用于疾病治療的嵌合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種嵌合蛋白，其是由(i)來(lái)自清道夫受體的病原體識(shí)別模塊和(ii)來(lái)自不同清道夫受體的錨定域制備得到的。這種嵌合蛋白與特定的病原體相結(jié)合，并且可用于許多治療中。
【專利說(shuō)明】用于疾病治療的嵌合蛋白

【背景技術(shù)】
[0001] 本申請(qǐng)要求2012年3月12日提交的、申請(qǐng)?zhí)枮镹o. 61/609,523美國(guó)臨時(shí)專利申 請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)。其公開(kāi)的全部?jī)?nèi)容以引用的形式并入本申請(qǐng)。
[0002] 本申請(qǐng)包括于2013年3月12日創(chuàng)建的序列表，該文件為ASCII格式，名稱為 "5〇八1?200003_5125411'，大小為123,236字節(jié)。該文件的全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本申 請(qǐng)。
[0003] 本發(fā)明涉及與重組嵌合蛋白的產(chǎn)生和使用相關(guān)的方法、材料、組合物、應(yīng)用以及治 療，這種重組嵌合蛋白在本文中可以被稱為混雜清道夫受體。
[0004] 膿毒癥通常被定義為病理感染和生理變化的組合，統(tǒng)稱為全身炎癥反應(yīng)綜合征 (SIRS)。相關(guān)術(shù)語(yǔ)敗血癥是指血液中存在病原微生物，會(huì)導(dǎo)致膿毒癥。在本文中這兩個(gè)術(shù) 語(yǔ)通常互換使用。
[0005] 膿毒癥的死亡率很高，據(jù)報(bào)道，盡管經(jīng)過(guò)抗生素的治療，在受嚴(yán)重影響的患者中仍 有20%至50%的死亡率。膿毒癥是非冠脈重癥監(jiān)護(hù)病房（"I⑶"）患者的第二大死亡原 因，還是美國(guó)的第十大死亡原因，歐洲的數(shù)據(jù)與此類似。此外，膿毒癥是幼年個(gè)體死亡的主 要原因，并且對(duì)于幸存的人來(lái)說(shuō)其終生的生活質(zhì)量也降低了。目前膿毒癥的治療主要包括 廣譜抗生素和器官支持治療，并且往往是無(wú)效的。隨著病原體之間抗生素抗性的增加，治療 的功效則會(huì)減少。
[0006] 盡管整體住院死亡率下降，在過(guò)去22年中膿血癥的發(fā)病率已經(jīng)大幅上升并且死 亡數(shù)目仍在增長(zhǎng)。根據(jù)醫(yī)院的出院記錄，使用ICD-9編碼創(chuàng)建了美國(guó)的膿毒癥記錄，并且據(jù) 估計(jì)，每年超過(guò)751，000例重癥膿毒癥發(fā)生，占住院的2. 1 %至4. 3%和所有接診的重癥監(jiān) 護(hù)病房的11%。據(jù)估計(jì)，在過(guò)去的20年里，膿毒癥在美國(guó)的發(fā)生率已經(jīng)顯著地增加。發(fā)病 率增加的可能原因包括侵入性操作應(yīng)用的增加，免疫抑制藥物、化療和移植，人類免疫缺陷 病毒（HIV)感染疫情的出現(xiàn)，以及微生物抗性的增加。隨著時(shí)間的推移，具體的致病微生物 的相對(duì)頻數(shù)發(fā)生了轉(zhuǎn)變，最近革蘭氏陽(yáng)性菌特別明顯。令人擔(dān)憂的是，膿毒癥導(dǎo)致的器官衰 竭越來(lái)越多，并且成為死亡的主要原因。在歐洲可能有類似的情況。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本文公開(kāi)了可用于與病原體結(jié)合的多種嵌合蛋白。簡(jiǎn)單地說(shuō)，每種蛋白包含來(lái)源 自哺乳動(dòng)物清道夫受體的病原體識(shí)別模塊。每種蛋白還包含用于將所述嵌合蛋白固定在適 當(dāng)位置的錨定域。
[0008] 本文在各種實(shí)施方案中公開(kāi)的重組嵌合蛋白包含：來(lái)自哺乳動(dòng)物清道夫受體的病 原體識(shí)別模塊、和錨定域。
[0009] 該蛋白還可包含介于所述病原體識(shí)別模塊和所述錨定域之間的連接體。該連接體 可以為約2至約5個(gè)氨基酸的序列。該連接體可以包含至少兩種不同的氨基酸。在一些實(shí) 施方案中，這兩種不同的氨基酸選自由丙氨酸、組氨酸和甘氨酸組成的組。
[0010] 該蛋白質(zhì)還可包含親和標(biāo)記。親和標(biāo)記可以選自由血凝素、V5、Myc、I7、FLAG、HSV、 VSV-G、6-His、生物素/鏈霉親和素和STREP所組成的組。
[0011] 所述病原體識(shí)別模塊可以為病原體結(jié)合域，其來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面受體家族， 例如SCARA3、CD36、CD163、CD68、L0X-1、SREC-I或SCARA5。這些清道夫受體含有病原體結(jié) 合域，例如保守SRCR結(jié)構(gòu)域，C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域（CTLD)，或膠原序列。
[0012] 所述錨定域可以是免疫球蛋白的Fc段。可替代地，所述錨定域可以是來(lái)自哺乳動(dòng) 物清道夫受體的Ct -螺旋卷曲螺旋域（ctHielical coiled coil domain)。所述錨定域也 可以是親和標(biāo)記。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，獲得病原體識(shí)別模塊的哺乳動(dòng)物清道夫受 體與獲得錨定域的哺乳動(dòng)物清道夫受體不同。
[0013] 該蛋白還可包含信號(hào)肽。
[0014] 本文還公開(kāi)了編碼所述嵌合受體蛋白的核酸序列、包含該核酸序列的載體、以及 包含該載體的宿主細(xì)胞。
[0015] 本文還公開(kāi)了一種含有嵌合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，其中所述 嵌合蛋白包含來(lái)自清道夫受體的病原體識(shí)別模塊、和錨定域。
[0016] 本文還公開(kāi)了一種含有固相和固定在該固相上的嵌合蛋白的親和介質(zhì)，其中，所 述嵌合蛋白包含來(lái)自清道夫受體的病原體識(shí)別模塊、任選的連接體、和錨定域，所述錨定域 附著在所述固相上。
[0017] 此外，本發(fā)明描述了一種選擇性地再生所公開(kāi)的親和介質(zhì)的方法，其中通過(guò)對(duì)所 述介質(zhì)進(jìn)行處理，從而使所結(jié)合的病原體或病原體衍生分子脫落，同時(shí)使固相之間的連接 以及嵌合蛋白與固相之間的連接保持原狀。
[0018] 本發(fā)明還描述了一種用于治療與病原體或病原體衍生分子相關(guān)的疾病的方法，其 包括：接收含有固相和固定在該固相上的嵌合蛋白的親和介質(zhì)，所述嵌合蛋白包含（i)來(lái) 自清道夫受體的病原體識(shí)別模塊和（ii )錨定域；將所述親和介質(zhì)與生物樣品接觸，從而使 病原體或病原體衍生分子與親和介質(zhì)結(jié)合。
[0019] 本文還描述了一種用于確定受試親和介質(zhì)對(duì)于病原體的有效性的方法，其包括： 接收含有病原體的生物樣品；使生物樣品與所述受試親和介質(zhì)的病原體識(shí)別模塊接觸；以 及檢測(cè)病原體和病原體識(shí)別模塊之間結(jié)合的量。此方法可進(jìn)一步包括將病原體和受試親和 介質(zhì)的病原體識(shí)別模塊之間結(jié)合的量與參考值進(jìn)行對(duì)比。
[0020] 本文的多個(gè)實(shí)施方案公開(kāi)了一種用于預(yù)防和治療與病原體或病原體衍生分子相 關(guān)的疾病的藥物，包含位于適于局部施用的載體中的嵌合蛋白。
[0021] 本文還公開(kāi)了一種重組嵌合蛋白，由以下構(gòu)成：信號(hào)肽、至少一種親和標(biāo)記、任選 的連接體、來(lái)自哺乳動(dòng)物清道夫受體的病原體識(shí)別模塊和錨定域。
[0022] 本文還公開(kāi)了用于診斷患者是否患有與病原體或病原體衍生分子相關(guān)的疾病的 方法，其包括：接收包括固相和固定在該固相上的固定空間內(nèi)的嵌合蛋白的親和介質(zhì)，所述 嵌合蛋白包含（i)來(lái)自清道夫受體的病原體模塊和（ii)錨定域；接收由患者獲得的生物樣 品；使生物樣品與親和介質(zhì)接觸，從而使病原體或病原體衍生分子結(jié)合到固定空間；檢測(cè) 固定空間是否存在所結(jié)合的病原體或病原體衍生分子。該檢測(cè)可通過(guò)使任何所結(jié)合的病原 體或病原體衍生分子與標(biāo)記探針雜交來(lái)進(jìn)行。
