特異性結(jié)合胰島素樣生長(zhǎng)因子1的抗體的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及特異性結(jié)合如下表位的分離的抗體，該表位包含在對(duì)人胰島素樣生長(zhǎng)因子1前體(SEQ?ID?NO:1)已知的范圍為氨基酸76至氨基酸84的氨基酸區(qū)段中。新的抗體具有極大效用，因?yàn)樗鼈冊(cè)试S甚至在存在高過(guò)量濃度的緊密相關(guān)的胰島素樣生長(zhǎng)因子2的情況下靈敏且特異性檢測(cè)胰島素樣生長(zhǎng)因子1?？梢岳缭隗w液樣品中檢測(cè)胰島素樣生長(zhǎng)因子1。
【專(zhuān)利說(shuō)明】特異性結(jié)合胰島素樣生長(zhǎng)因子1的抗體
[0001]發(fā)明背景
[0002]人胰島素樣生長(zhǎng)因子KUniProtKB 條目 P05019，IGF1_ 人，(SEQ ID NO:1)),也稱(chēng)為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素C和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素A，處于其成熟形式，即一種70個(gè)aa的多肽(SEQ IDNO: 2)，其與IGF-2和胰島素共享大段的序列同一性和高結(jié)構(gòu)同源性(Rinderknecht，E.和 Humbel, R.E.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA73 (1976) 2365-2369 ; Rinderknecht, E.和Humbel, R.E.，J.Biological Chemistry253(1978)2769-2776)。人 IGF-2 以 IGF-1 的 500倍摩爾過(guò)量存在于人血清中(Jones, J.1.和 Clemmons, D.R., Endocr.Rev.16 (1995) 3-34)。IGF-2的較高血清濃度及其與IGF-1的序列同源性是對(duì)IGF-1特異性免疫檢測(cè)的主要障礙。因此，生成清楚地在IGF-1和IGF-2之間進(jìn)行區(qū)分的IGF-1特異性抗體(即沒(méi)有與IGF-2的交叉反應(yīng)性的抗體)是具有挑戰(zhàn)性的，而且將構(gòu)成對(duì)體液樣品中IGF-1的特異性檢測(cè)的基石。
[0003]與胰島素類(lèi)似，IGF-1多肽鏈可分成域。IGF-1包含4個(gè)域，分別為B (氨基酸殘基1-29)、C (30-41)、A (42-62)和D (63-70)。域A和B分別是胰島素B和A鏈的結(jié)構(gòu)同源物，域C與胰島素原的連接肽類(lèi)似，而D域在胰島素中沒(méi)有對(duì)應(yīng)物。
[0004]如Manes S.等，J.Endocrinol.154 (1997) 293-302 總結(jié)的，認(rèn)為 IGF-1 介導(dǎo)生長(zhǎng)激素(GH)的促生長(zhǎng)活性(Sara, V.R.和 Hall, K.，Physiol Rev.70 (1990) 591-614)。在多種細(xì)胞類(lèi)型中經(jīng)由旁分泌或自分泌途徑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和存活的局部控制中，它也被視為是關(guān)鍵的(Jones J.1.和 Clemmons, D.R., Endocrin.Rev.16 (1995) 3-34)。已提出 IGF-1的假定受體，即 I 型 IGF 受體 (IGF-1R) (Ullrich, A.等，EMBO J.，5 (1986) 2503-2512)在腫瘤發(fā)生中起著關(guān)鍵作用(Sell, C.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90 (1993) 11217-11221)。有足夠證據(jù)指示許多腫瘤表達(dá)IGF-1R，且生成并向胞外環(huán)境分泌IGF-1或IGF-2 (Baserga, R.，Cell79(1994)927-930;Werner, H.等，Int.J.Biochem.Cell Biol.27 (1995)987-994)，由此以自分泌方式促進(jìn)連續(xù)細(xì)胞生長(zhǎng)。
[0005]IGF-1和IGF-12均在大量組織和細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)且可具有自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌功能。成熟的IGF-1和IGF-2在人、牛和豬蛋白之間高度保守(100%同一性)，且還展現(xiàn)出跨物種活性。IGFL(胰島素樣生長(zhǎng)因子樣)家族包括在人中的4種小的(約IlkDa)、可能分泌的家族成員和小鼠中的I種。
[0006]鑒于IGF-1的重要作用，生成IGF-1特異性的抗體，即沒(méi)有與IGF-2的交叉反應(yīng)性的抗體，對(duì)于IGF-1的特異性檢測(cè)既是挑戰(zhàn)性的也是極為重要的。盡管事實(shí)上已知胰島素樣生長(zhǎng)因子達(dá)超過(guò)30年，但迄今為止乃至今天在體液樣品中特異性檢測(cè)IGF-1或在組織樣品中定位蛋白質(zhì)胰島素樣生長(zhǎng)因子I仍然是困難的。這可能是例如由于本領(lǐng)域已知抗體的不充足的結(jié)合親和力和/或?qū)ο嚓P(guān)分子的不同水平交叉反應(yīng)性所致。
[0007]在IGF-1的血清檢測(cè)中，大多數(shù)儀器使用嚴(yán)格的清洗步驟來(lái)降低并克服其中使用的特異性結(jié)合劑(例如抗體)的非特異性結(jié)合。通常，通過(guò)用天然IGF-1免疫形成的抗體以比其識(shí)別IGF-2更高的親和力和抗原復(fù)合物穩(wěn)定性識(shí)別其真正的免疫原，所述IGF-2以較低的親和力和抗原復(fù)合物穩(wěn)定性起交叉反應(yīng)。例如，自用天然重組人IGF-1對(duì)小鼠的免疫活動(dòng)衍生的鼠單克隆抗體<IGF-1>-M2.28.44顯示對(duì)IGF-1的結(jié)合動(dòng)力學(xué)特征(signature)(見(jiàn)圖 8)為 KD=0.03xlCT9mol/L 親和力，t1/2解離=92min,而 IGF-2 以 KD=5xlCT9mol/L 的親和力和t1/2?w=5min結(jié)合。根本性差異在于抗原復(fù)合物穩(wěn)定性。這類(lèi)抗體對(duì)IGF-1特異性測(cè)定法的成功使用強(qiáng)烈依賴(lài)于儀器的清洗設(shè)置，因?yàn)樾枰鄬?duì)于〈IGF-D-M2.28.44交叉反應(yīng)性抗體消耗IGF-2。簡(jiǎn)言之，僅可以依靠復(fù)雜的清洗步驟來(lái)克服展現(xiàn)出與IGF-2的交叉反應(yīng)性的IGF-1結(jié)合抗體的技術(shù)限制。
[0008]不言自明的是，對(duì)于在平衡條件下，特別是在不實(shí)施抗體-抗原免疫復(fù)合物的任何清洗或純化規(guī)程的診斷系統(tǒng)中所應(yīng)用的抗體，IGF-1特異性要求高得多。在其它實(shí)施方案中，體內(nèi)情況原理上也以熱力學(xué)平衡為特征。因此，在平衡條件下，證實(shí)缺乏任何IGF-2相互作用尤其具有最重要的意義。
[0009]本發(fā)明的任務(wù)是開(kāi)發(fā)出克服本領(lǐng)域已知的這些問(wèn)題的抗體。適合于在平衡條件下應(yīng)用的IGF-1特異性抗體的關(guān)鍵要求不僅在于識(shí)別并以高親和力結(jié)合IGF-1，而且即使在高IGF-2血清濃度時(shí)也沒(méi)有可檢出的IGF-2結(jié)合ka(l/Ms)。
