或G，[0077]X5是任意氨基酸，優(yōu)選為N或H，
[0078]X6是任意氨基酸，優(yōu)選為G、D或E，
[0079](b)SEQ ID NO:316「TIXSXXXXGXeYDISi 的氨基酸序列，其中
[0080]X1是任意氨基酸，優(yōu)選為S、N或I，
[0081]X2是任意氨基酸，優(yōu)選為G或A，
[0082]X3是任意氨基酸，優(yōu)選為N或D，
[0083]X4是任意氨基酸，優(yōu)選為N或S，
[0084]X5是任意氨基酸，優(yōu)選為V或I，
[0085]X6是任意氨基酸，優(yōu)選為N或S，
[0086](c)SEQ ID NO:317「QGGNIXLYGANl 的氨基酸序列，其中
[0087]X1是任意氨基酸，優(yōu)選為G或W，
[0088](d)SEQ ID NO:318[RGDX1LX2X3YX4X5N]的氨基酸序列，其中
[0089]X1是任意氨基酸，優(yōu)選為S或T，
[0090]X2是任意氨基酸，優(yōu)選為E或R，
[0091]X3是任意氨基酸，優(yōu)選為R或N，
[0092]X4是任意氨基酸，優(yōu)選為G或H，
[0093]X5是任意氨基酸，優(yōu)選為T或A，
[0094](e)SEQ ID NO:319「GXXSGSVTSX,NFPTl 的氨基酸序列，其中
[0095]X1是任意氨基酸，優(yōu)選為V或L，
[0096]X2是任意氨基酸，優(yōu)選為K或T，
[0097]X3是任意氨基酸，優(yōu)選為T或D，
[0098]以及 SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO:251、SEQID NO:252, SEQ ID NO:253、SEQ ID NO:267 和 SEQ ID NO:268 及所示序列中任
一個之序列變體的氨基酸序列，其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨
基酸替換。
[0099]輕鏈可變結(jié)構(gòu)域可包含與所列可變輕鏈CDR2序列(LCDR2)中任一個和可變輕鏈⑶Rl序列(IXDRl)中任一個相組合的所列可變輕鏈⑶R3序列(IXDR3)中的任一個。然而，IXDR3和IXDR2和IXDRl的某些組合是尤其優(yōu)選的，這些是來源于單一常見VL結(jié)構(gòu)域的“天然”組合。這些優(yōu)選的組合列于表7和表15A中。
[0100]包含與VL結(jié)構(gòu)域配對以形成⑶70抗原之結(jié)合位點的VII結(jié)構(gòu)域的任意給定⑶70抗體或其抗原結(jié)合片段將包括以下6個⑶R的組合:可變重鏈⑶R3 (HCDR3)、可變重鏈⑶R2 (HCDR2)、可變重鏈⑶Rl (HCDRl)、可變輕鏈⑶R3 (IXDR3)、可變輕鏈⑶R2 (IXDR2)和可變輕鏈⑶Rl (IXDRl)。盡管選自上述所列⑶R序列組的6個⑶R的所有組合均為可允許的并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)，但是6個CDR的某些組合是尤其優(yōu)選的；這些是表現(xiàn)出與人CD70高親和力結(jié)合的單一 Fab中的“天然”組合。 [0101]6個⑶R的一些優(yōu)選組合包括但不限于，選自以下的可變重鏈⑶R3(HCDR3)、可變重鏈⑶R2 (HCDR2)、可變重鏈⑶Rl (HCDRl)、可變輕鏈⑶R3 (IXDR3)、可變輕鏈⑶R2 (IXDR2)和可變輕鏈⑶Rl (IXDRl)的組合:
[0102](i)包含 SEQ ID NO:50 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:27 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:11 的 HCDR1、包含 SEQ ID NO: 160 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:119 的 LCDR2 和包含 SEQ IDNO:250 的 LCDRl ；
[0103](ii)包含 SEQ ID NO:49 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:26 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:
10的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:148 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO: 109 的 LCDR2 和包含 SEQ IDNO:77 的 LCDRl ；
[0104](iii)包含 SEQ ID NO:50 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:27 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:
11的 HCDR1、包含 SEQ ID NO: 149 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:110 的 LCDR2 和包含 SEQ IDNO:78 的 LCDRl ；
[0105](iv)包含 SEQ ID NO:50 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:28 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:11 的 HCDR1、包含 SEQ ID NO:150 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:111 的 LCDR2 和包含 SEQ IDNO:79 的 LCDRl ；
[0106](V)包含 SEQ ID NO:50 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:28 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:
11的 HCDR1、包含 SEQ ID NO: 151 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:110 的 LCDR2 和包含 SEQ IDNO:80 的 LCDRl ；
[0107](vi)包含 SEQ ID NO:51 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:29 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:
12的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:152 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:110 的 LCDR2 和包含 SEQ IDNO:80 的 LCDRl ；
[0108](vii)包含 SEQ ID NO:52 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:30 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:
13的 HCDRl、包含 SEQ ID NO: 153 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:112 的 LCDR2 和包含 SEQ IDNO:81 的 LCDRl ；
[0109](viii)包含 SEQ ID NO:53 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:31 的 HCDR2、包含 SEQ IDNO: 14 的 HCDRl、包含 SEQ ID NO: 154 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:113 的 LCDR2 和包含 SEQID NO:82 的 LCDRl ；
[0110](ix)包含 SEQ ID NO:54 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:32 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:
15的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:155 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:114 的 LCDR2 和包含 SEQ IDNO:83 的 LCDRl ；[0111](X)包含 SEQ ID NO:55 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:33 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:
16的 HCDRl、包含 SEQ ID NO: 156 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:115 的 LCDR2 和包含 SEQ IDNO:84 的 LCDRl ；
[0112](xi)包含 SEQ ID NO:56 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:34 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:
17的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:157 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:116 的 LCDR2 和包含 SEQ IDNO:85 的 LCDRl ；
[0113](xii)包含 SEQ ID NO:57 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:35 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:
18的 HCDRl、包含 SEQ ID NO: 158 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:117 的 LCDR2 和包含 SEQ IDNO:84 的 LCDRl ；
[0114](xiii)包含 SEQ ID NO:58 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:36 的 HCDR2、包含 SEQ IDNO: 19 的 HCDRl、包含 SEQ ID NO: 159 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:118 的 LCDR2 和包含 SEQID NO:86 的 LCDRl ；
[0115](xiv)包含 SEQ ID NO:50 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:27 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:11 的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:161 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:120 的 LCDR2 和包含 SEQ IDNO:88 的 LCDRl ；
[0116](XV)包含 SEQ ID NO:50 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:27 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:11 的 HCDR1、包含 SEQ ID NO:162 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:121 的 LCDR2 和包含 SEQ IDNO:89 的 LCDRl ；
[0117](xvi)包含 SEQ ID NO:50 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:27 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:
11的 HCDR1、包含 SEQ ID NO: 163 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO: 122 的 LCDR2 和包含 SEQ IDNO:90 的 LCDRl ；
[0118](xvii)包含 SEQ ID NO:51 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:29 的 HCDR2、包含 SEQ IDNO: 12 的 HCDRl、包含 SEQ ID NO: 164 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO: 123 的 LCDR2 和包含 SEQID NO:91 的 LCDRl ；
[0119](xviii)包含 SEQ ID NO:51 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:29 的 HCDR2、包含 SEQ IDNO: 12 的 HCDRl、包含 SEQ ID NO: 164 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO: 124 的 LCDR2 和包含 SEQID NO:91 的 LCDRl ；
[0120](xix)包含 SEQ ID NO:59 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:37 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:
12的 HCDRl、包含 SEQ ID NO: 165 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO: 125 的 LCDR2 和包含 SEQ IDNO:92 的 LCDRl ；
[0121](XX)包含 SEQ ID NO:59 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:37 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:20 的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:165 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO: 126 的 LCDR2 和包含 SEQ IDNO:93 的 LCDRl ；
[0122](xxi)包含 SEQ ID NO:59 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:37 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:20 的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:166 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO: 127 的 LCDR2 和包含 SEQ IDNO:92 的 LCDRl ；
[0123](xxii)包含 SEQ ID NO:59 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:37 的 HCDR2、包含 SEQ IDNO:20 的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:1 67 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:128 的 LCDR2 和包含 SEQID NO:94 的 LCDRl ；[0124](xxiii)包含 SEQ ID NO:59 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:37 的 HCDR2、包含 SEQ IDNO:20 的 HCDRl、包含 SEQ ID NO: 168 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:110 的 LCDR2 和包含 SEQID NO:95 的 LCDRl ；