[0023] 下面將更具體地描述這些和其他非限制性的特征。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024] 本專利或申請(qǐng)文件包含至少一個(gè)用彩色顯示的附圖。在提出請(qǐng)求并繳納所需費(fèi)用 的基礎(chǔ)上，官方將會(huì)提供包含彩色附圖的本專利或?qū)＠暾?qǐng)公布文本的副本。
[0025] 以下提供附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明，其用于說(shuō)明本發(fā)明所公開(kāi)的示例性實(shí)施方案，而不是 為了限制這些實(shí)施方案。
[0026] 圖IA和圖IB為示出了不同類別的清道夫受體蛋白在結(jié)構(gòu)上的相似和差異的圖。 通過(guò)對(duì) Piatt, N.et al. Trends Cell Biol. Volume 8, Issue 9, ISeptember 1998, Pages 365-372進(jìn)行修訂得到圖IA和IB。這些圖未精確地顯示這些蛋白質(zhì)的相對(duì)尺寸。
[0027] 圖2為示出本發(fā)明的嵌合蛋白一種可能的應(yīng)用的圖。
[0028] 圖3為用于密度分析的顯微照片，其顯示了與固相（此處為珠子）結(jié)合的蛋白。
[0029] 圖4示出用于分析與固相結(jié)合的蛋白量的Bradford分析標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0030] 圖5為組圖，其示出當(dāng)四種不同的細(xì)菌暴露在含有第一嵌合蛋白的親和介質(zhì)下的 結(jié)果。這組圖示出在由親和介質(zhì)洗漆連續(xù)級(jí)分（consecutive fraction)的過(guò)程中活菌的 數(shù)量，以及在該實(shí)驗(yàn)過(guò)程總存活細(xì)菌的計(jì)數(shù)。
[0031] 圖6為組圖，其示出當(dāng)四種不同的細(xì)菌暴露在含有第二嵌合蛋白的親和介質(zhì)下的 結(jié)果。這組圖示出在由親和介質(zhì)洗滌連續(xù)級(jí)分的過(guò)程中活菌的數(shù)量，以及在該實(shí)驗(yàn)過(guò)程總 存活細(xì)菌的計(jì)數(shù)。
[0032] 圖7為組圖，其示出當(dāng)產(chǎn)超廣譜@ -內(nèi)酰胺酶（ESBL)的大腸桿菌（E. coli)暴露 在含有第三嵌合蛋白的親和介質(zhì)下的結(jié)果。這組圖示出在由親和介質(zhì)洗滌連續(xù)級(jí)分的過(guò)程 中活菌的數(shù)量，以及在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)留存在柱子中的存活細(xì)菌的計(jì)數(shù)。
[0033] 圖8為組圖，其示出當(dāng)產(chǎn)生超廣譜@ -內(nèi)酰胺酶（ESBL)的大腸桿菌（E. coli)的 暴露在含有第四嵌合蛋白的親和介質(zhì)下的結(jié)果。這組圖示出在洗滌親和介質(zhì)的連續(xù)級(jí)分過(guò) 程中活菌的數(shù)量，以及在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)留存在柱子中存活細(xì)菌的數(shù)目。由三個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)得 到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差如圖所示。
[0034] 圖9A和圖9B示出暴露于來(lái)自實(shí)施例1的每個(gè)柱級(jí)分（即第一嵌合蛋白質(zhì)）的外 周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)中的TNF產(chǎn)量。
[0035] 圖IOA和圖IOB示出暴露于來(lái)自實(shí)施例2的每個(gè)柱級(jí)分（即第二嵌合蛋白質(zhì)）的 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)中的TNF產(chǎn)量。
[0036] 圖11為一組照片，其示出熱滅活的大腸桿菌和乙?；兔芏戎鞍祝╝cLDL)與兩 種不同的嵌合蛋白質(zhì)、完整SCARA5以及對(duì)照的結(jié)合情況。使用anti-SCARA5抗體對(duì)表達(dá)進(jìn) 行確認(rèn)。
[0037] 圖12為一組圖片，其示出與對(duì)照Crb2細(xì)胞相比，通過(guò)SCARA5轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)細(xì)菌脂 多糖（LPS)的內(nèi)化作用。使用anti-SCARA5和anti-Crb2的抗體對(duì)SCARA5和Crb2的表達(dá) 進(jìn)行確認(rèn)。
[0038] 圖13為組圖，其示出在外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)中誘導(dǎo)的TNF產(chǎn)量，所述外周血 單個(gè)核細(xì)胞來(lái)自于供體并暴露于使混合在人血清中的病原體通過(guò)下列柱子所獲得的柱流 過(guò)物中，所述柱子包含與不同的嵌合受體蛋白相結(jié)合的珠子。對(duì)照組包括未與嵌合受體結(jié) 合的珠子。
[0039] 圖14為與圖13類似的第二組圖表，但是含有不同的病原體。
[0040] 圖15示出斑點(diǎn)印跡的結(jié)果，其中采用與圖13和圖14中相同的設(shè)備，但是使用不 同的洗滌溶液將結(jié)合的病原體從對(duì)照珠子和負(fù)載有嵌合受體（SEQ ID NO :35, SEQ ID NO: 43和SEQ ID NO :41)的珠子上洗脫下來(lái)。這種情況下，使用抗生物素 HRP-偶聯(lián)抗體（生物 素檢測(cè)）使施加到柱子上（加載）的材料（在流過(guò)和洗滌后）中的生物素化的MRSA顯示。 洗滌溶液1在任何環(huán)境條件下都不能洗脫所結(jié)合的MRSA，但洗滌溶液2對(duì)于負(fù)載有SEQ ID NO :41和SEQ ID NO :43的珠子而言則可以洗脫所結(jié)合的MRSA。在使用洗滌溶液3將珠子 上的所有物質(zhì)都洗脫下來(lái)后，在對(duì)照珠子或負(fù)載有SEQ ID NO :35的珠子中沒(méi)有檢測(cè)到結(jié)合 的細(xì)菌碎片（生物素）。
[0041] 圖16為經(jīng)一組親和標(biāo)記標(biāo)記的蛋白的五種免疫組織化學(xué)（IHC)照片，用來(lái)與圖17 對(duì)比。其蛋白存在的量高。
[0042] 圖17為經(jīng)另一組親和標(biāo)記標(biāo)記的蛋白的五個(gè)免疫組織化學(xué)（IHC)照片，用來(lái)與圖 16對(duì)比。其蛋白存在的量更低。
[0043] 圖18為一組Western印跡，其示出兩種嵌合受體（由SEQ ID NO :43和SEQ ID NO :41表達(dá)）對(duì)三種病原菌菌種或裸露基質(zhì)的親和性。左圖示出每種受體蛋白在初始溶液 中的存在狀態(tài)。右圖示出在添加各種細(xì)菌和經(jīng)過(guò)洗滌之后蛋白仍附著在珠子上。對(duì)于附著 于TALON珠子上的His-標(biāo)記蛋白以及附著于經(jīng)鏈霉親和素包覆的瓊脂糖上的Avi標(biāo)記的、 生物素化的蛋白而言，也是同樣的?？梢钥闯觯瑢?duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌（除革蘭氏陰性的大腸桿 菌或His-標(biāo)記的蛋白之外），混合后嵌合受體的濃度下降-這表明在病原體分子/瓊脂糖 和嵌合受體之間形成了結(jié)合，從而使溶液中不再含有某些蛋白。
[0044] 發(fā)明詳述
[0045] 參考附圖，可以更透徹地理解本文公開(kāi)的組合物和方法。這些圖僅僅是為了方便 和易于說(shuō)明本發(fā)明的示意性表示，因此并非意在限定或限制示例性實(shí)施方案的范圍。
[0046] 盡管在以下描述中為清楚起見(jiàn)使用了特定的術(shù)語(yǔ)，這些術(shù)語(yǔ)僅僅是為了指代附圖 中用于說(shuō)明的實(shí)施方案的具體結(jié)構(gòu)，并非意在限定或限制本公開(kāi)的范圍。應(yīng)當(dāng)理解的是，在 附圖和以下描述中，相似的數(shù)字標(biāo)記指代具有相似功能的組件。
[0047] 此處所涉及的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均以全文引用的方式并入本文。