[0010]從原理上講，IGF-1和IGF-2之間的免疫學(xué)區(qū)分應(yīng)僅在相應(yīng)抗體靶向IGF-1表位，而該表位與IGF-2對(duì)應(yīng)物在氨基酸序列或構(gòu)象上明顯不同時(shí)才是可行的。事實(shí)上，在IGF-1和IGF-2之間僅有一個(gè)顯著的連續(xù)偏差，值得注意地在IGF-1氨基酸位置74-90處在IGF-1的轉(zhuǎn)角-環(huán)基序中，其以信號(hào)和前肽(UniPiOtKB條目P05019，IGF1_A)開(kāi)始編號(hào)。迄今為止，仍然不能使用天然IGF-1作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的免疫原通過(guò)常規(guī)免疫策略來(lái)獲得靶向作為表位的此IGF-1基序的抗體。
[0011]本發(fā)明涉及分離的抗體，其特異性結(jié)合在人胰島素樣生長(zhǎng)因子I前體(SEQ IDNO:1)中范圍為氨基酸76至氨基酸84的氨基酸區(qū)段內(nèi)的此真正的IGF-1表位。
[0012]新抗體具有極大效用，因?yàn)樗鼈冊(cè)试S甚至在存在大量過(guò)量的緊密相關(guān)的IGF-2的情況下靈敏且高度特異性檢測(cè)胰島素樣生長(zhǎng)因子I。
[0013]令人驚訝地，已發(fā)現(xiàn)可以利用人胰島素樣生長(zhǎng)因子I前體(SEQ ID NO:1)的氨基酸76至氨基酸90 (SEQ ID NO: 5)的氨基酸區(qū)段并將其工程化改造成替代免疫原，由此為生成特異性結(jié)合天然IGF-1的C域的抗體鋪平道路。我們還發(fā)現(xiàn)，在IGF-1的免疫學(xué)檢測(cè)中使用結(jié)合包含在人胰島素樣生長(zhǎng)因子I前體(SEQ ID NO:1)的氨基酸76至氨基酸84內(nèi)的表位的分離抗體可以具有極大的優(yōu)點(diǎn)。
[0014]發(fā)明概述
[0015]令人驚訝地，已發(fā)現(xiàn)結(jié)合胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-1)的相當(dāng)短的部分序列，即由SEQ ID NO:1代表的IGF-1前體的氨基酸76至84 (SEQ ID NO: 3)的抗體具有相當(dāng)有利的特性且能克服至少一些本領(lǐng)域中已知的問(wèn)題。
[0016]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的抗體，其結(jié)合包含在胰島素樣生長(zhǎng)因子I前體的氨基酸76-84(SEQ ID NO:3)內(nèi)的表位。
[0017]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，公開(kāi)了結(jié)合包含在SEQ ID NO: 3中的表位，或在此氨基酸區(qū)段內(nèi)的部分序列(SEQ ID NO:4)(例如范圍為IGF-1前體(SEQ ID NO:1)的氨基酸77至84)的單克隆抗體。
[0018]本發(fā)明還涉及特異性結(jié)合IGF-1的抗體的部分序列和免疫測(cè)定方法，所述方法包括下述步驟，將液體樣品與依照本發(fā)明的抗體一起溫育，由此發(fā)生所述抗體對(duì)所述樣品中胰島素樣生長(zhǎng)因子I的結(jié)合，并檢測(cè)所述樣品中結(jié)合至抗胰島素樣生長(zhǎng)因子I抗體的IGF-1。
[0019]發(fā)明詳述
[0020]成熟的人胰島素樣生長(zhǎng)因子I (IGF-1)具有約SkDa的分子量并由70個(gè)氨基酸組成。IGF-1包含4個(gè)明確限定的區(qū)域，分別是SEQ ID NO: 2的B (氨基酸殘基1_29)、C (30-41)、A (42-62)和 D (63-70)。
[0021]本發(fā)明涉及一種分離的抗體，其結(jié)合包含在胰島素樣生長(zhǎng)因子I的環(huán)區(qū)(SEQ IDNO:5)內(nèi)的表位。
[0022]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種分離的抗體，其在胰島素樣生長(zhǎng)因子I前體(SEQ ID NO:1)的氨基酸殘基76-84 (SEQ ID NO: 3)內(nèi)結(jié)合。換言之，依照本發(fā)明的分離的抗體結(jié)合包含在SEQ ID NO:3中的表位。
[0023]除非另外解釋?zhuān)疚闹惺褂玫乃屑夹g(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本文公開(kāi)的發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員的理解具有相同的意義。
[0024]冠詞“一個(gè)/ 一種”用于本文指一個(gè)/種或超過(guò)一個(gè)/種(即至少一個(gè)/種)冠詞語(yǔ)法對(duì)象。舉例而言，“一個(gè)/ 一種抗體”意指一個(gè)/種抗體或超過(guò)一個(gè)/種抗體。
[0025]“表位”是靶分子(例如抗原，如蛋白質(zhì)或核酸分子)上與抗原結(jié)合分子(例如抗體、抗體片段、含有抗體結(jié)合區(qū)的支架蛋白質(zhì)或適體)結(jié)合的位點(diǎn)。表位既可以從靶分子的連續(xù)殘基形成，也可以從鄰近的不連續(xù)殘基(例如氨基酸殘基)形成。從連續(xù)殘基(例如氨基酸殘基)形成的表位通常也稱(chēng)為線(xiàn)性表位。表位通常包含至少5個(gè)且多達(dá)約12個(gè)殘基，大多數(shù)介于6個(gè)和10個(gè)殘基(例如氨基酸殘基)之間?！胺蛛x的”抗體是已鑒定并與其天然環(huán)境的組分分開(kāi)和/或從其回收的抗體。其天然環(huán)境的污染物組分是會(huì)干擾抗體的研究、診斷或治療用途的材料，且可以包括酶、激素和其它蛋白質(zhì)性或非蛋白質(zhì)性溶質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，將抗體純化至按抗體重量計(jì)大于70%，如通過(guò)例如Lowry方法測(cè)定的，且在一些實(shí)施方案中，純化至按重量計(jì)超過(guò)80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將依照本發(fā)明的分離的抗體純化至超過(guò)90%純度，如通過(guò)還原性條件下的SDS-PAGE使用用于蛋白質(zhì)檢測(cè)的考馬斯藍(lán)染色測(cè)定的。
[0026]在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的抗體是多克隆抗體。結(jié)合包含在SEQ ID NO:3中的序列的多克隆抗體能夠例如通過(guò)免疫吸附獲得，其使用含有此序列的親和柱作為免疫吸附材料進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的抗體是單克隆抗體。
[0027]顯而易見(jiàn)的是，通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)方法根本不可能生成針對(duì)IGF-1C域的抗體。實(shí)際上，用天然重組的IGF-1免疫以及用自IGF-1衍生的肽免疫(Manes S.等，J.Endocrinol.154(1997)293-302)不能生成針對(duì)所述表位區(qū)域的單克隆抗體。最突出地，用包含胰島素樣生長(zhǎng)因子I前體的氨基酸76至84的線(xiàn)性多肽序列來(lái)免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不能生成既不對(duì)天然構(gòu)象性IGF-1，也不對(duì)其線(xiàn)性肽基序展現(xiàn)出結(jié)合活性的抗體。
[0028]早期為了免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物而試圖合成充足量的包含胰島素樣生長(zhǎng)因子I前體的氨基酸序列76至84的約束性IGF-1肽是不成功的。