[0125](xxiv)包含 SEQ ID NO:262 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:258 的 HCDR2、包含 SEQ IDNO:256 的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:271 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:110 的 LCDR2 和包含 SEQID NO:267 的 LCDRl:
[0126](XXV)包含 SEQ ID NO:263 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:259 的 HCDR2、包含 SEQ IDNO:257 的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:273 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:270 的 LCDR2 和包含 SEQID NO:268 的 LCDRl。
[0127]表現(xiàn)出與人CD70高親和力結(jié)合的其他優(yōu)選CD70抗體包括分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有選自以下之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域:SEQ ID NO:177, SEQ IDNO:178, SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:212,SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216、SEQ IDNO:217, SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:274 和 SEQ ID NO:275 的氨基酸序列以及與所示序列之一表現(xiàn)出至少90^^95^^97^^98%或99%序列同一性的氨基酸序列；以及任選地包含具有選自以下之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域:SEQ ID NO:189,SEQ ID NO:190,SEQ ID NO:19USEQ ID NO: 192,SEQ ID NO:193、SEQ ID NO: 194,SEQ ID NO:195、SEQ IDNO:196, SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207,SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ IDNO:223, SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240,SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ IDNO:245, SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:276 和 SEQ ID NO:277的氨基酸序列以及與所示序列之一表現(xiàn)出至少90 %、95 %、97 %、98 %或99 %序列同一性的氨基酸序列。
[0128]盡管選自上文所列VH和VL結(jié)構(gòu)域序列組之VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域的所有可能配對均是可允許的并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)，但是某些VH和VL的組合是尤其優(yōu)選的；這些是表現(xiàn)出與人⑶70高親和力結(jié)合的單一 Fab內(nèi)的“天然”組合。因此，表現(xiàn)出高親和力⑶70結(jié)合的一些優(yōu)選⑶70抗體或其抗原結(jié)合片段是包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)之組合的那些，其中所述組合選自:
[0129](i)包含SEQ ID NO:223之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:241之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0130](ii)包含SEQ ID NO:177之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:189之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0131](iii)包含SEQ ID NO:178之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:190之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0132](iv)包含SEQ ID NO:179之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:191之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0133](V)包含SEQ ID NO:179之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:192之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0134](vi)包含SEQ ID NO:180之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:193之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0135](vii)包含SEQ ID NO:181之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:194之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0136](viii)包含SEQ ID NO:182之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:195之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0137](ix)包含SEQ ID NO:183之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:196之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0138](X)包含SEQ ID NO:184之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:197之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0139](xi)包含SEQ ID NO:185之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:198之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0140](xii)包含SEQ ID NO:186之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:199之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0141](xiii)包含SEQ ID NO:187之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:200之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0142](xiv)包含SEQ ID NO:178之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:201之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0143](XV)包含SEQ ID NO:178之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:202之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0144](xvi)包含SEQ ID NO:178之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:203之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0145](xvii)包含SEQ ID NO:178之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:204之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0146](xviii)包含SEQ ID NO:180之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:205之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0147](xix)包含SEQ ID NO:180之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:206之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0148](XX)包含SEQ ID NO:188之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:207之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0149](xxi)包含SEQ ID NO:188之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:208之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0150] (xxii)包含SEQ ID NO:188之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:209之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；[0151](xxiii)包含SEQ ID NO:188之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:210之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0152](xxiv)包含SEQ ID NO:188之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:211之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0153](XXV)包含SEQ ID NO:274之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:276之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0154](xxvi)包含SEQ ID NO:275之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:277之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
[0155]上文所列每種特定VH/VL組合，將具有與所示VH結(jié)構(gòu)域序列有至少90%、92%、95^^97%或99%同一性之氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域與具有與所示VL結(jié)構(gòu)域序列有至少90%、92%、95%、97%或99%同一性之氨基酸序列的VL結(jié)構(gòu)域相組合也是可允許的并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0156]在前述段落中和本文中別處，基于與所示參照序列(具有給定SEQ ID NO)的序列同一性％限定了抗體/抗原結(jié)合片段的結(jié)構(gòu)。在這種情況中，兩條氨基酸序列之間的序列同一性％可通過比較以最佳方式比對的這兩條序列來確定，其中待比較的氨基酸序列可包含相對于參照序列的添加或缺失以進行這兩條序列之間的最佳比對。通過以下來計算同一性百分比:確定兩條序列之間氨基酸殘基相同的一致位置的數(shù)目，用該一致位置的數(shù)目除以比較窗口中的位置的總數(shù)目，并將所得結(jié)果乘以100以得到這兩條序列之間的同一性百分比。通常，比較窗口對應(yīng)于正被比較序列的全長。例如，可以使用可得自站點http://www.ncb1.nlm.n·ih.gov/gorf/bl2.html 的 BLAST 程序 “BLAST-2 序列” (Tatusova等， "Blast2sequences_a new tool for comparing protein and nucleotidesequences"，F(xiàn)EMS Microbiol Lett.174:247-250)，所使用的參數(shù)為默認給出的那些(特別是參數(shù)“開放缺口罰分”:5，和“延伸缺口罰分”:2;所選擇的矩陣為例如由程序所提出的矩陣“BL0SUM62” )，通過該程序直接計算待比較的兩條序列之間的同一性百分比。
[0157]表現(xiàn)出特別有利的特性(包括與人CD70以極高親和力結(jié)合)組合的本文中提供的最優(yōu)選CD70抗體是基于以下的抗原結(jié)合部分的那些:在所附實施例中表示為27B3的大羊駝來源的Fab以及27B3的人種系化變體(包括在所附實施例中鑒定的種系化變體)。27B3及其種系化變體(特別是基于變體41D12之⑶R或完整可變結(jié)構(gòu)域的變體)表現(xiàn)出極其有利的特性組合，總結(jié)如下:與重組人⑶70以高親和力結(jié)合，與細胞表面⑶70的強結(jié)合(尤其是與癌細胞系(特別是以“低拷貝數(shù)”表達CD70的細胞系)上所表達CD70結(jié)合)和與從患者樣品(CLL)中分離的癌細胞強結(jié)合、對CD70/CD27相互作用的強效阻斷，強效的效應(yīng)子功能-特別是當與人IgGl恒定區(qū)作為嵌合體表達時和尤其是當作為非巖藻糖基化IgGl表達時，與恒河猴和食蟹猴的CD70同源物有交叉反應(yīng)性(使得能夠在靈長類物種中進行毒理學(xué)研究)，結(jié)合天然(即細胞表面)和熱變性兩種CD70，在某些癌細胞系上的部分或低水平內(nèi)化。所有這些特征相組合使得41D12 (以及甚至其他27B3變體和表現(xiàn)出類似特性的本文中描述的其他CD70抗體)成為在治療CD70相關(guān)疾病(尤其是表達CD70的癌癥和免疫性病癥)中用于治療用途的優(yōu)秀候選物。
[0158]27B3及其變體的特征為存在如SEQ ID NO:50 (DAGYSNHVPIFDS)所示的重鏈可變CDR3序列。[0159]因此，CD70抗體或其抗原結(jié)合片段的一些優(yōu)選實施方案是包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域的那些，其中所述可變重鏈CDR3包含SEQ ID NO:50或其序列變體的氨基酸序列或者由所述序列組成，其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換。
[0160]一些更優(yōu)選的實施方案是這樣的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含與27B3或27B3之人種系化變體相同的重鏈CDR組合。因此，所述抗體或其抗原結(jié)合片段可包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中
[0161]可變重鏈⑶R3包含SEQ ID NO:50或其序列變體的氨基酸序列或者由所述序列組成；
[0162]可變重鏈CDR2包含選自SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:249和其序列變體的氨基酸序列或由所述序列組成；以及
[0163]可變重鏈CDRl包含選自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:248和其序列變體的氨基酸序列或由所述序列組成，其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換(例如，保守替換、人源化替換或親和變體)。