[0048] 本發(fā)明涉及一種基于哺乳動(dòng)物清道夫受體蛋白（針對(duì)本發(fā)明的目的簡(jiǎn)稱為清道 夫受體，或簡(jiǎn)稱SR)的嵌合蛋白。大約有30種人類受體蛋白（都具有可溶性和膜結(jié)合性）， 其具有一個(gè)或多個(gè)古老的、高度保守的蛋白模塊-清道夫受體富含半胱氨酸（SRCR)的結(jié)構(gòu) 域。SRCR結(jié)構(gòu)域大概是90至110個(gè)氨基酸長(zhǎng)，并具有高的和明確的半胱氨酸含量?；?SRCR結(jié)構(gòu)域的特征，曾經(jīng)報(bào)道過(guò)兩類SR成員：具有A類結(jié)構(gòu)域的SR(SCARA ;由至少兩個(gè)外 顯子編碼并且含有6個(gè)半胱氨酸殘基）和具有B類結(jié)構(gòu)域的SR(由一個(gè)外顯子編碼并且含 有8個(gè)半胱氨酸殘基）。有時(shí)也有例外，包括一種呈現(xiàn)截?cái)嗟腟RCR結(jié)構(gòu)域的SCARA，該SRCR 結(jié)構(gòu)域中含有四個(gè)半胱氨酸。同樣的，在B組成員之間也發(fā)現(xiàn)含有6個(gè)半胱氨酸的分離的結(jié) 構(gòu)域，CD5、CD163、WC1 和 MC16 也有這種情況。另外，Spa/AIM，WC1/T19 以及 CRP-ductin (小 鼠 DMBT1)具有包含7個(gè)半胱氨酸的獨(dú)立結(jié)構(gòu)域。但是，還沒(méi)有報(bào)道過(guò)在相同清道夫受體上 同時(shí)存在A類和B類結(jié)構(gòu)域的情況。序列分析已表明，盡管SRCR結(jié)構(gòu)域具有不同程度的同 源性，但是半胱氨酸的相對(duì)位置還是以二硫鍵的形式在結(jié)構(gòu)域中很好的保留下來(lái)。因此，序 列分析揭示了半胱氨酸Cl和C4形成二硫鍵，因?yàn)樗鼈兛偸窃贐類而不是A類中存在。蛋 白水解分析表明其他形成二硫鍵的半胱氨酸對(duì)為C2-C7、C3-C8和C5-C6。而這些結(jié)果也已 經(jīng)通過(guò)結(jié)晶的獨(dú)立蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)分析得以確認(rèn)。
[0049] 除了所討論的SRCR結(jié)構(gòu)域之外，任何SR通過(guò)其在造血譜系的免疫細(xì)胞亞群表面 上的位置得以表征。此外，不同數(shù)量和程度的SR表達(dá)可以在幾乎所有其他類型的細(xì)胞中找 至IJ，并且它們能夠從這些細(xì)胞中結(jié)合大量的內(nèi)源性配體。這些包括乙酰化或氧化的低密度 膽固醇（LDL)，以及正常的高密度膽固醇（HDL)、血紅蛋白、鐵和碳水化合物。SR還結(jié)合革蘭 氏陽(yáng)性細(xì)菌以及革蘭氏陰性細(xì)菌。
[0050] 圖1示出不同類別的清道夫受體（SR)的結(jié)構(gòu)特征。
[0051] A類SR為三聚體糖蛋白，其有以下幾種亞型：SR-A類I和II (SCARAl)、 嫩尺0)(504狀2)、51?-(^類1和11(504狀4)、和504狀5。此處對(duì)504狀3亞型不予說(shuō)明。三 聚體分子由包含胞漿區(qū)A、跨膜結(jié)構(gòu)域B、隔離域C、a螺旋卷曲螺旋域D、膠原三螺旋結(jié)構(gòu) 域E、富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域F或C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域G的模塊構(gòu)建而成。I類SR-A受體 有6個(gè)結(jié)構(gòu)域，而II類受體不含有富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域F。MRCO受體不含有a螺旋卷曲 螺旋域D，而含有相對(duì)長(zhǎng)的膠原三螺旋結(jié)構(gòu)域E。在SR-CL I類受體中，富含半胱氨酸結(jié)構(gòu) 域F由C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域G代替。SCARA5受體與具有6個(gè)域的SR-A I類受體相似。在 A類SR，膠原結(jié)構(gòu)域E中，富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域F或C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域G包括結(jié)合位點(diǎn) 的乙?；兔芏戎鞍谆蚣?xì)菌和其他的配體，還應(yīng)當(dāng)注意的是，在A類SR中，N-末端是在 細(xì)胞質(zhì)中。
[0052] B類SR包括，例如⑶36和⑶163。⑶36采取兩極構(gòu)型，具有胞外域H，H的兩側(cè)與 兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域B和兩個(gè)胞漿結(jié)構(gòu)域A相連接。胞外域包含疏水性結(jié)構(gòu)域、富含脯氨酸結(jié)構(gòu) 域、和幾個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。所述CD163蛋白具有位于其C端的胞漿區(qū)A、跨膜結(jié)構(gòu)域B和胞外域， 該胞外域僅包括9個(gè)B類SRCR結(jié)構(gòu)域J，通過(guò)其N-末端的SRCRl和靠近C-末端的SRCR9 進(jìn)行編號(hào)。B類SRCR結(jié)構(gòu)域有四個(gè)雙硫鍵，而A類SRCR結(jié)構(gòu)域有三個(gè)雙硫鍵。
[0053] D類SR包括，例如⑶68 (也被稱為巨噬唾液酸蛋白）。⑶68的C-末端在細(xì)胞質(zhì) 中。CD68包括胞漿區(qū)A、跨膜結(jié)構(gòu)域B、溶酶體相關(guān)膜蛋白（LAMP)樣結(jié)構(gòu)域K和粘蛋白樣結(jié) 構(gòu)域L。
[0054] 現(xiàn)在已知的E類SR是L0X-1。L0X-1的N-末端在細(xì)胞質(zhì)中。L0X-1包括胞漿區(qū)A、 跨膜結(jié)構(gòu)域B、和C-類凝集素域G。含有凝集素的C-類凝集素樣結(jié)構(gòu)域（CTLD)是Ca 2+-依 賴性、碳水化合物結(jié)合蛋白。此結(jié)構(gòu)超家族還包含Ca2+-非依賴性凝集素、以及具有凝集素 樣結(jié)構(gòu)域但不與碳水化合物結(jié)合的蛋白。但是，可以通過(guò)它的四個(gè)（有時(shí)為六個(gè)）保守半 胱氨酸殘基來(lái)識(shí)別CTLD折疊。具有CTLD的蛋白并非必須為SR，還包括一些可溶性蛋白，例 如甘露糖結(jié)合凝集素（MBL)和表面活性蛋白（SP-A和SP-D)。盡管如此，CTLD被公認(rèn)為存 在于SR甘露糖受體、L0X-1和SCARA4中。
[0055] 目前已知的F類SR為SREC-I。SREC-I的C-末端是在細(xì)胞質(zhì)中。SREC-I包括胞 漿區(qū)A、跨膜結(jié)構(gòu)域B和具有5個(gè)EFG樣結(jié)構(gòu)域M的胞外域。
[0056] SCARA3蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO :46。SCARA3結(jié)構(gòu)與SCARAl的剪接變體 II相似，其包含N-末端胞漿結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、間隔域、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和膠原結(jié)構(gòu)域。 C-末端膠原結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基440-543和513-572包括與配體結(jié)合的位點(diǎn)，例如斷裂和聚 腺苷酸化特異性因子3 (CPSF3)和X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP)。
[0057] CD36蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO :47。CD36蛋白包括在氨基酸155-183、氨基 酸28-93、和氨基酸120-155之間的多個(gè)OxLDL結(jié)合位點(diǎn)。其他結(jié)合位點(diǎn)在氨基酸93-120 之間。氨基酸139-184、氨基酸146-164和氨基酸145-171之間的結(jié)構(gòu)域也被顯示其介導(dǎo)與 PfEMP-I的結(jié)合。