[0029]基于本文中公開(kāi)的新方法，現(xiàn)在可以以可再現(xiàn)方式生成這類(lèi)難以獲得的抗體。簡(jiǎn)言之，本文中顯示的方法包括工程化嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus) SlyD的使用。SlyD IF (Insert-1n-Flap)底物結(jié)合域用來(lái)自胰島素樣生長(zhǎng)因子I前體的氨基酸序列76至84替換，由此構(gòu)成具有嫁接的肽免疫原的熱穩(wěn)定性支架模塊。
[0030]氨基酸嫁接物由嗜熱棲熱菌SlyD FKBP域以約束性、焓有利的方式呈現(xiàn)，其保留IGF-1插入基序的天然樣二級(jí)結(jié)構(gòu)。將此嵌合多肽用作免疫原以免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。針對(duì)完整多肽的體液免疫應(yīng)答也靶向插入基序。通過(guò)例如相對(duì)于野生型伴侶或相對(duì)于天然成熟的IGF-1進(jìn)行比較篩選，可以選出特異性識(shí)別IGF-1插入基序的抗體。如此，此嵌合多肽充當(dāng)天然IGF-1的替代多肽，且令人驚訝地，使得我們第一次能夠?qū)⒚庖邞?yīng)答導(dǎo)向預(yù)選擇的表位以生成高親和力抗體。
[0031]提供的方法及由此生成的抗體在研究和常規(guī)事務(wù)(例如對(duì)于治療和診斷性應(yīng)用兩者)中分別具有重大價(jià)值。
[0032]如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合人IGF-1”或“抗IGF-1抗體”是可交換的。優(yōu)選地，依照本發(fā)明的結(jié)合人IGF-1抗原的抗體具有于25 V為1.0xlO^mo 1/1或更低的Kd值，在一個(gè)實(shí)施方案中，于25°C為1.0X10_9mol/l或更低的Kd值。用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)合測(cè)定法如表面等離振子共振技術(shù)(BIAcore?, GE-Healthcare Uppsala, Sweden)測(cè)定結(jié)合親和力。用于測(cè)
定結(jié)合親和力的Kd值的方法記載`于實(shí)施例部分。如此，如本文中使用的，“結(jié)合人IGF-1的抗體”指于 25°C 以至少 1.0xl(T8mol/l 或更低的 Kd,優(yōu)選 KD1.0xl(T9mol/l 至 KD10xl(T12mol/I結(jié)合人IGF-1抗原的抗體。
[0033]本文中描述的抗體于25°C對(duì)IGF-2不顯示任何可測(cè)量的結(jié)合速率常數(shù)ka(l/Ms)。該抗體對(duì)IGF-1顯示從至少ka9X105(l/Ms)或更快(在擴(kuò)散限附近)的結(jié)合速率常數(shù)匕(1/Ms)。如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的抗體于25°C對(duì)IGF-2不顯示可測(cè)量的結(jié)合速
率常數(shù)。
[0034]在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的抗體于25°C顯示從至少kd2xl0_3(l/s)至kd3xl0_5(l/s)或更緩慢的抗原復(fù)合物穩(wěn)定性。
[0035]如熟練技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)的，術(shù)語(yǔ)“特異性”用于指示樣品中存在的其它生物分子不顯著結(jié)合特異性結(jié)合例如胰島素樣生長(zhǎng)因子I的抗體。優(yōu)選地，結(jié)合胰島素樣生長(zhǎng)因子I以外的生物分子的水平導(dǎo)致可忽略的，即依靠ELISA或例如使用BiaCore4000儀的親和力測(cè)定測(cè)量不到的結(jié)合親和力。
[0036]“特異性結(jié)合胰島素樣生長(zhǎng)因子I”的抗體不會(huì)結(jié)合胰島素樣生長(zhǎng)因子_2。更準(zhǔn)確地，使用高度靈敏性Biacore T200儀的動(dòng)力學(xué)測(cè)量不顯示這類(lèi)抗體對(duì)IGF-2的任何可測(cè)量的結(jié)合速率常數(shù)匕(腿8)，即使在高分析物濃度時(shí)(見(jiàn)例如圖7)。此外，“特異性結(jié)合胰島素樣生長(zhǎng)因子I”的抗體的特征在于在25°C對(duì)IGF-1的全功能性化學(xué)計(jì)量結(jié)合，其以一個(gè)抗體能夠同時(shí)結(jié)合兩個(gè)IGF-1多肽的方式進(jìn)行，該方式由從MR=L 7到MR=2.0的摩爾比(MR)值指示(見(jiàn)圖8)。
[0037]使用T200 儀(GE Healthcare, Biacore)測(cè)定結(jié)合親和力 KD。
[0038]Biacore T200儀(GE Healthcare)用于對(duì)雜交瘤培養(yǎng)上清液動(dòng)力學(xué)評(píng)估對(duì)IGF-1肽的結(jié)合特異性。將CM5系列S傳感器嵌入系統(tǒng)并依照制造商用法說(shuō)明書(shū)在HBSN緩沖液(IOmM HEPES pH7.4, 150mM NaCl)中標(biāo)準(zhǔn)化。將系統(tǒng)緩沖液變?yōu)?HBS-ET(IOmM HEPESPH7.4，150mM NaCl, 0.05%TWEEN20)。所述樣品緩沖液是補(bǔ)充有l(wèi)mg/ml CMD (羧甲基葡聚糖，Sigma#86524)的系統(tǒng)緩沖液。系統(tǒng)于25°C運(yùn)行。
[0039]將10000個(gè)RU RAMIgGFC(相對(duì)單位的相應(yīng)小鼠免疫球蛋白G亞類(lèi)的家兔抗小鼠F(c) Y片段/Jackson Laboratories)依照制造商用法說(shuō)明書(shū)固定化,其在流動(dòng)池FCl (亞類(lèi)I的抗小鼠F(C) Y )、FC2、FC3和FC4上使用EDC/NHS化學(xué)進(jìn)行。使用IM乙醇胺將傳感
器失活。
[0040]動(dòng)力學(xué)測(cè)試抗體對(duì)例如SEQ ID N0:3(IGF-176-84)的肽的結(jié)合活性。通過(guò)將在樣品緩沖液中以1:3稀釋的粗制雜交瘤上清液以10 μ 1/min注射I分鐘來(lái)捕捉抗體。
[0041]流速設(shè)定為100 μ 1/min。將例如SEQ ID NO: (IGF-1前體位置76-84)的肽以O(shè)nM、
1.1ηΜ、3ηΜ、10ηΜ、30ηΜ和90nM的不同濃度步驟分別注射3分鐘。使用Kinject命令監(jiān)測(cè)解離達(dá)600秒。實(shí)現(xiàn)傳感器表面的酸性再生,其使用IOmM甘氨酸pHl.5以30 μ Ι/min連續(xù)注射3次達(dá)30秒進(jìn)行。
[0042]在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的抗體以于25V為1.0xl0_8mol/l或更低的Kd值特異性結(jié)合包含在SEQ ID NO:3的氨基酸序列內(nèi)的表位，即包含在胰島素樣生長(zhǎng)因子I前體(SEQ ID NO:1)氨基酸76至84內(nèi)的表位。如上文提述的，依照本發(fā)明的多克隆抗體，即結(jié)合包含在SEQ ID N0:3中的表位的多克隆抗體可例如通過(guò)使用SEQ ID N0:3的肽進(jìn)行免疫吸附的免疫吸附從免疫后動(dòng)物的血清中分離。
[0043]可以以恒定質(zhì)量且以幾乎不受限制的數(shù)量生產(chǎn)單克隆抗體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合SEQ ID NO:3中包含的表位的抗體是單克隆抗體。
[0044]在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合SEQ ID NO: 3的抗體是由雜交瘤細(xì)胞系10.07.09 (生成MAb<h-1GF-l>M-10.07.09)生成的單克隆抗體。