[0164]來自⑶R序列所示組內(nèi)的HCDR3、HCDR2和HCDRl的任意組合是可允許的并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)，然而某些組合是尤其優(yōu)選的。因此，在一些優(yōu)選的實施方案中，所述抗原或其抗原結(jié)合片段可包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中HCDR3、HCDR2和HCDRl的組合選自以下:
[0165](a)可變重鏈CDR3包含SEQ ID NO:50 (DAGYSNHVPIFDS)或其序列變體或者由所述序列組成；
[0166]可變重鏈CDR2包含SEQ ID NO:27 (DINNEGGTTYYADSVKG)或其序列變體或者由所述序列組成；和
[0167]可變重鏈⑶Rl包含SEQ ID NO =Il(VYYMN)或其序列變體或者由所述序列組成，
[0168]其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換(例如，保守替換、人源化替換或親和變體)。
[0169](b)可變重鏈CDR3包含SEQ ID NO:50 (RDAGYSNHVPIFDS)或其序列變體或者由所述序列組成；
[0170]可變重鏈CDR2包含SEQ ID NO:249 (DINNEGGATYYADSVKG)或其序列變體或者由所述序列組成；和
[0171]可變重鏈⑶Rl包含SEQ ID NO =Il(VYYMN)或其序列變體或者由所述序列組成，
[0172]其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換(例如，保守替換、人源化替換或親和變體)。
[0173](c)可變重鏈CDR3包含SEQ ID NO:50 (DAGYSNHVPIFDS)或其序列變體或者由所述序列組成；
[0174]可變重鏈CDR2包含SEQ ID NO:27 (DINNEGGTTYYADSVKG)或其序列變體或者由所述序列組成；和
[0175]可變重鏈⑶Rl包含SEQ ID NO:248 (GYYMN)或其序列變體或者由所述序列組成，
[0176]其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換(例如，保守替換、人源化替換或親和變體)。
[0177]在一些優(yōu)選的實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段還包含與重鏈可變結(jié)構(gòu)域配對的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)。在一些優(yōu)選的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中，可變輕鏈⑶R3包含SEQ IDNO:160或其序列變體或者由所述序列組成；
[0178]可變輕鏈CDR2包含選自SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:110和所示序列之序列變體的氨基酸序列或由所述序列組成；以及
[0179]可變輕鏈CDRl 包含選自 SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:250,SEQ ID NO:25USEQ IDNO:252, SEQ ID NO:253和所示序列之序列變體的氨基酸序列或由所述序列組成，以及
[0180]其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換(例如，保守替換、人源化替換或親和變體)。
[0181]來自輕鏈⑶R序列所示組內(nèi)的IXDR3、IXDR2和IXDRl的任意組合是可允許的并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)，然而某些組合是尤其優(yōu)選的。因此，在一些優(yōu)選的實施方案中，所述抗原或其抗原結(jié)合片段可包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中IXDR3、IXDR2和IXDRl的組合選自以下:
[0182](a)可變輕鏈CDR3包含SEQ ID NO:160 (ALFISNPSVE)或其序列變體或者由所述序列組成；
[0183]可變輕鏈CDR2包含SEQ ID NO:119 (NTNTRHS)或其序列變體或者由所述序列組成；和
[0184]可變輕鏈CDRl包含SEQ ID NO:250 (GLKSGSVTSDNFPT)或其序列變體或者由所述序列組成，
[0185]其中所述序 列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換(例如，保守替換、人源化替換或親和變體)。
[0186](b)可變輕鏈CDR3包含SEQ ID NO:160 (ALFISNPSVE)或其序列變體或者由所述序列組成；
[0187]可變輕鏈CDR2包含SEQ ID NO:119 (NTNTRHS)或其序列變體或者由所述序列組成；和
[0188]可變輕鏈CDRl包含SEQ ID NO:87 (GLKSGSVTSTNFPT)或其序列變體或者由所述序列組成，
[0189]其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換(例如，保守替換、人源化替換或親和變體)。
[0190]對于27B3的人“種系化”變體的另一些優(yōu)選輕鏈⑶R組合示于表15A中。
[0191]⑶70抗體或其抗原結(jié)合片段的一個最優(yōu)選實施方案包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，其中形成人⑶70之結(jié)合位點的6個⑶R的組合如下:
[0192]可變重鏈CDR3包含SEQ ID NO:50 (DAGYSNHVPIFDS)或其序列變體或者由所述序列組成；
[0193]所述可變重鏈CDR2包含SEQ ID NO:27 (DINNEGGTTYYADSVKG)或其序列變體或者由所述序列組成；
[0194]可變重鏈⑶Rl包含SEQ ID NO: 11 (VYYMN)或其序列變體或者由所述序列組成；
[0195]可變輕鏈CDR3包含SEQ ID NO: 160 (ALFISNPSVE)或其序列變體或者由所述序列組成；
[0196]可變輕鏈CDR2包含SEQ ID NO:119 (NTNTRHS)或其序列變體或者由所述序列組成；和[0197]可變輕鏈CDRl包含SEQ ID NO:250 (GLKSGSVTSDNFPT)或其序列變體或者由所述序列組成，
[0198]其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換(例如，保守替換、人源化替換或親和變體)。
[0199]6個⑶R的另一些優(yōu)選組合是在表14A (重鏈)和15A (輕鏈)中所列27B3的人種系化變體中出現(xiàn)的那些“天然”組合。
[0200]在基于27B3及其種系化變體的一些前述優(yōu)選實施方案中，所述抗體優(yōu)選地包含人抗體(尤其是人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)的CHl結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。一個最優(yōu)選的實施方案是人IgGl。還優(yōu)選的是對人IgGl進行改造以最大化在抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)的一個或更多個中的效應(yīng)子功能。特別優(yōu)選地是非巖藻糖基化的人IgGl,例如使用BioWa Inc的Potelligent?技術(shù)生產(chǎn)的非巖藻糖基化IgGl。
[0201]基于表示為27B3的Fab和27B3的人種系化變體，表現(xiàn)出與人⑶70的高親和力結(jié)合的另一些優(yōu)選CD70抗體包括分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有選自以下之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域:SEQ ID NO:178, SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:220,SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:224、SEQ IDNO:225,SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:274和SEQ ID NO:275的氨基酸序列以及與所示序列之一表現(xiàn)出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列；以及任選地包含具有選自以下的氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域:SEQ ID NO:20U SEQ ID NO:230, SEQ ID NO:23USEQ ID NO:232, SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234,SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ IDNO:239,SEQ ID NO:240、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO: 245、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:276 和 SEQID NO:277的氨基酸序列以及與所示序列之一表現(xiàn)出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
[0202]盡管選自上文所列VH和VL結(jié)構(gòu)域序列組之VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域的所有可能配對是可允許的并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)，但是某些VH和VL的組合是特別優(yōu)選的；這些是在表現(xiàn)出與人⑶70之高親和力結(jié)合的單一 Fab中的“天然”組合。在表14B和15B中所示的27B3種系化變體的情況中，可優(yōu)選保留原始的VH / VL配對。因此，表現(xiàn)出高親和力⑶70結(jié)合的一些優(yōu)選CD70抗體或其抗原結(jié)合片段是包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域之組合的那些，其中所述組合選自:
[0203](i)包含SEQ ID NO:223之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:241之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0204](ii)包含SEQ ID NO:178之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:190之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0205](iii)包含SEQ ID NO:212之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:230之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0206](iv)包含SEQ ID NO:213之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:231之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0207](V)包含SEQ ID NO:214之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:232之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0208](vi)包含SEQ ID NO:215之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:235之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0209](vii)包含SEQ ID NO:216之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:234之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0210](viii)包含SEQ ID NO:217之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:235之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0211](ix)包含SEQ ID NO:218之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:236之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0212](X)包含SEQ ID NO:219之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:237之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0213](xi)包含SEQ ID NO:220之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:238之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0214](xii)包含SEQ ID NO:221之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:239之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；`
[0215](xiii)包含SEQ ID NO:222之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:240之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0216](xiv)包含SEQ ID NO:224之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:242之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0217](XV)包含SEQ ID NO:225之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:243之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0218](xvi)包含SEQ ID NO:226之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:244之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0219](xvii)包含SEQ ID NO:227之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:245之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0220](xviii)包含SEQ ID NO:228之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:246之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0221](xix)包含SEQ ID NO:229之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:247之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0222](XX)包含SEQ ID NO:223之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:244之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0223](xxi)包含SEQ ID NO:223之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:245之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