[0058] ⑶163蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO :48。每個(gè)單獨(dú)的SRCR結(jié)構(gòu)域J是結(jié)合結(jié) 構(gòu)域，其與相鄰的SRCR結(jié)構(gòu)域組合在一起。SRCRl結(jié)構(gòu)域由氨基酸1-148編碼。SRCR2結(jié) 構(gòu)域由氨基酸149-255編碼。SRCR3結(jié)構(gòu)域由氨基酸256-362編碼。SRCR4結(jié)構(gòu)域由氨基 酸363-469編碼。
[0059] ⑶68蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO :49。LAMP樣結(jié)構(gòu)域K和粘蛋白樣結(jié)構(gòu)域L 都是結(jié)合位點(diǎn)。
[0060] L0X-1蛋白質(zhì)的氨基酸序列是SEQ ID NO :50。C-類凝集素結(jié)構(gòu)域G是結(jié)合位點(diǎn)。
[0061] SREC-I蛋白質(zhì)的氨基酸序列是SEQ ID NO :51。每個(gè)EGF樣結(jié)構(gòu)域M都是結(jié)合位 點(diǎn)。一個(gè)EGF樣結(jié)構(gòu)域包含30-40個(gè)氨基酸殘基和2-3個(gè)二硫鍵，并且還具有2個(gè)P -折 疊。
[0062] 不同于合成抗生素，SR與人類病原體共同進(jìn)化，其通過(guò)作為模式識(shí)別受體構(gòu)成天 然免疫防御的重要組成部分，特別是在對(duì)抗細(xì)菌病原體方面。一些SR表達(dá)于巨噬細(xì)胞和樹 突狀細(xì)胞，它們?cè)谶@些細(xì)胞中充當(dāng)吞噬受體，介導(dǎo)結(jié)合并攝取包括革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰 性細(xì)菌、細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌和病毒RNA的病原微生物。SR也用作Toll樣受體（TLR)的共同受體， 調(diào)節(jié)對(duì)TLR激動(dòng)劑的炎性反應(yīng)。已經(jīng)報(bào)道的SR通常結(jié)合脂多糖（LPS)和脂磷壁酸（LTA)， LPS和LTA分別存在于革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性菌的表面上。最近，有資料表明細(xì)菌表面 蛋白也稱為SR的重要目標(biāo)分子。此外，細(xì)胞內(nèi)的病原體，包括病毒和惡性瘧原蟲，使用SR 可進(jìn)入到宿主細(xì)胞中，這樣使得它們強(qiáng)制地與SR結(jié)合。與非特異性細(xì)菌性配體（如硫酸肝 素）不同，SR除了識(shí)別多個(gè)致病性配體，還表現(xiàn)出與靶向病原體的牢固結(jié)合，這樣使得它們 有可能成為用于在體外除去血液中的細(xì)菌的候選物質(zhì)。
[0063] 本發(fā)明使用進(jìn)化上保守的SR系統(tǒng)對(duì)病原體進(jìn)行治療和診斷。已經(jīng)建立起多種表 達(dá)相關(guān)哺乳動(dòng)物和嵌合蛋白SR的重組細(xì)胞系。已經(jīng)開(kāi)發(fā)出將這些SR末端附著至固相（例 如珠子基質(zhì)、平坦表面或者機(jī)械）的技術(shù)。因此，創(chuàng)建可以用于治療諸如體外血液處理的親 和介質(zhì)是可行的。
[0064] 本文所公開(kāi)的重組嵌合蛋白，其可用于與病原體結(jié)合。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，每種蛋白包含來(lái) 自清道夫受體的病原體識(shí)別模塊（PRM)。每種蛋白還包含錨定域，其用于將嵌合蛋白固定在 支持物的合適位置。這些蛋白可被稱為嵌合清道夫受體（cSR)。
[0065] 所述病原體識(shí)別模塊可能來(lái)自哺乳動(dòng)物清道夫受體的結(jié)合域，并且可能由此將 其定制成針對(duì)病原體或病原體衍生分子的特定種群。例如，結(jié)合域可以是A類清道夫受 體成員2 (SCARA2,已知其與污泥梭狀芽胞桿菌結(jié)合）的結(jié)合域，或B類的清道夫受體成員 L0X-1 (已知其與金黃色釀膿葡萄球菌結(jié)合）的結(jié)合域。結(jié)合域與特定的原子或分子結(jié)合。 參照?qǐng)DIA和圖IB所示清道夫受體的該部分，任何上述的結(jié)合域可以被認(rèn)為是病原體識(shí)別 模塊。在具體的實(shí)施方案中，病原體識(shí)別模塊位于該嵌合受體蛋白的C-末端。
[0066] 錨定域直接或間接地附著至病原體識(shí)別模塊，并且用于將該蛋白端點(diǎn)固定至固相 或支持物。錨定域也可允許的病原體識(shí)別模塊的受限的特定重新配置或允許多個(gè)PRM結(jié)合 到單個(gè)目標(biāo)分子。在一些實(shí)施方案中，錨定域可以是免疫球蛋白的Fe區(qū)。在其它具體實(shí)施 方案中，所述錨定域是來(lái)自哺乳動(dòng)物SR的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（圖IA中字母D)?？商娲?，所 述錨定結(jié)構(gòu)域可以是親和標(biāo)記（本文將進(jìn)一步闡述）。錨定域通常位于嵌合蛋白的一端。 [0067] 在具體設(shè)想的實(shí)施方案中，所述病原體識(shí)別模塊和錨定域來(lái)自不同的A類清道夫 受:體蛋白。
[0068] 如果需要，在病原體識(shí)別模塊和所述錨定域之間可以存在連接體。該連接體增加 了 PRM和cSR的錨定域之間的距離，使得其具有針對(duì)不同病原體的特異性和結(jié)合強(qiáng)度。在制 造過(guò)程中，該連接體還允許正確的蛋白質(zhì)折疊和分泌。在實(shí)施方案中，連接體可以是具有大 約2-15個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度的序列。連接體可包括至少兩種不同的氨基酸。在一些實(shí)施方案 中，連接體包含選自由丙氨酸（A)、組氨酸（H)和甘氨酸（G)組成的組中的至少兩種不同的 氨基酸。非限制性的五個(gè)有用的連接體序列實(shí)例是SVEA(SEQ ID N0:1)、DMDF(SEQ ID NO: 2)、GAAGG (SEQ ID NO :11)、AAAGG (SEQ ID NO :12)和 HHK (SEQ ID NO: 14)。
[0069] 此外，cSR可以含有一種或多種親和標(biāo)記，其與所述蛋白（即在其一端處）串聯(lián)或 處于所述蛋白中的一個(gè)位置（例如PRM和錨定域之間）。親和標(biāo)記是一個(gè)序列，其通常允 許使用親和技術(shù)純化嵌合蛋白和/或?qū)⑶逗系鞍赘街辆哂幸阎较虻挠H和表面?，F(xiàn)有技 術(shù)中已知幾種不同類型的親和標(biāo)記。在具體的實(shí)施方案中，親和標(biāo)記選自血凝素、Avi標(biāo)記 (AviTag?)、V5、Myc、17、FLAG、HSV、VSV-G、His、生物素或 STREP 形成的組合。血凝素標(biāo)記 的序列是SEQ ID N0:22。AviTag?標(biāo)記的序列是SEQ ID N0:32。V5標(biāo)記的序列是SEQ ID NO :23。Myc標(biāo)記的序列是SEQ ID NO :24。FLAG標(biāo)記的序列是SEQ ID NO :25。HSV標(biāo)記 的序列是SEQ ID NO :26。VSV-G標(biāo)記的序列是SEQ ID NO :27。His標(biāo)記的序列是SEQ ID NO :28。17標(biāo)記的序列是SEQ ID NO :29。生物素標(biāo)記的序列是SEQ ID NO :30。STREP標(biāo) 記的序列是SEQ ID NO :31。當(dāng)多于一個(gè)的親和標(biāo)記以串聯(lián)的方式使用時(shí)，可以存在連接體 序列，從而使連接親和標(biāo)記與病原體識(shí)別模塊和錨定域相連接。例如，親和標(biāo)記His (SEQ ID N0:28)和生物素 （SEQ ID N0:30)之間的連接體序列是SEQ ID N0:13。但是應(yīng)當(dāng)注意的 是，錨定域可以是未和標(biāo)記。
[0070] 嵌合蛋白還可以包括信號(hào)肽，其用于指導(dǎo)合成細(xì)胞中蛋白的分泌和/或運(yùn)輸。該 信號(hào)肽可以位于嵌合蛋白的一端。這樣的信號(hào)肽的兩個(gè)例子是來(lái)自于TMP2和BM-40蛋白 的肽（分別為 SEQ ID NO : 15 和 SEQ ID NO : 16)