[0045]新生成的兩種〈IGF-1〉單克隆抗體(分別是生成MAb〈h-1GF-l>M-l1.11.17的
I1.11.17 和生成 MAb〈h-1GF-l>M-ll.09.15 的 11.09.15)結(jié)合 SEQ ID NO:3 內(nèi)包含的甚至更小的表位，即它們結(jié)合由SEQ ID N0:4代表的表位。
[0046]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合包含胰島素樣生長(zhǎng)因子I前體的氨基酸76至84的表位，即結(jié)合成熟IGF-1的氨基酸28至36 (SEQ ID N0:4)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合SEQ ID N0:43到SEQ ID N0:49的合成的15聚體肽，即結(jié)合那些包含由胰島素樣生長(zhǎng)因子I前體的氨基酸76至84(SEQ ID NO:3)組成的表位的肽。
[0047]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合包含胰島素樣生長(zhǎng)因子I前體的氨基酸77至84(SEQ ID N0:4)的表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合SEQ ID N0:43到SEQ IDNO:50的合成的15聚體肽，即結(jié)合那些包含由胰島素樣生長(zhǎng)因子I的氨基酸77至84(SEQID NO:4)組成的表位的肽。
[0048]優(yōu)選地，如實(shí)施例部分描述的，通過(guò)PepScan分析評(píng)估抗體是否結(jié)合在SEQ IDN0:3或SEQ ID N0:4中分別給出的氨基酸序列的表位。例如，如果包含SEQ ID N0:3序列的各種PepScan肽在這類(lèi)分析中用研究的抗體測(cè)試呈陽(yáng)性，那么就承認(rèn)對(duì)SEQ ID N0:3的表位的結(jié)合。
[0049]本發(fā)明還涉及特異性結(jié)合IGF-1的抗體，其特征在于包含SEQ ID NO: 15的⑶R3區(qū)作為重鏈可變域⑶R3區(qū)。
[0050]優(yōu)選地，特異性結(jié)合IGF-1的抗體的特征在于，重鏈可變域包含SEQ ID NO: 15的CDR3 區(qū)和 SEQ ID NO: 16 的 CDR2 區(qū)。
[0051]優(yōu)選地，特異性結(jié)合IGF-1的抗體的特征在于，重鏈可變域包含SEQ ID NO: 15的CDR3 區(qū)、SEQ ID NO: 16 的 CDR2 區(qū)和 SEQ ID NO: 17 的 CDRl 區(qū)。[0052]本發(fā)明還涉及結(jié)合人IGF-1的抗體，其特征在于重鏈可變域包含SEQ ID NO: 15的CDR3H 區(qū)、SEQ ID NO: 16 的 CDR2H 區(qū)和 SEQ ID NO: 17 的 CDRlH 區(qū)，輕鏈可變域包含 SEQ IDNO: 18 的 CDR3L 區(qū)、SEQ ID NO: 19 的 CDR2L 區(qū)和 SEQ ID NO:20 的 CDRlL 區(qū)。
[0053]本發(fā)明還涉及一種抗體或其人源化型式，所述抗體特征在于重鏈可變域VH是SEQID NO: 21 ;且輕鏈可變域VL是SEQ ID NO: 22。
[0054]本發(fā)明還涉及特異性結(jié)合人IGF-1的抗體，其特征在于包含SEQ ID NO: 23的CDR3區(qū)作為重鏈可變域⑶R3區(qū)。
[0055]優(yōu)選地，特異性結(jié)合IGF-1的抗體的特征在于，重鏈可變域包含SEQ ID NO:23的CDR3 區(qū)和 SEQ ID NO:24 的 CDR2 區(qū)。
[0056]優(yōu)選地，特異性結(jié)合IGF-1的抗體的特征在于，重鏈可變域包含SEQ ID NO:23的CDR3 區(qū)、SEQ ID NO:24 的 CDR2 區(qū)和 SEQ ID NO:25 的 CDRl 區(qū)。
[0057]本發(fā)明還涉及結(jié)合人IGF-1的抗體，其特征在于重鏈可變域包含SEQ ID NO: 23的CDR3H區(qū)、SEQ ID NO:24的CDR2H區(qū)和SEQ ID NO:25的CDRlH區(qū)，且輕鏈可變域包含SEQID NO:26 的 CDR3L 區(qū)、SEQ ID NO:27 的 CDR2L 區(qū)和 SEQ ID NO:28 的 CDRlL 區(qū)。
[0058]本發(fā)明還涉及一種抗體或其人源化型式，所述抗體特征在于重鏈可變域VH是SEQID NO: 29 ;且輕鏈可變域VL是SEQ ID NO: 30。[0059]本發(fā)明還涉及一種抗體或其人源化型式，所述抗體特征在于重鏈可變域VH是SEQID NO: 31 ;且輕鏈可變域VL是SEQ ID NO: 32。
[0060]在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的抗體是單克隆的。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的抗體是人源化的或人的。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的抗體是IgGl或IgG4亞類(lèi)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的抗體是IgGl亞類(lèi)的單克隆人源化抗體。
[0061]本發(fā)明還涉及嵌合的或人源化的抗體，其包含分別為SEQ ID N0:15或SEQ IDNO:23 的 HCDR3。
[0062]術(shù)語(yǔ)“抗體”涵蓋抗體結(jié)構(gòu)的各種形式，包括但不限于全抗體和抗體片段。優(yōu)選地，依照本發(fā)明的抗體是人抗體、人源化抗體、嵌合抗體或者是另外的經(jīng)遺傳工程化的抗體，只要保留依照本發(fā)明的特征性特性。
[0063]“抗體片段”包含全長(zhǎng)抗體的一部分，優(yōu)選是其可變域，或至少是其抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w片段的例子包括雙抗體、單鏈抗體分子和從抗體片段形成的多特異性抗體。scFv抗體例如記載于 Huston, J.S.，Methods in Enzymol.203 (1991) 46-88。另外，抗體片段包含單鏈多肽，其具有結(jié)合IGF-1的Vh域或\域的屬性，所述Vh域能與\域裝配在一起，所述\域能與Vh域裝配在一起，從而形成功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)并由此提供依照本發(fā)明的抗體的特性。
[0064]如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指具有單一氨基酸組成的抗體分子的制備物。
[0065]術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”指包含來(lái)自小鼠的可變區(qū)(即結(jié)合區(qū))和自不同來(lái)源或物種衍生的恒定區(qū)的至少一部分的單克隆抗體，其通常通過(guò)重組DNA技術(shù)制備。特別優(yōu)選包含小鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體。這類(lèi)小鼠/人嵌合抗體是表達(dá)的免疫球蛋白基因的產(chǎn)物，該基因包含編碼小鼠免疫球蛋白可變區(qū)的DNA區(qū)段和編碼人免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA區(qū)段。本發(fā)明涵蓋的“嵌合抗體”的其它形式是那些其中類(lèi)或亞類(lèi)已從原始抗體修飾或改變的形式。這類(lèi)“嵌合”抗體也稱(chēng)為“類(lèi)轉(zhuǎn)換抗體”。用于生成嵌合抗體的方法牽涉本領(lǐng)域中現(xiàn)在公知的常規(guī)的重組DNA和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。參見(jiàn)例如Morrison, S.L.等，Proc.Natl.Acad Sc1.USA81(1984)6851-6855;US5, 202，238 和 US5, 204，244。