[0224]對于上文所列每個特定VH / VL組合，將具有與所示VH結(jié)構(gòu)域序列有至少90%、92 %、95 %、97 %或99 %同一性之氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域與具有與所示VL結(jié)構(gòu)域序列有至少90^^92^^95^^97%或99%同一性之氨基酸序列的VL結(jié)構(gòu)域相組合也是可允許的并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。[0225]一個最優(yōu)選的實施方案為基于表示為41D12之人種系化變體的天然VH / VL組合的CD70抗體或其抗原結(jié)合片段。因此，本文中還提供了包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)包含選自以下的氨基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:223所示的氨基酸序列、其種系化變體和親和變體以及與所述序列有至少90^^95^^97^^98%或99%同一性的氨基酸序列；所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)包含選自以下的氨基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:241所示的氨基酸序列、其種系化變體和親和變體以及與所述序列有至少90 %、95 %、97 %、98 %或99 %同一性的氨基酸序列。
[0226]其中VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與SEQ ID NO:223所示序列表現(xiàn)出低于100%序列同一性的實施方案仍可包含這樣的重鏈⑶R，其與SEQ ID NO:223的HCDR1、HCDR2和HCDR3(分別為SEQ ID NO:11、27和50)相同同時在框架區(qū)內(nèi)表現(xiàn)出氨基酸序列變化。同樣地，其中VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與SEQ ID NO:241所示序列表現(xiàn)出低于100%序列同一性的實施方案仍可包含這樣的重鏈⑶R，其與SEQ ID NO:241的IXDR1、IXDR2和IXDR3 (分別為SEQ ID N0:250、116和160)相同同時在框架區(qū)內(nèi)表現(xiàn)出氨基酸序列變化。
[0227]在基于41D12的VH和VL結(jié)構(gòu)域或其變體的一些前述優(yōu)選實施方案中，所述抗體優(yōu)選地包含人抗體(尤其是人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)的CHl結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。一個最優(yōu)選的實施方案是人IgGl。還優(yōu)選的是對人IgGl進行改造以最大化在ADCC、CDC或ADCP之一個或更多個中的效應(yīng)子功能。特別優(yōu)選地是去巖藻糖基化的人IgGl，優(yōu)選地使用Potelligent?表達系統(tǒng)制備。
[0228]另一個有利的實施方案為包含以下重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)包含選自以下的氨基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:225所示的氨基酸序列、其種系化變體和親和變體以及與所述序列有至少90%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列；所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)包含選自以下的氨基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:243所示的氨基酸序列、其種系化變體和親和變體以及與所述序列有至少90 %、95 %、97 %、98 %或99 %同一性的氨基酸序列。
[0229]另一個有利的實施方案為包含以下重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)包含選自以下的氨基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:226所示的氨基酸序列、其種系化變體和親和變體以及與所述序列有至少90%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列；所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)包含選自以下的氨基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:244所示的氨基酸序列、其種系化變體和親和變體以及與所所述序列有至少90%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
[0230]CD70抗體的特點/特性
[0231]在前述方面和實施方案中，所述CD70抗體或其抗原結(jié)合片段各自可表現(xiàn)出下述特性或特點中的一個或更個多或者任意組合:
[0232]所述抗體或抗原結(jié)合片段可以以高親和力與人CD70相結(jié)合，當作為Fab片段測試時，對人⑶70表現(xiàn)出7X ΙΟ?或更少、優(yōu)選5Χ ΙΟ?或更少、以及通常0.4Χ ΙΟΛ1至4.8X10^4s^的解離速率。
[0233]所述抗體或抗原結(jié)合片段可以以高親和力與人⑶70相結(jié)合并且抑制⑶70與⑶27之間的相互作用。或者，所述抗體或抗原結(jié)合片段可與人CD70相結(jié)合但不抑制CD70與CD27之間的相互作用。
[0234]所述抗體或抗原結(jié)合片段可以以高親和力與表達CD70之細胞表面上的人CD70相
[0235]所述抗體或抗原結(jié)合片段可以與表達⑶70之細胞表面上的人⑶70相結(jié)合并且緩慢地或僅部分地被內(nèi)化。本發(fā)明的一個關(guān)鍵方面是這樣的觀察，CD70抗體事實上在大量表達CD70的細胞系(包括許多表達CD70的癌細胞系)上內(nèi)化很少。該觀察與之前發(fā)表的報道(⑶70抗體在與腎細胞癌細胞系相結(jié)合后快速內(nèi)化(參見Adam等，British JournalofCancer (2006) 95:298-306 ;和W02007 / 038637))直接相反并且對抗體的治療用途具有直接啟示。CD70抗體在與癌細胞相結(jié)合后內(nèi)化很少這一觀察結(jié)果強烈支持這樣的結(jié)論:用于治療許多表達CD70之癌癥和與CD70有關(guān)的免疫性疾病的治療方案應(yīng)基于與CD70的極其高親和力結(jié)合，以及抗體效應(yīng)子功能(尤其是ADCC、CDC或ADCP中的任意一個或更多個)偶聯(lián)，而不是基于使用免疫綴合物，其中CD70抗體與治療劑(例如細胞毒性或細胞抑制藥物部分)相連接。
[0236]所述抗體或抗原結(jié)合片段可與人CD70中的氨基酸序列HIQVTLAICSS (SEQ ID NO:342)結(jié)合；
[0237]所述抗體或抗原結(jié)合片段可與猴來源的⑶70(尤其是恒河猴(Macaca mulatta)和食蟹猴(Macaca cynomolgus)的⑶70同源物)表現(xiàn)出交叉反應(yīng)性。
[0238]所述抗體或抗原結(jié)合片段可與天然人CD70 (例如在細胞(例如細胞系或從人患者中分離的表達⑶70的細胞)的表面上表達的CD70)和熱變性重組人⑶70 二者相結(jié)合。
[0239]與治療性抗體產(chǎn)物的I~2g / L歷史平均數(shù)相比，所述抗體或抗原結(jié)合片段可在重組抗體表達系統(tǒng)(例如CHKl·SV細胞系(由BioWa / Lonza所有))中提供非常高的產(chǎn)量(>4g / L)，使得顯著降低了生產(chǎn)成本。
[0240]所述抗體或抗原結(jié)合片段在37°C貯存條件和凍融循環(huán)中可以是高度穩(wěn)定的，這也是降低成本的主要因素。
[0241]所述抗體可表現(xiàn)出選自以下的一個或更多個效應(yīng)子功能:針對細胞表面上表達人CD70之細胞的抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)和抗體依賴性細胞介導(dǎo)的吞噬作用(ADCP)。
[0242]所述抗體可表現(xiàn)出針對表達CD70的細胞(例如癌細胞或其他惡性細胞或者免疫細胞)的ADCC0
[0243]與參照抗體相比，所述抗體可表現(xiàn)出增強的ADCC功能，所述參照抗體是包含天然人Fe結(jié)構(gòu)域的等價抗體。在一個非限制性實施方案中，與包含天然人Fe結(jié)構(gòu)域的參照抗體相比，ADCC功能可至少增強10倍。此處的“等價”可意為具有增強的ADCC功能的抗體顯示出與參照抗體基本一致的抗原結(jié)合特異性和/或共有一致的氨基酸序列，為了增強ADCC而進行(相對于天然人Fe)的任何修飾除外。
[0244]在沒有與細胞毒劑或細胞抑制劑綴合的情況下，所述抗體或抗原結(jié)合片段可在體內(nèi)腫瘤異種移植模型中抑制腫瘤生長。在一個非限制性實施方案中，與參照抗體SGN70相t匕，腫瘤生長功能的抑制可增強至少10倍。
[0245]所述抗體或抗原結(jié)合片段可誘導(dǎo)表達⑶70之細胞的細胞凋亡。
[0246]所述抗體可包含人IgG(最優(yōu)選人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)的鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。
[0247]所述抗體可包含F(xiàn)e區(qū)中的修飾(例如在本文中別處所解釋的增強抗體效應(yīng)子功能的修飾)。尤其是，抗體可以是非巖藻糖基化的IgG。
[0248]在又一些方面中，本發(fā)明還提供了編碼上文所列CD70抗體及其抗原結(jié)合片段的多核苷酸分子，以及包含所述多核苷酸的表達載體、包含所述載體的宿主細胞和重組表達/產(chǎn)生所述⑶70抗體的方法。
[0249]在還一個方面中，本發(fā)明提供了包含任一上述⑶70抗體和可藥用載體或賦形劑的藥物組合物。
[0250]本發(fā)明的還一個方面涉及使用上文所列CD70抗體進行醫(yī)學(xué)治療的方法，尤其是
治療癌癥。
【專利附圖】
【附圖說明】[0251]參照下述實驗實施例和附圖將進一步理解本發(fā)明，附圖中:
[0252]圖1:示出了對于經(jīng)786-0細胞(頂圖)和經(jīng)Raji細胞(底圖)免疫的大羊駝在ELISA中針對重組⑶70測試的免疫應(yīng)答。
[0253]圖2:說明了通過ELISA測量的大羊駝來源之⑶70Fab和參照⑶70Fab的⑶27與⑶70結(jié)合的抑制。
[0254]圖3:是在結(jié)合Elisa(黑色)中或在抑制Elisa(白色)中所測試大羊駝來源之Fab的信號的圖示。
[0255]圖4:說明了通過ELISA測量的嵌合大羊駝-人⑶70mAb和參照⑶70mAb對⑶27與人⑶70 (A&B)或恒河猴⑶70 (C)結(jié)合的抑制。
[0256]圖5:示出了通過FACS分析表明的嵌合大羊駝_人⑶70mAb與786-0細胞(A)或MHH-PREB-1細胞(B)的結(jié)合。
[0257]圖6:示出了在基于Raji細胞的共培養(yǎng)效力測定(Raji cell based co-culturepotency assay)中通過⑶70特異性嵌合大羊5它-人mAb的抑制。
[0258]圖7:示出了在786-0細胞中標準Cr51釋放ADCC測定的結(jié)果。
[0259]圖8:示出了在9%人血清的存在下在U266細胞中的⑶C測定的結(jié)果。
[0260]圖9:表明了在786-0細胞中在ADCP測定中嵌合大羊駝-人⑶70mAb的效力。
[0261]圖10:說明了在兩個獨立實驗中，在786-0細胞中對于不同嵌合大羊駝-人⑶70mAb而言的以MFI外(MFI OUT)評估的作為時間之函數(shù)的抗體內(nèi)化。
[0262]圖11:表明了在用嵌合大羊駝-人⑶70mAb41D12、同種型對照和Fc_dead對照處理后在Raji異種移植模型中的小鼠存活率。
[0263]圖12:描述了克隆27B3之VH和VL氨基酸序列分別與人種系基因區(qū)段VH3-38和VL8-61之氨基酸序列的比對。
[0264]圖13:示出了種系化27B3mAb變體在37°C下孵育5周后獲得的樣品的凝膠過濾分析。
[0265]圖14:示出了使用Biacore測量的在多個溫度下孵育后在多個時間點獲得的種系化⑶70mAb樣品的⑶70結(jié)合效力。
[0266]圖15:示出了⑶70mAb對表達⑶70之癌細胞系的結(jié)合親和力。[0267]圖16:示出了⑶70mAb對表達⑶70之CLL患者細胞的親和力。
[0268]圖17:示出了 CD70mAb結(jié)合之SU-DHL-6細胞的裂解。
[0269]圖18:示出了通過ELISA測量的⑶70mAb對⑶27與⑶70結(jié)合的抑制。
[0270]圖19:示出了來自不同物種之⑶70序列的比對。
[0271]圖20:示出了 CD70mAb對人U266細胞、恒河猴L(fēng)CL8864細胞和食蟹猴HSC-F細胞的結(jié)合親和力。
[0272]圖21:示出了通過ELISA測量的⑶70mAb對⑶27與人、恒河猴和食蟹猴之⑶70結(jié)合的抑制。
[0273]圖22:示出了通過ELISA評估的⑶70mAb與變性重組⑶70的結(jié)合。
[0274]圖23:不出了用于表位作圖的⑶70嵌合序列。
[0275]圖24:說明了在786-0細胞中作為時間之函數(shù)的⑶70mAb的抗體內(nèi)化。
[0276]定義
[0277]“抗體”或“免疫球蛋白”一本文中使用的術(shù)語“免疫球蛋白”包括具有兩條重鏈與兩條輕鏈之組合的多肽，無論其是否具有任何相關(guān)特異性免疫反應(yīng)性?！翱贵w”指對目的抗原(例如，人⑶70)具有顯著已知特異性免疫反應(yīng)活性的這種組裝體(assembly)。本文所使用的術(shù)語“CD70抗體”指對人CD70蛋白表現(xiàn)出免疫特異性的抗體。如在本文中其它地方所解釋的，對人CD70的“特異性”不排除與CD70的物種同源物的交叉反應(yīng)?？贵w和免疫球蛋白包含輕鏈和重鏈，它們之間有或沒`有鏈間共價連接。對脊椎動物系統(tǒng)中的基本免疫球蛋白結(jié)構(gòu)已有相對深入地認識。
[0278]通用術(shù)語“免疫球蛋白”包括可在生物化學(xué)上區(qū)分的5類不同抗體。所有5類抗體均在本發(fā)明的范圍內(nèi)，下述討論將一般地涉及IgG類的免疫球蛋白分子。就IgG而言，免疫球蛋白包含分子量為約23，000道爾頓的兩條相同的輕多肽鏈和分子量為53，000~70，000的兩條相同的重鏈。四條鏈通過二硫鍵以“Y”構(gòu)型連接，其中輕鏈在“Y”的口處開始支托(bracket)重鏈,并且延續(xù)通過可變區(qū)。
[0279]抗體的輕鏈分為K或λ (Κ、λ)。各重鏈類別可與K或λ輕鏈相連。一般而言，輕鏈和重鏈彼此共價連接，并且當通過雜交瘤、B細胞或遺傳改造的宿主細胞產(chǎn)生免疫球蛋白時，兩條重鏈的“尾”部分彼此通過共價二硫鍵連接或非共價連接結(jié)合。在重鏈中，氨基酸序列從Y構(gòu)型叉狀端的N末端到各鏈底部的C末端。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解重鏈分為Y、μ、α、δ、ε ,其中有一些亞類型(例如，Y I~Y 4)。該鏈的特性決定抗體的“類型”分別為IgG、IgM、IgA、IgD或IgE0免疫球蛋白亞類(同種型(isotype))例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl等是良好表征的，并且已知其賦予功能特化。根據(jù)本公開內(nèi)容，這些類型和同種型中每一種的經(jīng)修飾形式對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言易于辨別，并且因此在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0280]如上所述，抗體的可變區(qū)允許抗體選擇性地識別并特異性地結(jié)合抗原上的表位。即，抗體的VL結(jié)構(gòu)域與VH結(jié)構(gòu)域組合以形成限定三維抗原結(jié)合位點的可變區(qū)。該四級抗體結(jié)構(gòu)形成存在于Y各臂末端的抗原結(jié)合位點。更特別地，抗原結(jié)合位點由各VH和VL鏈上的三個互補決定區(qū)(⑶幻來限定。
[0281]“⑶70蛋白”或“⑶70抗原”本文中使用的術(shù)語“⑶70蛋白”或“⑶70抗原”或“⑶70”可互換使用，并且指為TNFRSF27 /⑶27之配體的TNF配體家族的成員。術(shù)語“人⑶70蛋白”或“人⑶70抗原”或“人⑶70”可互換使用以尤其指人的同源物，包括天然地表達于人體中和/或培養(yǎng)的人細胞系表面上的天然人CD70蛋白及其重組形式和片段。人CD70的具體實例包括具有NCBI參照序列登錄號NP_001243所示氨基酸序列的多肽或其胞外結(jié)構(gòu)域。