[0071] 但是應(yīng)當(dāng)注意的是，由于本文所公開(kāi)CSR的病原體識(shí)別模塊和錨定域各自來(lái)自與 不同的哺乳動(dòng)物SR，本發(fā)明無(wú)意于涵蓋天然的SR。這可以通過(guò)使用術(shù)語(yǔ)"重組"和"嵌合" 得以表現(xiàn)出來(lái)，"重組"和"嵌合"指的是該蛋白是人工合成并且可以包括功能單元以及不同 的蛋白質(zhì)片段的事實(shí)。圖IA和圖IB中所描繪的SR明確排除在本發(fā)明的范圍之外。
[0072] 本文還公開(kāi)了編碼上述嵌合蛋白的核酸序列。該核酸序列可以是DNA或RNA。本 領(lǐng)域公知，蛋白質(zhì)中的氨基酸序列是由核酸序列定義，此核酸序列被轉(zhuǎn)錄和/或翻譯以產(chǎn) 生所述蛋白質(zhì)。公認(rèn)的，核酸序列中的每組三聯(lián)體的核苷酸表示一個(gè)特定的氨基酸，如果蛋 白質(zhì)是已知的，適當(dāng)?shù)暮怂嵝蛄芯褪且阎?，且反之亦然?br> [0073] 本發(fā)明的嵌合蛋白可以通過(guò)將cSR的核苷酸序列插入表達(dá)載體中來(lái)制備，載體隨 后被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。示例性載體包括質(zhì)粒和病毒。然后由宿主細(xì)胞產(chǎn)生嵌合蛋白，并 且可以隨后對(duì)嵌合蛋白進(jìn)行分離。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
[0074] 嵌合蛋白可用于制備藥物組合物，其包含嵌合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體。該載 體可以是可注射的載體、局部載體、透皮的載體和類似物。有利地，其制備可以是針對(duì)局部 給藥的形式，例如作為軟膏、凝膠、乳膏、噴霧、分散劑、懸浮劑或糊劑的形式。該制劑可以進(jìn) 一步有利地在組合物中包括防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑、抗氧化劑、滲透劑和類似的材料，且 它們的量是常規(guī)的。適合與本發(fā)明結(jié)合使用的溶液是無(wú)菌的，對(duì)所提議的應(yīng)用是無(wú)害的， 并且可以經(jīng)受常規(guī)的藥物操作如滅菌和/或可以含有常規(guī)的佐劑，如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕 齊II、乳化劑、緩沖劑等?？梢詤⒄?Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed. ,Mack Publishing Co. ,Easton, Pa. (1975)，用于協(xié)助配制本發(fā)明的組合物。
[0075] 嵌合蛋白可以固定在支持物或固相上以得到親和介質(zhì)，其在本文中也可以稱為抗 病原體免疫粘附素（API)。嵌合蛋白的錨定域附著于固相，允許病原體識(shí)別模塊與它的特定 病原體或病原體衍生分子相互作用。固相可以是（例如）珠子、片或條、褶片等形式。本文 還考慮了使用嵌合蛋白的方法。一種預(yù)防或治療與病原體或病原體衍生分子相關(guān)的疾病的 方法，其中包括上文所述的親和介質(zhì)，其構(gòu)成固相和附著在該固相上的一個(gè)或多個(gè)cSR。每 種嵌合蛋白（cSR)包括病原體識(shí)別模塊和錨定域，以及任選的一個(gè)或多個(gè)連接體。從患病 個(gè)體得到生物樣品（如血液），并使其接觸親和介質(zhì)，以結(jié)合所述樣品中的任何病原體或病 原體衍生分子。然后，將除去已結(jié)合粒子的樣品返回到患病個(gè)體。這樣可以從所述生物中 去除作為所述嵌合蛋白目標(biāo)的病原體/病原體衍生分子。任選地，親和介質(zhì)可以隨后通過(guò) 如本文所公開(kāi)的洗脫所結(jié)合分子的方式進(jìn)行再生，并且隨后重新作為介質(zhì)用于相同或不同 的目的。
[0076] 嵌合蛋白也可作為藥物用于與病原體或病原體衍生分子相關(guān)疾病的預(yù)防或治療。 在這樣的實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)cSR用于上文所述的藥物組合物中，同時(shí)使用或不使用 親和介質(zhì)。親和介質(zhì)本身可以進(jìn)一步直接或間接地影響目標(biāo)病原體，使得cSR將固相帶給 特定生物或分子。所述藥物組合物為局部施用，或者根據(jù)病原體或病原體衍生分子決定其 施用方式。例如，在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，含有對(duì)人類免疫缺陷病毒的（HIV)高親和性的 cSR的乳膏可以施用在生殖器區(qū)域，以滅活HIV和/或防止其侵入宿主細(xì)胞。在本公開(kāi)的 另一實(shí)施方案中，含有一個(gè)或多個(gè)cSR的凝膠，其可以結(jié)合細(xì)菌，通過(guò)在傷口敷料來(lái)固定和 /或破壞干擾傷口愈合的細(xì)菌。所述藥物組合物可用于預(yù)防性或治療性應(yīng)用。
[0077] 本文還考慮了用于確定受試親和介質(zhì)對(duì)病原體功效的方法。接收含有病原體的生 物樣品，然后使其與含有病原體識(shí)別模塊的親和介質(zhì)接觸。檢測(cè)/測(cè)定病原體和病原體識(shí) 別模塊之間結(jié)合的量，例如通過(guò)使用免疫組化裝置如比色法，相連二級(jí)抗體，表面等離子體 共振成像，或高效液相色譜（HPLC)進(jìn)行。病原體和受試親和介質(zhì)中的病原體識(shí)別模塊之間 的結(jié)合量可以與參考相比。配體與親和介質(zhì)的結(jié)合表明親和介質(zhì)很可能對(duì)病原體的固定化 /靶向很有效。可選地，剩余樣品中存活的病原體的數(shù)量，或者所述樣品誘導(dǎo)組織體外反應(yīng) (例如分離的PBMC)的能力可以通過(guò)樣品對(duì)親和介質(zhì)的傳代進(jìn)行測(cè)定。也可以使用表達(dá)病 原體識(shí)別模塊的測(cè)試細(xì)胞進(jìn)行這種類型的測(cè)試。該測(cè)試細(xì)胞包含信號(hào)裝置，其通過(guò)病原體 識(shí)別模塊運(yùn)作。然后信號(hào)水平會(huì)顯示結(jié)合的程度。信號(hào)下降則說(shuō)明測(cè)試細(xì)胞表達(dá)的特定 cSR對(duì)于固定病原體是好的選擇。
[0078] 圖2示出嵌合蛋白的示例性使用。此處，在標(biāo)記的SRAl和SRA2柱中，嵌合蛋白結(jié) 合到固相上并用于過(guò)濾。血漿分離裝置，例如尺寸排阻過(guò)濾器，從患者得到血液，并分離血 液，得到含有病原體血漿。然后，血漿通過(guò)體外循環(huán)泵傳遞到SRAl或SRA2的過(guò)濾器中，在 過(guò)濾器中病原體與血漿分離。然后血漿返回到血漿分離裝置并回到患者體內(nèi)。柱切換裝置 的存在使得當(dāng)一個(gè)過(guò)濾器在清潔血漿時(shí)，另一個(gè)過(guò)濾器中可以再生。其可以（例如）通過(guò) 用低PH甘氨酸-HCl混合物洗脫，接著用PBS洗滌的方式再生。輸入到每個(gè)過(guò)濾器的可以 是（i)血漿或（ii)清洗溶液。每個(gè)過(guò)濾器輸出的可以是（a)清洗的血漿或（ii)廢液?？?凝血?jiǎng)┦强蛇x的，但在這里已經(jīng)示出。分離的肝素、檸檬酸鹽和/或其他這樣的抗凝血?jiǎng)┘?方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。
[0079] 可以通過(guò)參照下列實(shí)施例進(jìn)一步理解本發(fā)明的各方面。這些實(shí)施例是說(shuō)明性的， 并非是為了限制其實(shí)施方式。 實(shí)施例
[0080] 實(shí)施例1?具有部分MARCO錨蛋白的MARCO PRM
[0081] 可以通過(guò)已建立的分子生物學(xué)方法產(chǎn)生編碼cSR截?cái)嗫扇苄訫ARC0(SEQ ID NO: 7)的構(gòu)建體，其包含位于pcDNA3.1/Zeo(_)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體（Invitrogen)中的以下元 素：
[0082] 1)來(lái)自BM-40蛋白的分泌信號(hào)肽（SEQ ID NO :16);
[0083] 2)用于蛋白質(zhì)純化的8-組氨酸-長(zhǎng)標(biāo)記和連接體（SEQ ID NO :28和SEQ ID NO : 14)；