[0066]術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”或“抗體的人源化型式”指其中框架或“互補(bǔ)決定區(qū)”(CDR)已經(jīng)經(jīng)過(guò)修飾以包含相比于親本免疫球蛋白的特異性具有不同特異性的免疫球蛋白的CDR的抗體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將VH和VL的CDR嫁接到人抗體的框架區(qū)中以制備“人源化抗體”。參見(jiàn)例如 Riechmann, L.等，Nature332 (1988) 323-327 ;和 Neuberger, Μ.S.等，Nature314 (1985) 268-270。重鏈和輕鏈可變框架區(qū)可自相同或不同的人抗體序列衍生。人抗體序列可以是天然存在的人抗體的序列。人重鏈和輕鏈可變框架區(qū)列于例如Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology(2000)-AppendixlPA.1P.1-A.1P.37中且可經(jīng)由IMGT,國(guó)際ImMunoGeneTics信息系統(tǒng)? (http://imgt.cines.fr)或經(jīng)由http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk獲得。任選地,可通過(guò)進(jìn)一步突變來(lái)修飾框架區(qū)。特別優(yōu)選的⑶R對(duì)應(yīng)于那些代表識(shí)別上文針對(duì)嵌合抗體所記載的抗原的序列的⑶R。優(yōu)選地，這類(lèi)人源化型式嵌合有人恒定區(qū)。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”還包括在恒定區(qū)中經(jīng)過(guò)修飾以生成依照本發(fā)明的特性(尤其是關(guān)于Clq結(jié)合和/或FcR結(jié)合方面)的這類(lèi)抗體，例如通過(guò)“類(lèi)轉(zhuǎn)換”，即改變或突變Fe部分(例如從IgGl變?yōu)镮gG4和/或IgGl/IgG4突變)實(shí)現(xiàn)。 [0067]如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“人抗體”意圖包括具有自人種系免疫球蛋白序列衍生的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。人抗體是現(xiàn)有技術(shù)中公知的(van Dijk, Μ.Α.和van deffinkel, J.G.，Curr.0pin.Chem.Biol.5 (2001) 368-374)。人抗體還可在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)中產(chǎn)生，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在免疫后在缺乏內(nèi)源性免疫球蛋白生成的情況下能生成人抗體的完整全集或選擇。人種系免疫球蛋白基因陣列在這類(lèi)種系突變體小鼠中的轉(zhuǎn)移將導(dǎo)致抗原攻擊時(shí)人抗體的生成(參見(jiàn)例如Jakobovits, A.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90 (1993) 2551-2555;Jakobovits,A.等，Nature362 (1993)255-258;Brueggemann, M.D.等，Yearlmmunol.7 (1993) 33-40)。人抗體還可以在卩遼菌體展示文庫(kù)中生成(Hoogenboom, H.R.和 Winter, G.，J.Mol.Biol.227 (1992) 381-388; Marks, J.D.等，J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。還可使用Cole, A.等和Boerner，P.等的技術(shù)來(lái)制備人單克隆抗體(Cole, A.等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Liss, A.R.(1985) p.77;和Boerner, P.等，J.1mmunol.147(1991)86-95)。如已對(duì)依照本發(fā)明的人源化抗體提述的，如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“人抗體”還包括在恒定區(qū)中經(jīng)過(guò)修飾以生成依照本發(fā)明的特性(尤其是關(guān)于Clq結(jié)合和/或FcR結(jié)合方面)的這類(lèi)抗體，例如通過(guò)“類(lèi)轉(zhuǎn)換”，即改變或突變Fe部分(例如從IgGl變?yōu)镮gG4和/或IgGl/IgG4突變)實(shí)現(xiàn)。
[0068]如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“重組人抗體”意圖包括通過(guò)重組手段制備、表達(dá)、創(chuàng)造或分離的所有人抗體，如從宿主細(xì)胞如NSO或CHO細(xì)胞或從對(duì)于人免疫球蛋白基因?yàn)檗D(zhuǎn)基因的動(dòng)物(例如小鼠)分離的抗體，或者使用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體所表達(dá)的抗體。這類(lèi)重組的人抗體具有重排形式的可變區(qū)和恒定區(qū)。依照本發(fā)明的重組人抗體已進(jìn)行過(guò)體內(nèi)體細(xì)胞高突變。如此，重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，盡管其自人種系VH和VL序列衍生并與之相關(guān)，但可能不天然存在于體內(nèi)人抗體種系全集內(nèi)。
[0069]已證實(shí)依照本發(fā)明的抗體在借助于免疫測(cè)定法從液體樣品檢測(cè)胰島素樣生長(zhǎng)因子I中極為有用。
[0070]免疫測(cè)定法是熟練的技術(shù)人員公知的。用于實(shí)施這類(lèi)測(cè)定的方法以及實(shí)際應(yīng)用和規(guī)程匯總在相關(guān)教科書(shū)中。相關(guān)教科書(shū)的例子是Tijssen, P.，Preparation ofenzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates, 于:Practice andTheory of Enzyme Immunoassays, pp.221-278, Burdon, R.H.和 v.Knippenberg, P.H.(eds.), Elsevier, Amsterdam(1990),和涉及免疫學(xué)檢測(cè)方法的 Methods inEnzymology, Colowick, S.P.和Caplan, N.0.(編)，Academic Press 的多個(gè)卷,特別是卷70、73、74、84、92 和 121。[0071]在依照本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，在免疫測(cè)定規(guī)程中測(cè)量IGF-1蛋白。
[0072]在某些實(shí)施方案中，在酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)或基于電化學(xué)發(fā)光的免疫測(cè)定法(ECLIA)中檢測(cè)IGF-1。