[0282]“結(jié)合位點”一本文中使用的術(shù)語“結(jié)合位點”包含負責(zé)選擇性地結(jié)合目的靶抗原(例如，人⑶70)的多肽區(qū)。結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含至少一個結(jié)合位點。示例性結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗體可變結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的抗體分子可包含單一結(jié)合位點或多(例如，二、三或四)結(jié)合位點。
[0283]“來源于(derived from)”一本文中使用的術(shù)語“來源于”指定蛋白質(zhì)(例如，CD70抗體或其抗原結(jié)合片段)表示多肽的來源。在一個實施方案中，來源于特定起始多肽的多肽或氨基酸序列是CDR序列或與其相關(guān)的序列。在一個實施方案中，來源于特定起始多肽的氨基酸序列是不連續(xù)的。例如，在一個實施方案中，一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR來自起始抗體。在一個實施方案中，來源于特定起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列具有與起始序列基本一致的氨基酸序列或者其部分，其中所述部分由至少3至5個氨基酸、5至10個氨基酸、至少10至20個氨基酸、至少20至30個氨基酸或至少30至50個氨基酸組成，或者其對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言可以另外的方式鑒定為在起始序列中具有其來源。在一個實施方案中，改變來自起始抗體的一個或更多個CDR序列以產(chǎn)生變體CDR序列，例如親和變體，其中所述變體CDR序列保持CD70結(jié)合活性。
[0284]“駱駝科動物來源(Camelid-derived)”在某些優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的CD70抗體分子包含通過用CD70抗原主動免疫駱駝科動物而產(chǎn)生的來自駱駝科動物常規(guī)抗體的框架氨基酸序列和/或CDR氨基酸序列。但是，可以將包含駱駝科動物來源之氨基酸序列的CD70抗體改造為包含來源于人氨基酸序列(即人抗體)或其它非駱駝科哺乳動物物種的框架和/或恒定區(qū)序列。例如，可以將人或非人靈長動物框架區(qū)、重鏈部分和/或鉸鏈部分包含于本發(fā)明的CD70抗體中。在一個實施方案中，一個或更多個非駱§它科動物氨基酸可存在于“駱駝科動物來源” CD70抗體的框架區(qū)，例如，駱駝科動物框架氨基酸序列可包含一個或更多個氨基酸突變，其中存在相應(yīng)的人或非人靈長動物氨基酸殘基。此外，駱駝科動物來源的VH和VL結(jié)構(gòu)域或其人源化變體可與人抗體的恒定結(jié)構(gòu)域連接以產(chǎn)生嵌合分子，如在本文中其它地方詳細描述的。
[0285]“保守氨基酸替換”一 “保守氨基酸替換”是其中氨基酸殘基被具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基所替代的替換。已在本領(lǐng)域中限定了具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族，包括堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β -支鏈化(beta-branched)側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸殘基可以被來自相同側(cè)鏈家族的另一氨基酸殘基替代。在另一實施方案中，一串氨基酸可以被結(jié)構(gòu)上類似但是順序和/或側(cè)鏈家族成員組成不同的一串所替代。
[0286]“重鏈部分”一本文中使用的術(shù)語“重鏈部分”包含來源于免疫球蛋白重鏈之恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。含有重鏈部分的多肽包含以下中的至少一種=CHl結(jié)構(gòu)域、鉸鏈(例如，上、中和/或下鉸鏈區(qū))結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域或其變體或片段。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段可包含免疫球蛋白重鏈的Fe部分(例如，鉸鏈部分、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段可缺乏恒定結(jié)構(gòu)域的至少一部分(例如，CH2結(jié)構(gòu)域的全部或一部分)。在某些實施方案中，恒定結(jié)構(gòu)域的至少之一并且優(yōu)選全部來源于人免疫球蛋白重鏈。例如，在一個優(yōu)選實施方案中，重鏈部分包含完全人鉸鏈結(jié)構(gòu)域。在另一些優(yōu)選的實施方案中，重鏈部分包含完全人Fe部分(例如，來自人免疫球蛋白的鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域序列)。
[0287]在某些實施方案中，構(gòu)成重鏈部分的恒定結(jié)構(gòu)域來自不同免疫球蛋白分子。例如，多肽的重鏈部分可包含來自IgGl分子的CH2結(jié)構(gòu)域和來自IgG3或IgG4分子的鉸鏈區(qū)。在另一些實施方案中，恒定結(jié)構(gòu)域是包含不同免疫球蛋白分子的部分的嵌合結(jié)構(gòu)域。例如，鉸鏈可包含來自IgGl分子的第一部分和來自IgG3或IgG4分子的第二部分。如在上文中所給出的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解可以修飾重鏈部分的恒定結(jié)構(gòu)域從而使得他們的氨基酸序列與天然(野生型)免疫球蛋白分子不同。即，本文所公開的本發(fā)明多肽可包含一個或更多個重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CH1、鉸鏈、CH2或CH3)和/或輕鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(CL)的改變或修飾。示例性修飾包括一個或更多個結(jié)構(gòu)域中一個或更多個氨基酸的添加、缺失或替換。
[0288]“嵌合”一“嵌合”蛋白質(zhì)包含與第二氨基酸序列連接的第一氨基酸序列，第一氨基酸序列與第二氨基酸序列在自然中并非天然地連接。所述氨基酸序列通?？纱嬖谟诜珠_的蛋白質(zhì)中，將它們合并成融合多肽，或者，他們通?？纱嬖谟谕坏鞍踪|(zhì)中但在融合多肽中以新的排布放置。嵌合蛋白質(zhì)可例如通過化學(xué)合成或者通過產(chǎn)生和翻譯多核苷酸來產(chǎn)生，所述多核苷酸中肽區(qū)以期望的關(guān)系編碼。示例性嵌合CD70抗體包括融合蛋白，所述融合蛋白包含與人抗體(例如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)恒定結(jié)構(gòu)域融合的駱駝科動物來源的VH和VL結(jié)構(gòu)域或其人源化變體。
[0289]“可變區(qū)”或“可變結(jié)構(gòu)域”一術(shù)語“可變區(qū)”和“可變結(jié)構(gòu)域”在本文中可互換使用并且旨在具有等同含義。術(shù)語“可變”指這樣的事實:可變結(jié)構(gòu)域VH和VL的某些部分的序列在抗體之間差異很大，并用于每個特定抗體針對其靶抗原的結(jié)合和特異性。然而，可變性在抗體的可變結(jié)構(gòu)域中并非均勻分布。它集中在每個VL結(jié)構(gòu)域和VH結(jié)構(gòu)域中被稱為“高變環(huán)”的三個區(qū)段，其形成抗原結(jié)合位點的一部分。νλ輕鏈結(jié)構(gòu)域中的第一、第二和第三高變環(huán)在本文中被稱為LI ( λ )、L2 ( λ )和L3 ( λ )，并且可限定為包含VL結(jié)構(gòu)域中的24~33位(LI (λ)，由9、10或11個氨基酸殘基組成)、49~53位(L2 ( λ )，由3個殘基組成)和90 ~96 位(L ( λ )，由 5 個殘基組成)殘基(Morea 等，Methods20:267-279 (2000))。V κ輕鏈結(jié)構(gòu)域中的第一、第二和第三高變環(huán)在本文中被稱為L1(k )、L2(k )和L3(k )，并且可限定為包含VL結(jié)構(gòu)域中的25~33位(L1(k )，由6、7、8、11、12或13個殘基組成)、49~53位(L2 ( K)，由3個殘基組成)和90~97位(L3 ( K)，由6個殘基組成)殘基(Morea等，Methods20 =267-279 (2000)) ο VH結(jié)構(gòu)域中的第一、第二和第三高變環(huán)在本文中被稱為Hl、H2和H3，并且可限定為包含VH結(jié)構(gòu)域中的25~33位(H1，由7、8或9個殘基組成)、52至56位(H2，由3或4個殘基組成)和91至105位(H3，長度高度可變)殘基(Morea等，Methods20:267-279 (2000))。
[0290]除非另有說明，否則術(shù)語L1、L2和L3分別指VL結(jié)構(gòu)域的第一、第二和第三高變環(huán)，并且涵蓋得自V K和V λ兩種同種型的高變環(huán)。術(shù)語H1、Η2和Η3分別指VH結(jié)構(gòu)域的第一、第二和第三高變環(huán)，并且涵蓋得自任意已知重鏈同種型(包括Y、ε、δ、α或μ)的高變環(huán)。
[0291]高變環(huán)L1、L2、L3、HU Η2和Η3均可包含如下文中所限定的“互補決定區(qū)”或“CDR”的一部分。術(shù)語“高變環(huán)”和“互補決定區(qū)”不是嚴格意義的同義詞，因為高變環(huán)(HV)是基于結(jié)構(gòu)限定的，而互補決定區(qū)(⑶R)是基于序列可變性限定的(Kabat等，Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第 5 版.Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD.，1983)，并且 HV 和 CDR 的范圍在一些 VH 和 VL 結(jié)構(gòu)域中可以不同。 [0292]VL和VH結(jié)構(gòu)域的⑶R通?？上薅榘铝邪被?輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的24~34位(CDRLl)、50~56位(CDRL2)和89~97位(CDRL3)殘基，以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的 31 ~35 位或 31 ~35b 位(CDRHl)、50 ~65 位(CDRH2)和 95 ~102 位(CDRH3)殘基；(Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版.Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))。因此，除非另有說明，HV可包含在相應(yīng)的⑶R中，并且本文中涉及VH和VL結(jié)構(gòu)域的“高變環(huán)”時應(yīng)解釋為也涵蓋相應(yīng)的⑶R，反之亦然。
[0293]可變結(jié)構(gòu)域中保守性較高的部分稱為框架區(qū)(FR)，其如下文中所限定。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各包含四個FR(分別為FRl、FR2、FR3和FR4)，主要是采用β -片層構(gòu)型，它們通過三個高變環(huán)相連接。每條鏈中的高變環(huán)通過FR緊密相鄰，并與其它鏈中的高變環(huán)一起促成抗體的抗原結(jié)合位點的形成。對抗體的結(jié)構(gòu)分析披露了序列與通過互補決定區(qū)形成之結(jié)合位點的形狀之間的關(guān)系(Chothia等，J.Mol.Biol.227 =799-817(1992)；Tramontano等，J.Mol.Biol, 215:175-182 (1990))。盡管它們具有高度序列可變性，但六個環(huán)有五個只米用主鏈構(gòu)型的小庫(small repertoire),稱為“典型結(jié)構(gòu)(canomicalstructure) ”。這些構(gòu)型首先取決于環(huán)的長度，其次取決于環(huán)和框架區(qū)中某些位點上關(guān)鍵殘基的存在(其通過包裝、氫鍵鍵合或決定不尋常主鏈構(gòu)型的能力來確定構(gòu)型)。
[0294]“⑶R” 一本文中使用的術(shù)語“⑶R”或“互補決定區(qū)”表示見于重鏈多肽和輕鏈多肽二者的可變區(qū)中的非連續(xù)抗原組合位點。Kabat等，J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)和Kabat等，Sequences of protein of immunological interest.(1991),及Chothia等，J.Mol.Biol.196:901-917 (1987)以及 MacCallum 等，J.Mol.Biol.262:732-745 (1996)描述了這些特定區(qū)，其中當與彼此比較時，定義包括氨基酸殘基的重疊和子集。給出涵蓋以上所引用各參考文獻所限定之CDR的氨基酸殘基用于比對。優(yōu)選地，術(shù)語“CDR”是根據(jù)序列比對由Kabat所限定的CDR。
[0295]表1:CDR 定義
【權(quán)利要求】
1.抗體或其抗原結(jié)合片段，其與人CD70相結(jié)合，所述抗體或抗原結(jié)合片段包含至少一個重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和至少一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，其中，當作為Fab片段測試時，所述VH和VL結(jié)構(gòu)域?qū)θ刷?0表現(xiàn)出小于7 X ΙΟ、—1的解離速率(通過Biacore測量的koff)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中，當作為Fab片段測試時，所述VH和VL結(jié)構(gòu)域?qū)θ刷?0表現(xiàn)出5 X KT4s-1或更少并且優(yōu)選0.4 X ΙΟ?至4.8 X KT4s-1的解離速率。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其為包含兩個Fab區(qū)的抗體，其中，每個Fab區(qū)與人⑶70相結(jié)合并且當作為Fab片段測試時對人⑶70表現(xiàn)出0.4X ΙΟ、—1至.4.8X10^4s^的解離速率。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中與人CD70相結(jié)合的所述Fab區(qū)包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，其中所述VH和VL結(jié)構(gòu)域或者其一個或更多個互補決定區(qū)(CDR)來源于駱駝科動物物種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述VH和VL結(jié)構(gòu)域或者其一個或更多個CDR來源于大羊]!它(Llama glama)。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其與人CD70相結(jié)合并且抑制人⑶70與人⑶27之間的相互作用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其與人CD70相結(jié)合但不抑制人⑶70與人⑶27之間的相互作用。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含可變重鏈⑶R3、可變重鏈⑶R2和可變重鏈⑶R1，其中所述可變重鏈CDR3包含選自以下的氨基酸序列:
SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:5USEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQID NO:262和SEQ ID NO:263及所示序列中任一個的序列變體，其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換； 所述可變重鏈⑶R2任選地包含選自以下的氨基酸序列:SEQ ID NO: .306 [X1X2X3X4X5X6X7X8X9IyADSVKX10]的氨基酸序列，其中 X1是任意氨基酸，優(yōu)選為D、T、S或E， X2是任意氨基酸，優(yōu)選為I， X3是任意氨基酸，優(yōu)選為N、S、T或Y， X4是任意氨基酸，優(yōu)選為N、M、S或T， X5是任意氨基酸，優(yōu)選為E、D、Y或H， X6是任意氨基酸，優(yōu)選為G、D、S或N， X7是任意氨基酸，優(yōu)選為G、Y、S、D或M， X8是任意氨基酸，優(yōu)選為T、E、S、N、Y或R， X9是任意氨基酸，優(yōu)選為T、A或R，以及 X10是任意氨基酸，優(yōu)選為G或S，