[0084] 3)缺失殘基300-419 (核苷酸897-1257)的小鼠 MARCO殘基75-518 (對(duì)應(yīng)于核苷 酸223-1557)的胞外部分（SEQ ID NO :21)。這種形式的MARCO缺少小鼠 MARCO的89-重 復(fù)-長(zhǎng)的膠原結(jié)構(gòu)域的最后40個(gè)Gly-X-Y重復(fù)單元；并且作為跨膜蛋白，其已被證明是清 道夫受體配體、熱滅活的E. coli和乙?；疞DL(低密度脂蛋白）的強(qiáng)結(jié)合劑。
[0085] 一個(gè)類似的cSR截?cái)嗫扇苄匀祟怣ARCO序列可以表示為SEQ ID NO :8。此類似序 列的人類MARCO部分為SEQ ID NO :32。
[0086] 實(shí)施例2
[0087] 實(shí)施例2?具有SCARA5錨蛋白的SR-A PRM。
[0088] 編碼具有小鼠 SR-Al SRCR (清道夫受體、富含半胱氨酸）結(jié)構(gòu)域（SEQ ID NO :9) 的cSR可溶性小鼠 SCARA5的構(gòu)建體被克隆進(jìn)pcDNA3. l/Ze〇(_)載體，并且該構(gòu)建體包含以 下元素：
[0089] 1)來(lái)自TMP2蛋白（SEQ ID NO :15)的分泌信號(hào)肽；
[0090] 2)用于蛋白質(zhì)純化的6-組氨酸-長(zhǎng)標(biāo)記和連接體（SEQ ID NO :28和SEQ ID NO : 13)；
[0091] 3)小鼠 SCARA5的胞外部分，所不同的是該蛋白的SRCR結(jié)構(gòu)域置換為來(lái)自小鼠 SR-A的SRCR結(jié)構(gòu)域。換言之，該嵌合形式包含來(lái)自SCARA5(核苷酸247-1140)的殘基 83-380,隨后是來(lái)自SR-A (殘基345-454對(duì)應(yīng)于核苷酸1035至1362)的SRCR結(jié)構(gòu)域（SEQ ID NO :33)。作為一種跨膜蛋白，這種形式SCARA5的牢固結(jié)合熱滅活大腸桿菌和乙酰化 LDL (比完整的SCARA5更強(qiáng)），圖11進(jìn)一步對(duì)此進(jìn)行了討論。
[0092] 一個(gè)類似的cSR截?cái)嗫扇苄匀祟怱CARA5序列可以表示為SEQ ID NO : 10。此類似 序列的人類SCARA5部分為SEQ ID NO :34。
[0093] 實(shí)施例3
[0094] 實(shí)施例3?具有SCARA5胞外部分的SCARA5 PRM。
[0095] 通過(guò)已建立的分子生物方法產(chǎn)生編碼cSR可溶性小鼠 SCARA5的結(jié)構(gòu)（SEQ ID NO : 5)的構(gòu)建體，其包括在pcDNA3. l/Zeo(_)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體（Invitrogen)中的以下元素：
[0096] 1)來(lái)自TMP2蛋白的分泌信號(hào)肽（SEQ ID NO :15);
[0097] 2)用于蛋白質(zhì)純化的6-組氨酸-長(zhǎng)標(biāo)記和連接體（SEQ ID NO :28和SEQ ID NO : 13)；
[0098] 3)小鼠 SCARA5殘基83-491的胞外部分（對(duì)應(yīng)于核苷酸247-1476) (SEQ ID NO : 19)。如圖11和圖12所示，作為胞外蛋白，SCARA5能夠結(jié)合熱滅活大腸桿菌和內(nèi)化的LPS。
[0099] 一個(gè)類似的cSR可溶性人類SCARA5序列可以表示為SEQ ID N0:3。所述人類 SCARA5 序列為 SEQ ID NO :17。
[0100] 實(shí)施例4
[0101] 實(shí)施例4.具有截?cái)嗟腟CARA5的胞外部分的SCARA5 PRM。
[0102] 通過(guò)已建立的分子生物方法產(chǎn)生編碼cSR可溶并截?cái)嗟男∈?SCARA5的構(gòu)建體 (SEQ ID NO :6)，其包括在pcDNA3.1/Zeo(_)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體（Invitrogen)中的以下元 素：
[0103] 1)來(lái)自TMP2蛋白的分泌信號(hào)肽（SEQ ID NO :15);
[0104] 2)用于蛋白質(zhì)純化的6-組氨酸-長(zhǎng)標(biāo)記和連接體（SEQ ID NO :28和SEQ ID NO : 13)；
[0105] 3)小鼠 SCARA5殘基341-491的截?cái)喟獠糠郑▽?duì)應(yīng)于核苷酸1021-1476) (SEQ ID NO :20)。如圖11和圖12所示，作為胞外蛋白，SCARA5能夠結(jié)合熱滅活大腸桿菌和內(nèi)化的 LPS。
[0106] 一個(gè)類似的cSR可溶性人類SCARA5序列可以表示為SEQ ID NO :4。人類SCARA5 序列為 SEQ ID NO : 18。
[0107] 實(shí)施例5
[0108] 實(shí)施例5.所使用的cSR的表達(dá)
[0109] 采用I丐磷酸鹽轉(zhuǎn)染方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293/EBNA細(xì)胞（Invitrogen)中。轉(zhuǎn)染后第 一天，細(xì)胞以不同密度接種在IOcm組織孵育板中，第二天用硫酸博來(lái)霉素（500pg/ml)進(jìn)行 篩選。兩周后，采用克隆環(huán)對(duì)克隆進(jìn)行挑選，并擴(kuò)大克隆。通過(guò)免疫熒光染色和ELISA的重 組蛋白質(zhì)表達(dá)，對(duì)克隆進(jìn)行篩選。第一種方法依賴于假設(shè)有較高的表達(dá)水平，更多的蛋白還 積聚在細(xì)胞內(nèi)的分泌路徑上。對(duì)于ELISA，用細(xì)胞孵育上清液涂布96孔板，并且通過(guò)單克 隆抗體對(duì)抗Marco的SRCR結(jié)構(gòu)域（截?cái)郙ARCO-克?。┗蚨嗫寺】贵w對(duì)抗SCARA5的C末 端來(lái)進(jìn)行ELISA方法。對(duì)最高表達(dá)進(jìn)行了擴(kuò)展，并用于生產(chǎn)蛋白。在初始選擇之后，Zeocin 選擇降低至250皮克/毫升。
[0110] 實(shí)施例6
[0111] 實(shí)施例6.所用的HIS-標(biāo)記的cSR在HEK-293 EBNA細(xì)胞中的制備。
[0112] 在具有Glutamax-I，并補(bǔ)充有10 %胎牛血清（FCS)、青霉素-鏈霉素（PS)和丙酮 酸鈉的DMEM中（這在本文中稱為正常培養(yǎng)基），使得所選擇的細(xì)胞系（分泌His-標(biāo)記的 蛋白到細(xì)胞培養(yǎng)基中）以單層形式生長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)基還包含用于選擇的合適抗生素（保存 EBNA細(xì)胞所需的250皮克/毫升的G418、125微克/毫升zeosin、或3皮克/毫升嘌呤霉 素）以及每日添加的100皮克/毫升抗壞血酸（僅用于含膠原序列的蛋白質(zhì)）。在匯合時(shí)， 收獲培養(yǎng)基，并將細(xì)胞碎片離心出來(lái)（1000轉(zhuǎn)，5分鐘）。將上清液儲(chǔ)存在4°C或-20°C直到 純化。其中一種細(xì)胞板進(jìn)一步分裂1 :4至1 :6,并在DMEM中生長(zhǎng)至融合。
[0113] 在其它板中，所收獲的培養(yǎng)基更換為無(wú)血清的DMEM/F-12(1 :1)，其中補(bǔ)充有 Glutamax-1、PS、丙酮酸鈉和抗壞血酸。3天后收獲無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基。如果可能的話，將 細(xì)胞用新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基覆蓋，以進(jìn)行進(jìn)一步的蛋白質(zhì)生產(chǎn)。
[0114] 實(shí)施例7
[0115] 實(shí)施例7.所用的HIS-標(biāo)記的cSR的純化
[0116] 過(guò)濾細(xì)胞培養(yǎng)基并注入由Talon-matrix填充并用Ix磷酸鹽緩沖液（50mM磷酸 鈉、150mM的氯化鈉 、pH 7.0)平衡的柱中。注射后，將未結(jié)合的蛋白用含10-15mM咪唑的 2x磷酸鹽緩沖液洗滌。為了洗脫帶有His標(biāo)記的蛋白，咪唑濃度增加至200mM。洗脫后，用 SDS-PAGE將含有有用蛋白的級(jí)分進(jìn)行鑒定，收集并用PBS透析以除掉咪唑（3 X 2小時(shí)，1000 倍體積的緩沖液）。分離純化具有血清的樣品和無(wú)血清樣品。
[0117] 實(shí)施例8
[0118] 實(shí)施例8.采用實(shí)施例1的cSR形成親和介質(zhì)（API)。
[0119] 在這一組實(shí)驗(yàn)中，Talon超流金屬親和樹脂（Clontech)用作固相以制備親和介 質(zhì)。珠子的容量為5至20暈克蛋白/暈升樹脂。