[0073]在一個(gè)實(shí)施方案中，在夾心式測(cè)定法(夾心型測(cè)定法形式)中檢測(cè)IGF-1。在一個(gè)實(shí)施方案中，IGF-1的測(cè)量在夾心式免疫測(cè)定法中實(shí)施，其采用與至少兩種不重疊表位反應(yīng)性的至少兩種抗體進(jìn)行。
[0074]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于經(jīng)由夾心式免疫測(cè)定法檢測(cè)體液樣品中的IGF-1的方法，該方法包括以下步驟:將樣品與依照本發(fā)明的抗體一起溫育，由此發(fā)生所述抗體對(duì)所述樣品中胰島素樣生長(zhǎng)因子I的結(jié)合，將樣品與結(jié)合不包含IGF-1的氨基酸76至84的表位的針對(duì)IGF-1的二抗一起溫育，由此發(fā)生二抗的結(jié)合，并測(cè)量在步驟(a)和(b)中形成的免疫夾心式復(fù)合物，由此檢測(cè)樣品中的IGF-1。
[0075]夾心式測(cè)定法是最有用的且普遍使用的測(cè)定法之一。存在許多夾心測(cè)定技術(shù)的變化，且所有均意圖為本發(fā)明涵蓋。簡(jiǎn)言之，在一種典型的正向測(cè)定法中，將未標(biāo)記的抗體固定化于固體基底(或固相)上，并使要測(cè)試的樣品與結(jié)合的分子接觸。此捕獲抗體的固定化可通過(guò)直接吸附于固相，或例如經(jīng)由特異性結(jié)合對(duì)，例如經(jīng)由鏈霉親合素-生物素結(jié)合對(duì)間接吸附于固相實(shí)現(xiàn)。在合適的溫育期后，達(dá)到足以允許形成抗體-抗原復(fù)合物的時(shí)段，然后，添加用能夠產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的報(bào)告分子標(biāo)記的、結(jié)合該抗原的二抗，并溫育，允許足以形成抗體-抗原-經(jīng)標(biāo)記的抗體的夾心式復(fù)合物的時(shí)間。洗掉任何未反應(yīng)的材料，并通過(guò)觀(guān)察由報(bào)告分子產(chǎn)生的信號(hào)來(lái)測(cè)定IGF-1的存在。結(jié)果可以是定性的，即通過(guò)簡(jiǎn)單觀(guān)察可見(jiàn)信號(hào)，或者可以通過(guò)與含有已知量的生物標(biāo)志物的對(duì)照樣品比較來(lái)定量。
[0076]在典型的夾心式測(cè)定法中，第一抗體共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合于固體表面。固體表面通常是玻璃或聚合物，最通常使用的聚合物是纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固體支持物可以以管、珠、微板的盤(pán)或任何其它適用于進(jìn)行免疫測(cè)定法的表面的形式。結(jié)合過(guò)程是本領(lǐng)域中公知的，且一般由交聯(lián)、共價(jià)結(jié)合或物理吸附組成。通常對(duì)經(jīng)抗體包被的固體表面(“固相復(fù)合物”)進(jìn)行處理以封閉非特異性結(jié)合并清洗，為測(cè)試樣品做準(zhǔn)備。然后，向固相復(fù)合物添加要測(cè)試的樣品的等分試樣，并在合適的條件(例如從室溫到400C，如介于25°C和32°C之間，包含端點(diǎn))下溫育足夠的一段時(shí)間(例如2_40分鐘或者若更方便的話(huà)，過(guò)夜)，所述條件和時(shí)間段容許第一抗體或捕獲抗體與相應(yīng)抗原之間結(jié)合。在該溫育期后，清洗包含第一抗體或捕獲抗體及與其結(jié)合的抗原的固相，并與結(jié)合抗原上另一表位的二抗或經(jīng)標(biāo)記的抗體一起溫育。該二抗與報(bào)告分子連接，其用于指不二抗對(duì)第一抗體和感興趣抗原的復(fù)合物的結(jié)合。[0077]測(cè)定法的變化包括同時(shí)測(cè)定法，其中向結(jié)合的抗體或能夠結(jié)合至固相的抗體同時(shí)添加樣品和經(jīng)標(biāo)記的抗體兩者。這些技術(shù)是本領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的，其包括如會(huì)容易顯而易見(jiàn)的任何次要變化。
[0078]—種備選的競(jìng)爭(zhēng)性方法牽涉將IGF-1固定化于固相上，然后將此固定化的靶物連同樣品一起暴露于針對(duì)IGF-1的特異性抗體(其可以用或不用報(bào)告分子標(biāo)記)。根據(jù)靶物的量和報(bào)告分子信號(hào)的強(qiáng)度，靶分子的競(jìng)爭(zhēng)經(jīng)由這類(lèi)經(jīng)標(biāo)記的抗體可以直接可檢測(cè)?；蛘?，可以將特異性結(jié)合IGF-1的抗體固定化且可經(jīng)由樣品中的IGF-1與經(jīng)標(biāo)記的IGF-1的競(jìng)爭(zhēng)來(lái)測(cè)定IGF-1。
[0079]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用體液作為樣品材料來(lái)實(shí)踐依照本發(fā)明的方法。在一個(gè)別的實(shí)施方案中，體液樣品選自全血、血清或血衆(zhòng)。在一個(gè)別的實(shí)施方案中，所述樣品材料是血清或血漿。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于測(cè)量IGF-1的免疫測(cè)定法使用血清作為樣品材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于測(cè)量IGF-1的免疫測(cè)定法使用尿液作為樣品材料。
[0080]對(duì)于在IGF-1檢測(cè)中的使用，本發(fā)明還提供試劑盒或制品。這些試劑盒可包含載體手段，其區(qū)室化為在緊密約束中接受一個(gè)或多個(gè)容器手段如管形瓶、管等，每個(gè)容器手段包含要在所述方法中使用的不同要素之一。例如，一個(gè)容器手段可包含依照本發(fā)明的抗體。試劑盒還可具有包含報(bào)告手段，如與報(bào)告分子(如酶、熒光或放射性同位素標(biāo)記物)結(jié)合的結(jié)合IGF-1的二抗的容器。這類(lèi)試劑盒將通常包含如上文描述的容器和一個(gè)或多個(gè)包含從商業(yè)和用戶(hù)觀(guān)點(diǎn)而言期望的材料的其它容器，所述材料包括緩沖劑、稀釋劑、濾器、針、注射器和具有使用說(shuō)明的包裝插頁(yè)。容器上可存在標(biāo)簽以指示該組合物用于特定應(yīng)用，且還可指示使用指導(dǎo)。
[0081]在一個(gè)別的具體的 實(shí)施方案中，對(duì)于基于抗體的試劑盒，該試劑盒可包含例如:
(I)特異性結(jié)合IGF-1的第一抗體(例如附接于固體支持物或能夠結(jié)合固體支持物)和(2)結(jié)合IGF-1的第二不同抗體。優(yōu)選地，后一抗體用報(bào)告分子標(biāo)記。當(dāng)然，在設(shè)計(jì)此類(lèi)測(cè)定法時(shí)，還可以將第一抗體交換為第二抗體或反之亦然。
[0082]提供以下實(shí)施例、序列表和圖以幫助對(duì)本發(fā)明的理解，其真實(shí)范圍在所附權(quán)利要求書(shū)中列出。應(yīng)理解可在不背離本發(fā)明的精神的前提下對(duì)所列規(guī)程進(jìn)行修改。
[0083]序列表的描述
[0084]SEQ ID NO:1 人胰島素樣生長(zhǎng)因子I前體的序列
[0085]SEQ ID NO:2 成熟人胰島素樣生長(zhǎng)因子I的序列
[0086]SEQ ID NO: 3 人胰島素樣生長(zhǎng)因子I前體的部分序列(位置76至84)
[0087]SEQ ID NO:4 人胰島素樣生長(zhǎng)因子I前體的部分序列(位置77至84)
[0088]SEQ ID NO: 5 人胰島素樣生長(zhǎng)因子I前體的部分序列(位置74至90)
[0089]SEQ ID NO:6 人工序列:(gly-gly-gly-ser)
[0090]SEQ ID NO:7 人工序列:(His 標(biāo)簽)