以及 SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:258和SEQ ID NO:259的氨基酸序列及所示序列中任一個的序列變體，其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換；以及 所述可變重鏈⑶Rl任選地包含選自以下的氨基酸序列:SEQ ID NO: 307 [X1YYMN]的氨基酸序列，其中 X1是任意氨基酸，優(yōu)選為V、G或A，
SEQ ID NO:308[X1X2AMS]的氨基酸序列，其中 X1是任意氨基酸，優(yōu)選為D、T、S、N或G，以及 X2是任意氨基酸，優(yōu)選為Y、S或P，
以及 SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:256和SEQ ID NO:257的氨基酸序列及所示序列中任一個的序列變體，其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其還包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含可變輕鏈CDR3、可變輕鏈CDR2和可變輕鏈CDRl，其中所述可變輕鏈CDR3包含選自以下的氨基酸序列:
SEQ ID NO:148,SEQ ID NO: 149,SEQ ID NO: 150,SEQ ID NO:15USEQ ID NO:152、SEQID NO:153,SEQ ID NO: 154,SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156,SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO:.158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164,SEQ ID NO: 165,SEQ ID NO:166、SEQ ID NO: 166,SEQ ID NO:168、SEQ IDNO:271和SEQ ID NO:273及所示序列中任一個的序列變體，其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換； 所述可變輕鏈CDR2任選地包含選自以下的氨基酸序列: (a)SEQ ID NO:310 [X1IX2X3EHS]的氨基酸序列，其中 X1是任意氨基酸，優(yōu)選為N或S， X2是任意氨基酸，優(yōu)選為N、S或A，以及 X3是任意氨基酸，優(yōu)選為S、N或T， (b)SEQID NO:311「YYSDSX,XXQX,S1 的氨基酸序列，其中 X1是任意氨基酸，優(yōu)選為Y、V或L， X2是任意氨基酸，優(yōu)選為K或S， X3是任意氨基酸，優(yōu)選為H或N，以及 X4是任意氨基酸，優(yōu)選為G或S (c)SEQID NO:312「X肌NRPSl的氨基酸序列，其中 X1是任意氨基酸，優(yōu)選為V、I或Y，以及 X2是任意氨基酸，優(yōu)選為N或T， (d)SEQID NO:313「⑶NX1XJ3Ll的氨基酸序列，其中 X1是任意氨基酸，優(yōu)選為Y，以及 X2是任意氨基酸，優(yōu)選為R或M， (e)SEQID NO:314[X1DDX2EPS]的氨基酸序列，其中 X1是任意氨基酸，優(yōu)選為D或G，以及 X2是任意氨基酸，優(yōu)選為S或I，以及 SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:120 和 SEQ ID NO: 270的氨基酸序列及所示序列中任一個的序列變體，其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換；以及 所述可變輕鏈CDRl任選地包含選自以下的氨基酸序列: (a)SEQ ID NO:315「GIXSGSXJX,XXYPXJ 的氨基酸序列，其中 X1是任意氨基酸，優(yōu)選為S或T， X2是任意氨基酸，優(yōu)選為V或A， X3是任意氨基酸，優(yōu)選為S或T， X4是任意氨基酸，優(yōu)選為S、T或G， X5是任意氨基酸，優(yōu)選為N或H， X6是任意氨基酸，優(yōu)選為G、D或E， (b)SEQID NO:316[TlX1SX2X3X4X5GX6YDIS]的氨基酸序列，其中 X1是任意氨基酸，優(yōu)選為S、N或I， X2是任意氨基酸，優(yōu)選為G或A， X3是任意氨基酸，優(yōu)選為N或D， X4是任意氨基酸，優(yōu)選·為N或S， X5是任意氨基酸，優(yōu)選為V或I， X6是任意氨基酸，優(yōu)選為N或S， (c)SEQID NO:317「QGGNIXLYGANl 的氨基酸序列，其中 X1是任意氨基酸，優(yōu)選為G或W， (d)SEQID NO:318[RGDX1LX2X3YX4X5N]的氨基酸序列，其中 X1是任意氨基酸，優(yōu)選為S或T， X2是任意氨基酸，優(yōu)選為E或R， X3是任意氨基酸，優(yōu)選為R或N， X4是任意氨基酸，優(yōu)選為G或H， X5是任意氨基酸，優(yōu)選為T或A， (e)SEQID NO:319「GX^SGSVTSX,NFPTl 的氨基酸序列，其中 X1是任意氨基酸，優(yōu)選為V或L， X2是任意氨基酸，優(yōu)選為K或T， X3是任意氨基酸，優(yōu)選為T或D，
以及 SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:251、SEQ ID NO:252, SEQ ID NO:253、SEQ ID NO:267 和 SEQ ID NO:268 的氨基酸序列及所示序列中任一個的序列變體，其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含可變重鏈CDR3 (HCDR3)、可變重鏈 CDR2 (HCDR2)、可變重鏈 CDRl (HCDRl)、可變輕鏈 CDR3 (LCDR3)、可變輕鏈⑶R2 (IXDR2)和可變輕鏈⑶Rl (IXDRl)的組合，其中所述組合選自: (i)包含 SEQ ID NO:50 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:27 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO: 11 的HCDRl、包含 SEQ ID NO: 160 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:119 的 LCDR2 和包含 SEQ ID NO:250的 LCDRl ；
(ii)包含SEQ ID NO:49 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:26 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:10的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:148 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:109 的 LCDR2 和包含 SEQ ID NO:77的 LCDRl ；
(iii)包含SEQ ID NO:50 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:27 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:11的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:149 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:110 的 LCDR2 和包含 SEQ ID NO:78的 LCDRl ；
(iv)包含SEQ ID NO:50 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:28 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:11的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:150 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:111 的 LCDR2 和包含 SEQ ID NO:79的 LCDRl ；
(V)包含 SEQ ID NO:50 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:28 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO: 11 的HCDRl、包含 SEQ ID NO:151 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:110 的 LCDR2 和包含 SEQ ID NO:80的 LCDRl ；
(vi)包含SEQ ID NO:51 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:29 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:12的 HCDR1、包含 SEQ ID NO: 152 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:110 的 LCDR2 和包含 SEQ ID NO:80的 LCDRl ；
(vii)包含SEQ ID NO:52 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:30 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:13的 HCDR1、包含 SEQ ID NO: 153 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:112 的 LCDR2 和包含 SEQ ID NO:`81的 LCDRl ；
(viii)包含SEQ ID NO:53 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:31 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:14的 HCDR1、包含 SEQ ID NO:154 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:113 的 LCDR2 和包含 SEQ ID NO:82的 LCDRl ；
(ix)包含SEQ ID NO:54 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:32 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:15的 HCDR1、包含 SEQ ID NO:155 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:114 的 LCDR2 和包含 SEQ ID NO:83的 LCDRl ；
(X)包含 SEQ ID NO:55 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:33 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:16 的HCDRl、包含 SEQ ID NO:156 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:115 的 LCDR2 和包含 SEQ ID NO:84的 LCDRl ；
(xi)包含SEQ ID NO:56 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:34 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:17的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:157 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:116 的 LCDR2 和包含 SEQ ID NO:85的 LCDRl ；
(xii)包含SEQ ID NO:57 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:35 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:18的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:158 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:117 的 LCDR2 和包含 SEQ ID NO:84的 LCDRl ；
(xiii)包含SEQ ID NO:58 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:36 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:19的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:159 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:118 的 LCDR2 和包含 SEQ ID NO:86的 LCDRl ；
(xiv)包含SEQ ID NO:50 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:27 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:11的 HCDR1、包含 SEQ ID NO: 161 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO: 120 的 LCDR2 和包含 SEQ ID NO:.88的 LCDRl ；
(XV)包含 SEQ ID NO:50 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:27 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:11的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:162 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:121 的 LCDR2 和包含 SEQ ID NO:.89的 LCDRl ；
(xvi)包含SEQ ID NO:50 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:27 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:11的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:163 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:122 的 LCDR2 和包含 SEQ ID NO:.90的 LCDRl ；
(xvii)包含SEQ ID NO:51 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:29 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:12的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:164 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:123 的 LCDR2 和包含 SEQ ID NO:.91的 LCDRl ；
(xviii)包含SEQ ID NO:51 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:29 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:.12的 HCDRl、包含 SEQ ID NO: 164 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:124 的 LCDR2 和包含 SEQ IDNO:91 的 LCDRl ；