[0120] 對(duì)于去除細(xì)菌試驗(yàn)，實(shí)施例1的嵌合蛋白在2升細(xì)胞培養(yǎng)基（普通培養(yǎng)基（NM)或 無(wú)血清培養(yǎng)基（SF))中純化，然后將其與Iml樹脂偶聯(lián)。產(chǎn)生兩組珠子，一組使用在匪中 產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，而另一組使用SF中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
[0121] 用經(jīng)PBS透析純化的嵌合蛋白與珠子混合，并在+4°C下旋轉(zhuǎn)過(guò)夜。結(jié)合后，在重力 作用下使懸浮液經(jīng)過(guò)柱子運(yùn)動(dòng)而得到珠子。將珠子洗滌并懸浮在I : 1體積的PBS中。從 該懸浮液得到樣品，用兩種方法分析蛋白結(jié)合到珠子的量：對(duì)于洗脫的蛋白，用SDS-PAGE 和Bradford法測(cè)定染色蛋白帶的密度。10 ill的珠子與SDS上樣緩沖液混合后，將一定量的 珠子加樣在凝膠上。在本實(shí)施例中，凝膠上有〇. 125 ill珠子。基于光密度的估計(jì)（圖3)， 結(jié)合的蛋白的濃度為約8pg蛋白/ii I beads?；贐radford測(cè)定法的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4)， 洗脫的蛋白的濃度分別為2. 1 (無(wú)血清）和2. 8 (正常培養(yǎng)基）pg/ iU珠子。對(duì)于洗脫的蛋 白質(zhì)，0D595s分別為0. 178和0. 239。
[0122] 圖3示出用于密度估計(jì)的SDS-PAGE。泳道1-7 (從左邊起）包括標(biāo)記濃度的蛋白 (BSA)，以pg/泳道為單位。標(biāo)記SF的泳道用無(wú)血清培養(yǎng)基中的嵌合蛋白。標(biāo)記匪的泳道 使用正常培養(yǎng)基中的嵌合蛋白。標(biāo)記Std的泳道表示分子量標(biāo)準(zhǔn)。
[0123] 圖4示出Bradford測(cè)定法標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線是用一式三份不同濃度的BSA、并 基于平均方程而繪制的。0D595指的是在595nm處測(cè)量的吸光度。
[0124] 實(shí)施例9
[0125] 實(shí)施例9.得自實(shí)施例8的親和介質(zhì)（API)的細(xì)菌去除能力。
[0126] 將偶聯(lián)后的珠子（匪和SF)和空白對(duì)照珠子用PBS沖洗并在人血清（沒(méi)有滅活的） 中孵育以平衡珠子。將珠子在+4°C旋轉(zhuǎn)過(guò)夜。第二天，使四種細(xì)菌（ESBL大腸桿菌、肺炎鏈 球菌、多重耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA)和腦膜炎奈瑟氏球菌）生長(zhǎng)至OD = 0. 5 (?3X10exp 8CFU/ml)。將細(xì)菌稀釋到人血清中濃度^ IOexp 3CFU/ml，并保持在冰上。（注："10exp n" 在本文中用于指10的n次冪）。
[0127] 對(duì)各種細(xì)菌懸液，500 ill的控制量在振蕩器上37°C孵育10分鐘。對(duì)所述控制進(jìn) 行活性計(jì)數(shù)。
[0128] 然后將500 ill的細(xì)菌懸浮液加至5ml柱內(nèi)100 ill經(jīng)涂覆的珠子中，在振蕩器上 +37°C下孵育10分鐘。將珠子離心下來(lái)（1000轉(zhuǎn)，1分鐘），并且推動(dòng)細(xì)菌懸浮液通過(guò)珠子 (級(jí)分1)。然后將珠子用5x200 ill的PBS、lx500 ill的PBS和2x500 ill的pH為8的含 200mM咪唑的PBS (級(jí)分2-9)洗滌。最后，將珠子重新懸浮于500 ill的PBS中（級(jí)分10)。 每個(gè)級(jí)分進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)并繪制在一條曲線上。三種珠子（NM，SF，和對(duì)照）中的每一種都進(jìn) 行這樣的處理。
[0129] 圖5分別示出每種細(xì)菌和每組珠子的結(jié)果。一共有四排，對(duì)應(yīng)于所述細(xì)菌。左邊 一列提供了每個(gè)級(jí)分的活菌計(jì)數(shù)。y軸在這些圖表為％應(yīng)用率，100%對(duì)應(yīng)于對(duì)照組的活菌 數(shù)。X軸是級(jí)分。請(qǐng)注意，y軸在每幅圖中都不同。藍(lán)線是對(duì)照組珠子。紅線是匪組珠子。 綠線是SF組珠子。這些圖中左欄基本上表明如何能夠快速洗掉珠子中的細(xì)菌，這可以用于 度量嵌合蛋白質(zhì)與細(xì)菌結(jié)合的緊密程度。如曲線下降到零的情況所示，大腸桿菌、葡萄球菌 和腦膜炎奈瑟氏球菌以相似的速率從珠子中洗掉，而肺炎鏈球菌從SF或匪珠子中除去較 慢。這可以解釋為嵌合蛋白與肺炎鏈球菌的結(jié)合十分牢固。如圖中y軸所示，對(duì)于大腸桿 菌、葡萄球菌和腦膜炎奈瑟氏球菌，對(duì)照組珠子的應(yīng)用％更高，這說(shuō)明幾乎很少的細(xì)菌被對(duì) 照組珠子殺死。
[0130] 右邊一列提供在500 ill懸浮液中存活的細(xì)菌計(jì)數(shù)。在這些圖中y軸是％存活率， 100%對(duì)應(yīng)于在推壓懸浮液經(jīng)過(guò)珠子前懸浮液中所有的細(xì)菌的計(jì)數(shù)。條形代表在珠子被除 去后仍然存在的細(xì)菌的量（％)(假設(shè)對(duì)照試驗(yàn)的活菌計(jì)數(shù)也適用于這些懸浮液）。請(qǐng)注意， y軸在每幅圖中都不同。對(duì)于大腸桿菌，與對(duì)照實(shí)驗(yàn)相比，嵌合蛋白能夠從懸浮液中除去顯 著更高百分比的存活細(xì)菌，而SF中培養(yǎng)的蛋白比匪中培養(yǎng)的蛋白多除去接近50%。對(duì)于 MRSA，嵌合蛋白比對(duì)照實(shí)驗(yàn)除去更多的細(xì)菌。對(duì)于肺炎鏈球菌，三組珠子之間的差異并不顯 著。對(duì)于腦膜炎奈瑟氏球菌，與對(duì)照實(shí)驗(yàn)相比，嵌合蛋白除去更大百分比的細(xì)菌。
[0131] 實(shí)施例10
[0132] 實(shí)施例10.使用實(shí)施例2中cSR的親和介質(zhì)（API)的細(xì)菌去除能力。
[0133] 如實(shí)施例6-8所述，制備、純化嵌合蛋白，并將其偶聯(lián)至珠子。該嵌合蛋白包含具 有SCARA5錨定域的SR-A PRM。基于密度測(cè)量法，經(jīng)測(cè)定結(jié)合蛋白的濃度為4. 2pg/iil珠 子；基于Bradford分析法，結(jié)合蛋白的濃度為I. 5g/ii 1珠子。如實(shí)施例9中所述進(jìn)行除菌 分析。但是，在該實(shí)驗(yàn)中使用了 200iU經(jīng)涂覆的珠子。對(duì)照珠子預(yù)先在人血清中孵育。
[0134] 圖6分別示出每種細(xì)菌和每組珠子的結(jié)果。同樣有四排，其對(duì)應(yīng)于各細(xì)菌。左邊 一列提供了在每個(gè)級(jí)分的活菌計(jì)數(shù)。y軸在這些圖表中表示％應(yīng)用率，100%對(duì)應(yīng)于對(duì)照實(shí) 驗(yàn)中的活菌數(shù)。X軸是級(jí)分。請(qǐng)注意，y軸在每幅圖中都不同。藍(lán)線是對(duì)照珠子。紅線是具 有嵌合蛋白的珠子。同樣地，肺炎鏈球菌的去除比較緩慢。這可以解釋為嵌合蛋白質(zhì)與肺 炎鏈球菌的結(jié)合十分牢固。如圖中y軸所示，相比葡萄球菌和腦膜炎奈瑟氏球菌，對(duì)照珠子 的％應(yīng)用更高，這說(shuō)明幾乎很少的細(xì)菌被對(duì)照珠子殺死。
[0135] 右列提供在500 ill懸浮液中存活細(xì)菌的計(jì)數(shù)。在這些圖中y軸是％存活，100% 對(duì)應(yīng)于在推壓懸浮液經(jīng)過(guò)珠子前懸浮液中所有細(xì)菌的計(jì)數(shù)。條形代表在珠子被除去后仍然 存在的細(xì)菌的量（％)(假設(shè)對(duì)照試驗(yàn)的活菌計(jì)數(shù)也適用于這些懸浮液）。請(qǐng)注意，y軸在 每幅圖中都不同。對(duì)于MRSA和N. meningtidis，與對(duì)照實(shí)驗(yàn)相比，嵌合蛋白除去細(xì)菌的百分 比高得多。對(duì)于，大腸桿菌和肺炎鏈球菌，除去細(xì)菌的量大致相同。
[0136] 實(shí)施例11