[0091]SEQ ID NO:8 人工序列:FkBP-1GF-1 (M-9O)融合蛋白
[0092]SEQ ID NO:9 人工序列:SlyD-FkBP-1GF-l (74-90)融合蛋白
[0093]SEQ ID NO: 10人工序列:嗜熱棲熱菌-SlyD-1GF-l (74-90)融合蛋白
[0094]SEQ ID NO: 11 人工序列:嗜熱棲熱菌(Thermus thermophile)野生型SlyD蛋白
[0095]SEQ ID NO: 12人工序列:缺少I(mǎi)F域的嗜熱棲熱菌SlyD[0096]SED ID NO: 13 人工序列:Thermococcus gammatolerans SlyD-1GF-1 (74-90)融合蛋白
[0097]SED ID NO: 14 人工序列:Thermococcus gammato lerans SlyD-1GF-2 (53-65)融合蛋白
[0098]SEQ ID NO: 15 MAbl0.07.09 的重鏈 CDR3H
[0099]SEQ ID NO: 16 MAb 10.07.09 的重鏈 CDR2H
[0100]SEQ ID NO: 17 MAbl0.07.09 的重鏈 CDRlH
[0101]SEQ ID NO: 18 MAb 10.07.09 的輕鏈 CDR3H
[0102]SEQ ID NO: 19 MAb 10.07.09 的輕鏈 CDR2H
[0103]SEQ ID NO:20 MAb 10.07.09 的輕鏈 CDRlH
[0104]SEQ ID NO: 21 MAbl0.07.09 的重鏈可變域 VH
[0105]SEQ ID NO:22 MAbl0.07.09 的輕鏈可變域 VL
[0106]SEQ ID NO: 23 MAbll.11.17 的重鏈 CDR3H
[0107]SEQ ID NO: 24 MAbll.11.17 的重鏈 CDR2H [0108]SEQ ID NO: 25 MAbll.11.17 的重鏈 CDRlH
[0109]SEQ ID NO: 26 MAbll.11.17 的輕鏈 CDR3H
[0110]SEQ ID NO: 27 MAbll.11.17 的輕鏈 CDR2H
[0111]SEQ ID NO: 28 MAbll.11.17 的輕鏈 CDRlH
[0112]SEQ ID NO: 29 MAbll.11.17 的重鏈可變域 VH
[0113]SEQ ID NO: 30 MAblL IL 17 的輕鏈可變域 VL
[0114]SEQ ID NO: 31 MAbll.09.15 的重鏈可變域 VH
[0115]SEQ ID NO: 32 MAbll.09.15 的輕鏈可變域 VL
[0116]SED ID NO:33-62表位分析中使用的人胰島素樣生長(zhǎng)因子I前體的部分序列。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0117]圖1嗜熱棲熱菌SlyD-1GF-1 (74-90)融合多肽的SDS PAGE (考馬斯染色)和抗his標(biāo)簽Western印跡(10秒暴露)。M-Novex Sharp標(biāo)準(zhǔn)品；1_2.5 μ g嗜熱棲熱菌 SlyD-1GF-1 (74-90)融合多肽;2_5.0yg 嗜熱棲熱菌 SlyD-1GF-1 (74-90)融合多肽；3-10 μ g 嗜熱棲熱菌 SlyD-1GF-1 (74-90)融合多肽；M*_Magic Mark。
[0118]圖2嗜熱棲熱菌SlyD-1GF-1 (74-90)融合多肽的分析性HPLC層析譜(上方線(xiàn):分子量標(biāo)準(zhǔn)品；下方線(xiàn):融合多肽)。
[0119]圖312周免疫后通過(guò)ELISA測(cè)定的小鼠中的血清滴度，其分別使用嗜熱棲熱菌SlyD-1GF-1 (74-90)和人IGF-1 (=IGF-1)作為捕捉抗原進(jìn)行(mE=毫吸光度)。
[0120]圖4對(duì)原代培養(yǎng)物的ELISA篩選，其顯示對(duì)IGF-1、嗜熱棲熱菌SlyD-1GF-1 (74-90)融合多肽和嗜熱棲熱菌野生型SlyD多肽的結(jié)合信號(hào)(mE=毫吸光度，IGF-1=人IGF-1)。
[0121]圖5原代培養(yǎng)物〈IGF-DM-11.0.15對(duì)IGF-1、IGF-2、嗜熱棲熱菌SlyD-1GF-1 (74-90)融合多肽和嗜熱棲熱菌野生型SlyD多肽的例示性BIAcore動(dòng)力學(xué)篩選。(該原代培養(yǎng)物稱(chēng)為11.0.15，而在最終克隆后名稱(chēng)是11.10.15)。
[0122]圖6克隆培養(yǎng)上清液對(duì)IGF-1、嗜熱棲熱菌SlyD-1GF-1 (74-90)融合多肽和嗜熱棲熱菌野生型SlyD多肽的ELISA篩選。用IGF-1和嗜熱棲熱菌SlyD-1GF-1 (74-90)融合多肽檢測(cè)到指示改進(jìn)的結(jié)合親和力的升高的吸收信號(hào)。
[0123]圖 7〈IGF-1>M-11.11.17-1gG 對(duì) IGF_1、IGF_2、嗜熱棲熱菌 SlyD-1GF-1 (74-90)融合多妝、嗜熱棲熱菌野生型SlyD多妝、Thermococcus gammato lerans野生型SlyD多妝嗜熱棲熱菌 SlyD- Δ IF 融合多妝和 Thermococcus gammato I eransSlyD-1GF-2 (53-65)融合多肽的BIAcore測(cè)量。
[0124]圖8具有新開(kāi)發(fā)的抗IGF-1抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)的表。mAb:單克隆抗體；RU:傳感器上捕獲的單克隆抗體的相對(duì)應(yīng)答單位；抗原:溶液中抗原；kDa:作為溶液中分析物注射的抗原的分子星；ka:結(jié)合速率常數(shù)；kd:解尚速率常數(shù);t"2解離:依照公式ti/2解離=In (2)/60xkd計(jì)算的抗體-抗原復(fù)合物半衰期；KD:解離常數(shù):90nM分析物注射結(jié)合階段結(jié)束時(shí)的結(jié)合信號(hào)；MR:摩爾比；X2:測(cè)量的卡方檢驗(yàn)；n.d.:未檢出。
實(shí)施例
[0125]實(shí)施例1
[0126]生成單克隆抗體的通用規(guī)程
[0127]將預(yù)配制的融合 多肽免疫原以不同劑量對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹膜內(nèi)施用，所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如小鼠、大鼠、家兔、綿羊或倉(cāng)鼠。在收集B細(xì)胞前，實(shí)施加強(qiáng)免疫?？梢勒誎oehler和Milstein (Koehler, G.和 Milstein, C.，Nature256 (1975) 495-497)的方法獲得 B 細(xì)胞雜交瘤。將獲得的雜交瘤作為單一克隆或細(xì)胞存儲(chǔ)在多孔板的孔中。用動(dòng)力學(xué)篩選方法進(jìn)一步篩選分泌的抗體就抗體結(jié)合而言測(cè)試呈陽(yáng)性的原代雜交瘤培養(yǎng)物。
[0128]實(shí)施例2
[0129]使用SlyD/FKBP12-1GF_l (74-90)融合多肽生成針對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子I的抗體
[0130]在針對(duì)IGF-1的單克隆抗體的生成中，可將包含氨基酸序列NKPTGYGSSSRRAPQTG(SEQ ID NO:5)的融合多肽用于免疫實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物。
[0131]為了改進(jìn)免疫原性多肽的呈現(xiàn)，SEQ ID NO:5的IGF-1轉(zhuǎn)角-環(huán)基序側(cè)翼可以有在該氨基酸序列N端和C端的GGGS接頭(SEQ ID NO: 6)，或者有在IGF-1氨基酸序列N端的HG 二肽以及有在IGF-1氨基酸序列C端的GA 二肽。