(xix)包含SEQ ID NO:59 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:37 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:12的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:165 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:125 的 LCDR2 和包含 SEQ ID NO:.92的 LCDRl ；
(XX)包含 SEQ ID NO:59 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:37 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:20的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:165 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:126 的 LCDR2 和包含 SEQ ID NO:.93的 LCDRl ；
(xxi)包含SEQ ID NO:59 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:37 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:20的 HCDR1、包含 SEQ ID NO: 166 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO: 127 的 LCDR2 和包含 SEQ ID NO:.92 的 LCDRl ；
(xxii)包含SEQ ID NO:59 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:37 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:20的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:167 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:128 的 LCDR2 和包含 SEQ ID NO:.94的 LCDRl ；
(xxiii)包含SEQ ID NO:59 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:37 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:.20 的 HCDRl、包含 SEQ ID NO: 168 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:110 的 LCDR2 和包含 SEQ IDNO:95 的 LCDRl ；
(xxiv)包含SEQ ID NO:262 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:258 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:.256的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:271 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:110 的 LCDR2 和包含 SEQ IDNO:267 的 LCDRl ；
(XXV)包含 SEQ ID NO:263 的 HCDR3、包含 SEQ ID NO:259 的 HCDR2、包含 SEQ ID NO:.257的 HCDRl、包含 SEQ ID NO:273 的 LCDR3、包含 SEQ ID NO:270 的 LCDR2 和包含 SEQ IDNO:268 的 LCDRl。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含具有選自以下的氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域:SEQ ID NO:177,SEQ ID NO: 178,SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180,SEQ ID NO:181、SEQ ID NO: 182,SEQ ID NO:183、SEQ ID NO: 184,SEQ IDNO:185, SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:.213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219,SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223、SEQ IDNO:224,SEQ IDNO:225、SEQ IDNO:226、SEQ IDNO:227、SEQ IDNO:228、SEQ ID NO:229、SEQID NO:274和SEQ ID NO:275的氨基酸序列以及與所示序列之一表現(xiàn)出至少90%、95%、.97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列；并且任選地包含具有選自以下的氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域:SEQ ID NO:189,SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:192、SEQID NO:193,SEQ ID NO: 194,SEQ ID NO:195、SEQ ID NO: 196,SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:.198,SEQ ID NO: 199,SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQID NO:204,SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:.209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232,SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:236、SEQ IDNO:237,SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243,SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:247、SEQ IDNO:248, SEQ ID NO:276和SEQ ID NO:277的氨基酸序列以及與所示序列之一表現(xiàn)出至少.90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的組合，其中所述組合選自: (i)包含SEQID NO:223之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:241之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； (ii)包含SEQID NO:177之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:189之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； (iii)包含SEQID NO:178之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:190之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； (iv)包含SEQID NO:179之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:191之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； (V)包含SEQ ID NO:179之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:192之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； (vi)包含SEQID NO:180之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:193之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； (vii)包含SEQID NO:181之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:194之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； (viii)包含SEQID NO:182之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:195之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； (ix)包含SEQID NO:183之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:196之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； (X)包含SEQ ID NO:184之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:197之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； (xi)包含SEQID NO:185之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:198之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；(xii)包含SEQID NO:186之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:199之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； (xiii)包含SEQID NO:187之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:200之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； (xiv)包含SEQID NO:178之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:201之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； (XV)包含SEQ ID NO:178之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:202之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； (xvi)包含SEQID NO:178之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:203之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； (xvii)包含SEQID NO:178之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:204之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； (xviii)包含SEQID NO:180之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:205之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； (xix)包含SEQID NO:180之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:206之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； (XX)包含SEQ ID NO:188之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:207之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； (xxi)包含SEQID NO:188之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:208之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；· (xxii)包含SEQID NO:188之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:209之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； (xxiii)包含SEQID NO:188之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:210之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； (xxiv)包含SEQID NO:188之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:211之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； (XXV)包含SEQ ID NO:274之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:276之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； (xxvi)包含SEQ ID NO:275之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:277之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