[0132]將SlyD/FKBP12-1GF_l (74-90)融合多肽用作免疫原以及也用作開(kāi)發(fā)抗IGF-1抗體的篩選試劑，該抗IGF-1抗體特異性結(jié)合由NKPTGYGSSSRRAPQTG(SEQ ID NO:5)組成的IGF-1氨基酸序列。
[0133]還包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列標(biāo)簽的FKBP12-1GF-1 (74-90)融合多肽具有以下氨基酸序列:
[0134]MGVQVETISP⑶GRTFPKRGQTAVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGGGGSNKPTGYGSSSRRAPQTGGGSTLVFDVELLXLEGGGSKKHHHHHHHH(SEQ IDNO: 8)
[0135]包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列標(biāo)簽的SlyD/FKBP12_IGF_l (74-90)融合多肽具
有以下氨基酸序列:
[0136]MKVAKDLWSLAYQVRTEDGVLVVESPVSAPLDYLHGHGSLISGLEIALLGHEV ⑶ KFDVA VGANDAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRPLAETDQGPVPVEITAVEDDHVVVDGNHMLAGQNLKFNVEVVAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGGVQVETISP⑶GRTFPKRGQTAVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVSQRAKLTISPDYAYGGGGSNKPTGYGSSSKRAPQTGGGGSTLVFDVELLKLEGGGSRKHHHHHHHH(SLQ ID NO:9).[0137]使用ELISA分析從用SlyD/FKBP12-1GF_l (74-90)融合多肽免疫過(guò)的NMRI小鼠獲得的細(xì)胞。將 Nunc Maxisorb F 多孔板用 SlyD/FKBP12_IGF_l (74-90)或 SlyD/FKBP12 對(duì)照(缺少SEQ ID NO:5的肽)包被，其通過(guò)應(yīng)用包含每ml0.41 μ g多肽的溶液進(jìn)行。隨后，通過(guò)在室溫應(yīng)用包含PBS中1%RPLA的溶液I小時(shí)來(lái)封閉游離結(jié)合位點(diǎn)。將孔用包含0.9%(w/V)氯化鈉和0.05%(w/v) Tween的溶液清洗3次。將化學(xué)生物素化的IGF-1 (Peprotech,人IGF-1，Cat.#100-11)和包含SEQ ID NO:5的氨基酸3至15的生物素化IGF-1肽環(huán)分別固定化于StreptaWell High Bind SA多孔板的孔中，其通過(guò)分別應(yīng)用包含90ng/ml生物素化的IGF-1或500ng/ml生物素化的IGF-1肽環(huán)的溶液進(jìn)行。該環(huán)肽開(kāi)始于與SEQ ID NO:5的位置2對(duì)應(yīng)的半胱氨酸，且另外含有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 5的位置16的半胱氨酸。這兩個(gè)半胱氨酸已經(jīng)用于環(huán)化該肽，由此形成肽環(huán)。N端半胱氨酸進(jìn)一步用于生物素化。
[0138]作為樣品，使用用PBS以1:50稀釋的小鼠血清。以1:4階梯實(shí)施任選的進(jìn)一步稀`釋直至最終稀釋為1:819，200`。溫育時(shí)間為室溫I小時(shí)。將孔用包含0.9%(w/v)氯化鈉和
0.05%(w/v) Tween的溶液清洗3次。作為檢測(cè)抗體,使用與過(guò)氧化物酶綴合的針對(duì)祀抗體的恒定域的多克隆抗體(PAK〈M-Fc Y >S-F(ab’)2-P0D)。以包含 l%(w/v)RSA 的 PBS 中 80ng/ml的濃度應(yīng)用檢測(cè)抗體。溫育時(shí)間為室溫I小時(shí)。將孔用包含0.9%(w/v)氯化鈉和0.05%(w/v) Tween的溶液清洗3次。然后，將孔與ABTS溶液在室溫溫育15分鐘。用光度計(jì)測(cè)定顯現(xiàn)顏色的強(qiáng)度。例示性結(jié)果在下表呈現(xiàn)。
[0139]表
[0140]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的抗體，其結(jié)合包含在胰島素樣生長(zhǎng)因子I前體(SEQ ID NO:1)的氨基酸76 至 84(SEQ ID NO:3)內(nèi)的表位。
2.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
3.權(quán)利要求2的抗體，其中所述抗體的特征在于重鏈可變域包含SEQID NO: 15的⑶R3區(qū)。
4.權(quán)利要求1或2的抗體，其中所述抗體的特征在于重鏈可變域包含SEQID NO: 15的CDR3 區(qū)、SEQ ID NO: 16 的 CDR2 區(qū)和 SEQ ID NO: 17 的 CDRl 區(qū)。
5.權(quán)利要求2的抗體，其中所述抗體的特征在于重鏈可變域包含SEQID N0:15的CDR3H區(qū)、SEQ ID NO: 16的CDR2H區(qū)和SEQ ID NO: 17的CDRlH區(qū)，且輕鏈可變域包含SEQID NO: 18 的 CDR3L 區(qū)、SEQ ID NO: 19 的 CDR2L 區(qū)和 SEQ ID NO: 20 的 CDRlL 區(qū)。
6.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體結(jié)合包含在胰島素樣生長(zhǎng)因子I前體(SEQIDNO:1)的氨基酸77至84 (SEQ ID NO:4)內(nèi)的表位。
7.權(quán)利要求6的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
8.權(quán)利要求7的抗體，其中所述抗體的特征在于重鏈可變域包含SEQID NO:23的⑶R3區(qū)。
9.權(quán)利要求7的抗體，其中所述抗體的特征在于重鏈可變域包含SEQID NO:23的⑶R3區(qū)、SEQ ID NO:24 的 CDR2 區(qū)和 SEQ ID NO:25 的 CDRl 區(qū)。
10.權(quán)利要求7的抗體，其中所述抗體的特征在于重鏈可變域包含SEQID NO:23的CDR3H區(qū)、SEQ ID NO:24的CDR2H區(qū)和SEQ ID NO:25的CDRlH區(qū)，且輕鏈可變域包含SEQID NO:26 的 CDR3L 區(qū)、SEQ ID NO:27 的 CDR2L 區(qū)和 SEQ ID NO:28 的 CDRlL 區(qū)。
11.一種用于經(jīng)由夾心式免疫測(cè)定法檢測(cè)體液樣品中的IGF-1的方法，所述方法包括以下步驟: a)將所述樣品與依照權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的抗體一起溫育，由此發(fā)生所述抗體對(duì)包含在所述樣品中的胰島素樣生長(zhǎng)因子I的結(jié)合`， b)將所述樣品與結(jié)合不包含IGF-1前體的氨基酸76至84的表位的針對(duì)IGF-1的第二抗體一起溫育，由此發(fā)生所述第二抗體的結(jié)合，并 c)測(cè)量在步驟(a)和(b)中形成的免疫學(xué)夾心復(fù)合物，由此檢測(cè)所述樣品中的IGF-1。
【文檔編號(hào)】C07K16/22GK103649119SQ201280033255
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月5日
【發(fā)明者】H.安德雷斯, H.杜菲爾, M.格格, F.科瓦列威斯基, C.肖爾茨, M.施雷姆爾 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司