13.根據(jù)權(quán)利要求8或權(quán)利要求9所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中 所述可變重鏈CDR3包含SEQ ID NO:50或其序列變體的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成； 所述可變重鏈CDR2包含選自SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:249和其序列變體的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成；以及 所述可變重鏈CDRl包含選自SEQ ID NO:1U SEQ ID NO:248和其序列變體的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成，其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述可變重鏈CDR3包含 SEQ ID NO:50(DAGYSNHVPIFDS)或其序列變體或者由 SEQ ID NO:50 (DAGYSNHVPIFDS)或其序列變體組成； 所述可變重鏈CDR2包含SEQ ID NO:27 (DINNEGGTTYYADSVKG)或其序列變體或者由SEQID NO:27 (DINNEGGTTYYADSVKG)或其序列變體組成；以及 所述可變重鏈⑶Rl包含SEQ ID NO = Il(VYYMN)或其序列變體或者由SEQ ID NO:1l(VYYMN)或其序列變體組成， 其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或權(quán)利要求14所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述可變輕鏈CDR3包含SEQ ID NO:160或其序列變體或者由SEQ ID NO:160或其序列變體組成； 所述可變輕鏈CDR2包含選自SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:110和所示序列之序列變體的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成；以及 所述可變輕鏈 CDRl 包含選自 SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:251、SEQ IDNO:252,SEQ ID NO:253和所示序列之序列變體的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成，以及 其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述可變輕鏈CDR3包含 SEQ ID NO:160(ALFISNPSVE)或其序列變體或者由 SEQ ID NO: 160 (ALFISNPSVE)或其序列變體組成； 所述可變輕鏈CDR2包含SEQ ID NO:119 (NTNTRHS)或其序列變體或者由SEQ ID NO:119 (NTNTRHS)或其序列變體組成；并且 所述可變輕鏈CDRl包含SEQ ID NO`:250 (GLKSGSVTSDNFPT)或其序列變體或者由SEQID NO:250 (GLKSGSVTSDNFPT)或其序列變體組成， 其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述可變重鏈CDR3包含 SEQ ID NO:50 (DAGYSNHVPIFDS)或其序列變體或者由 SEQ ID NO:50 (DAGYSNHVPIFDS)或其序列變體組成； 所述可變重鏈CDR2包含SEQ ID NO:27 (DINNEGGTTYYADSVKG)或其序列變體或者由SEQID NO:27 (DINNEGGTTYYADSVKG)或其序列變體組成； 所述可變重鏈⑶Rl包含SEQ ID NO = Il(VYYMN)或其序列變體或者由SEQ ID NO:1l(VYYMN)或其序列變體組成； 所述可變輕鏈CDR3包含SEQ ID NO: 160 (ALFISNPSVE)或其序列變體或者由SEQ IDNO: 160 (ALFISNPSVE)或其序列變體組成； 所述可變輕鏈CDR2包含SEQ ID NO: 119 (NTNTRHS)或其序列變體或者由SEQ ID NO:119 (NTNTRHS)或其序列變體組成；以及 所述可變輕鏈CDRl包含SEQ ID NO:250 (GLKSGSVTSDNFPT)或其序列變體或者由SEQID NO:250 (GLKSGSVTSDNFPT)或其序列變體組成， 其中所述序列變體在所示序列中包含一個、兩個或三個氨基酸替換。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至8或13至17中任一項所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含(a)重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自以下的氨基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:223所示、其種系化變體(germlined variant)和親和變體的氨基酸序列以及與所述氨基酸序列有至少90%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自以下的氨基酸序列或由其組成:SEQ IDNO:241所示、其種系化變體和親和變體的氨基酸序列以及與所述氨基酸序列有至少90%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列；或者 (b)重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自以下的氨基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:225所示、其種系化變體和親和變體的氨基酸序列以及與所述氨基酸序列有至少90 %、95 %、97 %、98 %或99 %同一性的氨基酸序列，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自以下的氨基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:243所示、其種系化變體和親和變體的氨基酸序列以及與所述氨基酸序列有至少90%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列；或者 (c)重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自以下的氨基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:226所示、其種系化變體和親和變體的氨基酸序列以及與所述氨基酸序列有至少90 %、95 %、97 %、98 %或99 %同一性的氨基酸序列，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自以下的氨基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:244所示、其種系化變體和親和變體的氨基酸序列以及與所述氨基酸序列有至少90%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含 重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自以下的氨基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:178所示、其種系化變體和親和變體的氨基酸序列以及與所述氨基酸序列有至少90^^95^^97^^98%或99%同一性的氨基酸序列，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自以下的氨基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:190,SEQ ID NO:201、SEQ IDNO:202、SEQ ID NO:203和SEQ ID NO:204所不的氣基酸序列、所不序列的種系化變體和未和變體以及與所示序列有至少90%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含 a)重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其具有SEQID NO:178所示氨基酸序列并且在選自以下的Kabat位置處包含一個或更多個氨基酸替換:H6、H18、H24、H31、H56、H74、H74、H77、H79、H83、H84、H89、H93、H94、H108、H110 和 H112 ;以及 b)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其具有SEQID NO:201所示氨基酸序列并且在選自以下的Kabat位置處包含一個或更多個氨基酸替換:L2、L11、L12、L25、L26、L30、L46、L53、L60、L61、L67、L68、L76、L80、L81、L85 和 L87, 其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段的熱穩(wěn)定性比與這樣的抗體或其抗原結(jié)合片段的熱穩(wěn)定性更高，所述這樣的抗體或其抗原結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO:178所示之氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和具有SEQ ID NO:201所示之氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
21.分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其與根據(jù)權(quán)利要求8至20中任一項所述之抗體交叉競爭與人⑶70結(jié)合。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其表現(xiàn)出下述結(jié)合特性的組合:(d)在人CD70的氨基酸序列HIQVTLAICSS(SEQID NO:342)中進行結(jié)合； (e)與恒河猴(Macacamulatta)和食蟹猴(Macaca cynomolgus)的0)70同源物交叉反應(yīng); (f)與天然人⑶70和熱變性重組人⑶70結(jié)合。
23.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其在786-0腎癌細胞中部分內(nèi)化。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項任一項所述的抗體，其為大羊駝-人嵌合抗體，其中所述VH和VL結(jié)構(gòu)域或其一個或更多個CDR來源于大羊駝，并且一個或更多個恒定結(jié)構(gòu)域來源于人免疫球蛋白。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的抗體，其包含人IgG、優(yōu)選人IgGl的鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。
26.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其針對細胞表面上表達人CD70的細胞表現(xiàn)出選自以下的一種或更多種效應(yīng)子功能:抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)和抗體依賴性細胞介導(dǎo)的吞噬作用(ADCP)。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其針對表達CD70的癌細胞表現(xiàn)出抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)和抗體依賴性細胞的吞噬作用(ADCP)中的一種或更多種。
28.根據(jù)權(quán)利要求26或權(quán)利要求27所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其與包含天然人Fe結(jié)構(gòu)域的等價抗體相比表現(xiàn)出增強的ADCC功能。
29.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的抗體,其為非巖藻糖基化的IgG,優(yōu)選非巖藻糖基化的人IgGl。
30.分離的多核苷酸，其編碼根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的抗體或抗原結(jié)合片段。
31.包含根據(jù)權(quán)利要求30所述之多核苷酸的表達載體，所述多核苷酸與允許抗原結(jié)合多肽在宿主細胞或無細胞表達系統(tǒng)中表達的調(diào)控序列可操作性連接。
32.宿主細胞或無細胞表達系統(tǒng)，其包含根據(jù)權(quán)利要求31所述的表達載體。
33.產(chǎn)生重組抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，其包括在允許所述抗體或抗原結(jié)合片段表達的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求32所述的宿主細胞或無細胞表達系統(tǒng)，以及回收所表達的所述抗體或抗原結(jié)合片段。
34.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至29中任一項所述的抗體或抗原結(jié)合片段和至少一種可藥用載體或賦形劑。
35.免疫綴合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至29中任一項所述的抗體或抗原結(jié)合片段和細胞毒劑。
36.在人患者中抑制腫瘤細胞生長的方法，其包括向有此需要的患者施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至29中任一項所述的抗體或抗原結(jié)合片段。
37.根據(jù)權(quán)利要求1至29中任一項所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其用于在人患者中抑制表達⑶70之腫瘤細胞的生長。
38.根據(jù)權(quán)利要求1至29中任一項所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其用于在人患者中治療或預(yù)防癌癥。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述應(yīng)用的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述癌癥為表現(xiàn)出CD70的低拷貝數(shù)表達的癌癥，所述癌癥優(yōu)選地選自:大B細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病、皮膚T細胞淋巴瘤、胃癌、肺癌、黑素瘤、膠質(zhì)母細胞瘤和卵巢癌。
40.根據(jù)權(quán)利要求1至29中任一項所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其用于在人患者中治療免疫性病癥。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述應(yīng)用的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述免疫性病癥選自:自身免疫疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、多發(fā)性硬化癥、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血管炎、韋格納肉芽腫病、Churg-Strauss病、顯微鏡下多血管炎、免疫復(fù)合物性血管炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎、川崎病、巨細胞動脈炎、腎炎、白塞氏綜合征、主動脈炎和Takayasu病。
42.在人患者中消除表達CD70之細胞的方法，其包括向所述患者施用有效量的與人CD70結(jié)合的抗體，其中所述表達CD70的細胞在6小時后對所述抗體表現(xiàn)出30%或更少、25 %或更少、20 %或更少、15 %或更少、10 %或更少或者5 %或更少的內(nèi)化，并且其中所述抗體表現(xiàn)出選自ADCC、⑶C和ADCP的至少一種效應(yīng)子功能。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述表達CD70的細胞為表達CD70的癌細胞。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述表達CD70的癌細胞為選自以下的癌癥類型=Burkitt淋巴瘤、大B細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病、胰腺癌、胃癌、膠質(zhì)母細胞瘤和肺癌。
45.根據(jù)權(quán)利要求4 3所述的方法，其中所述表達CD70的癌細胞具有選自以下的癌癥類型=Burkitt淋巴瘤、大B細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病、套細胞淋巴瘤、胃癌和肺癌。
46.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述表達CD70的細胞為表達CD70的活化T細胞。
47.根據(jù)權(quán)利要求42至46中任一項所述的方法，其中所述與人CD70結(jié)合的抗體為駱駝科動物來源的。
48.根據(jù)權(quán)利要求42至46中任一項所述的方法，其中所述與人CD70結(jié)合的抗體為根據(jù)權(quán)利要求1至29中任一項所述的抗體。
49.根據(jù)權(quán)利要求42至48中任一項所述的方法，其中所述與人CD70結(jié)合的抗體不是抗體-藥物綴合物。
【文檔編號】C07K16/28GK103596979SQ201280013552
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年3月16日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月16日
【發(fā)明者】卡倫·西倫斯, 彼得·烏爾里希茨, 約翰內(nèi)斯·約斯夫·威廉默斯·德哈德, 托爾斯滕·德賴爾, 邁克爾·約翰·斯科特·桑德斯, 哈拉爾德·瓦永特, 索菲耶·馬里亞·埃爾維雷·加布里埃爾斯, 馬漢·莫希爾 申請人:阿爾金-X公司