[0137] 實(shí)施例11.使用實(shí)施例3中cSR的親和介質(zhì)（API)的細(xì)菌去除能力。
[0138] 如實(shí)施例6-8所述，制備、純化嵌合蛋白質(zhì)，并將其偶聯(lián)至珠子。該嵌合蛋白包含 SCARA5錨定域。珠子上蛋白的濃度估計(jì)為0. 9pg/iil珠子。
[0139] 偶聯(lián)的珠子和空白對(duì)照珠子被裝填入具有2ml床體積基質(zhì)的柱中，并用PBS洗滌。 第二天，ESBL大腸桿菌生長(zhǎng)至OD = 0. 5 ( = 3 X IOexp 8CFU/ml)。將細(xì)菌稀釋至在PBS中 的濃度為IOexp 4CFU/ml，并保持在冰上。
[0140] 活菌計(jì)數(shù)是在該懸浮液中進(jìn)行并且Iml懸浮液被推壓入柱中（級(jí)分1)。先用2xlml PBS洗脫（級(jí)分2和3)，以除去柱中空的緩沖體積。然后用3x300 ill含有大部分未結(jié)合細(xì) 菌的PBS洗滌珠子（級(jí)分4-6)。然后再用10x100 ill PBS洗滌（級(jí)分7-16)，其示出在經(jīng) cSR涂覆的柱中結(jié)合和/或殺死的細(xì)菌。最后用20x300 ill PBS洗滌柱（級(jí)分17-36)。最 后，將珠子重新懸浮于Iml PBS中，以獲得柱中殘留的活菌數(shù)量（級(jí)分37)。對(duì)每個(gè)級(jí)分得 到相應(yīng)的活菌數(shù)并繪制在一條曲線上。對(duì)照珠子和經(jīng)cSR涂覆的珠子也進(jìn)行這樣的處理。
[0141] 圖7示出每組珠子的結(jié)果。左邊一列提供每個(gè)級(jí)分的活菌計(jì)數(shù)。在這些圖表中y 軸為菌落形成單位（CFU)/ml。X軸是級(jí)分。紅線是對(duì)照珠子。綠線是具有嵌合蛋白的珠 子。具有嵌合蛋白的柱的細(xì)菌洗脫停止的更早，這說(shuō)明此實(shí)驗(yàn)中更多的細(xì)菌被結(jié)合或者被 殺死。
[0142] 右列提供了珠子懸浮液中存活的細(xì)菌計(jì)數(shù)。在這些圖中y軸是％存活率，100%對(duì) 應(yīng)于在推壓懸浮液經(jīng)過(guò)珠子前懸浮液中所有的細(xì)菌的計(jì)數(shù)。條形代表在珠子被除去后仍然 存在的細(xì)菌的量（％ )。具有嵌合蛋白的柱中殘留大腸桿菌的量稍稍高些。
[0143] 實(shí)施例12
[0144] 實(shí)施例12.使用實(shí)施例4中cSR的親和介質(zhì)（API)的細(xì)菌去除能力。
[0145] 如實(shí)施例6-8所述，制備、純化嵌合蛋白，并將其偶聯(lián)到珠子。該嵌合蛋白包含截 斷SCARA5錨定域。珠子上蛋白質(zhì)的濃度估計(jì)為lpg/iil珠子。
[0146] 偶聯(lián)的珠子和空白對(duì)照珠子被裝填入具有Iml床體積基質(zhì)的柱中，并用PBS洗漆。 第二天，ESBL大腸桿菌生長(zhǎng)至OD = 0. 5 ( = 3 X IOexp 8CFU/ml)。將細(xì)菌稀釋到在PBS中 的濃度為IOexp 3CFU/ml，并保持在冰上。
[0147] 將細(xì)菌懸浮液在+37°C孵育2分鐘。在實(shí)施下一步之前進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。
[0148] 在將細(xì)菌懸浮液推壓入柱中之前，先用人血清洗滌柱。然后在+37°C孵育500 ill 的細(xì)菌懸浮液2分鐘，并推壓入柱中。先用2x300 iU的PBS洗滌（級(jí)分1-2)，以除去柱中 空的緩沖體積。然后再用12x100 PBS (級(jí)分3-14)洗滌珠子，其顯示經(jīng)涂覆的柱中細(xì)菌 的結(jié)合情況。最后，將珠子重新懸浮于ImlPBS中，以得知柱中殘留的活菌數(shù)量。每個(gè)級(jí)分 得到相應(yīng)的活菌數(shù)，并繪制在一條曲線上。對(duì)照珠子和經(jīng)嵌合蛋白涂覆的珠子也進(jìn)行這樣 的處理。
[0149] 圖8為每組珠子的結(jié)果。左邊一列提供了在每個(gè)級(jí)分的活菌計(jì)數(shù)。在這些圖表中 y軸為施加濃度的％，100%對(duì)應(yīng)于對(duì)照組中的活菌數(shù)。X軸是級(jí)分。紅線是對(duì)照珠子的平 均數(shù)。紫線是具有嵌合蛋白的珠子的平均數(shù)。從具有重組蛋白的柱中洗脫的細(xì)菌的數(shù)量稍 高，這說(shuō)明此實(shí)驗(yàn)中在測(cè)試柱中結(jié)合或者被殺死的細(xì)菌比對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的少。
[0150] 右列提供了珠子懸浮液中存活的細(xì)菌計(jì)數(shù)。在這些圖中y軸是％存活，100%對(duì)應(yīng) 于在推壓懸浮液經(jīng)過(guò)珠子前懸浮液中所有的細(xì)菌的計(jì)數(shù)。對(duì)比左邊柱中的數(shù)據(jù)，具有嵌合 蛋白的柱中殘留大腸桿菌的量稍稍高些。
[0151] 實(shí)施例13
[0152] 實(shí)施例13.暴露于來(lái)自實(shí)施例1和2的流通級(jí)分的PBMC中的免疫活性。
[0153] 用實(shí)施例9和10中得到的級(jí)分處理外周血單核細(xì)胞（PBMCs)。將分離的PBMC鋪 板（IOexp 5個(gè)細(xì)胞/孔），并且第二天用洗脫級(jí)分和慶大霉素處理4小時(shí)，以防止細(xì)菌生 長(zhǎng)。收集細(xì)胞培養(yǎng)基，并且采用ELISA以脂多糖（LPS)作為陽(yáng)性對(duì)照測(cè)定產(chǎn)生的TNF-a的 量。該實(shí)驗(yàn)表明是否是通過(guò)該柱的級(jí)分導(dǎo)致了 PBMCs的免疫活性。
[0154] 圖9示出實(shí)施例1嵌合蛋白質(zhì)的結(jié)果（PRM來(lái)自附加了 MARCO錨蛋白的MARCO)。y 軸是TNF-a的量，單位為pg/ml。綠線是對(duì)照珠子。紫線是匪珠子。藍(lán)線是SF珠子。此 處的級(jí)分10是所有洗滌完成后留在柱上的細(xì)菌懸浮液。相比于對(duì)照珠子，cSR珠子對(duì)級(jí)分 10中的所有細(xì)菌呈現(xiàn)更高的激活（例如，與珠子結(jié)合），在第一級(jí)分（含游離的細(xì)菌）中的 情況也一樣。保存的免疫反應(yīng)表明，來(lái)自cSR柱的級(jí)分里發(fā)現(xiàn)大量的免疫活化分子，這與低 含量的細(xì)菌量（圖5和圖6)共同說(shuō)明更多的細(xì)菌在這里被殺死。
[0155] 圖10示出實(shí)施例2中cSR的結(jié)果（PRM來(lái)自附加了 SCARA5錨蛋白的SR-A)。綠線 是對(duì)照珠子。紫線是具有嵌合蛋白的珠子。同樣的，此處的級(jí)分10是所有洗滌完成后留在 柱上的細(xì)菌懸浮液。相比于對(duì)照珠子，具有嵌合蛋白的珠子對(duì)級(jí)分10中的所有細(xì)菌呈現(xiàn)更 高的激活（例如，與珠子結(jié)合），在第一級(jí)分（含游離的細(xì)菌）中除了大腸桿菌外其他的情 況也一樣。
[0156] 實(shí)施例14
[0157] 實(shí)施例14 :大腸桿菌和acLDL通過(guò)SCARA5的跨膜形式結(jié)合，實(shí)施例2中的cSR(具 有SCARAl SRCR結(jié)構(gòu)域作為PRM的SCARA5錨），以及通過(guò)使SCARA5錨與作為PRM的SCARA2 SRCR結(jié)構(gòu)域結(jié)合所制得的cSR。
[0158] 將三種蛋白全部轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中并進(jìn)行表達(dá)。為了進(jìn)行比較，對(duì)照細(xì)胞無(wú)蛋白 表達(dá)。然后將每種細(xì)胞類型暴露于熱滅活大腸桿菌和乙?；兔芏戎鞍字?，以對(duì)結(jié)合進(jìn) 行測(cè)定。使用抗-SCARA5抗體來(lái)證實(shí)表達(dá)蛋白的存在。
[0159] 結(jié)果示于圖11?？刂萍?xì)胞與所有三種材料弱結(jié)合。具有完整SCARA5的細(xì)胞與大 腸桿菌結(jié)合，并且與AcLDL弱結(jié)合。所述SCARA5/SCARA2 cSR與大腸桿菌和AcLDL兩者強(qiáng) 結(jié)合。所述SCARA5/SCARA1 cSR也與大腸桿菌和AcLDL強(qiáng)結(jié)合。與受體相比，這兩種cSR 呈現(xiàn)出比完整的SCARA5高的配體結(jié)合能力，這說(shuō)明了本發(fā)明是如何改進(jìn)SR的結(jié)合親和力 的。
[0160] 實(shí)施例15
[0161] 實(shí)施例15 :細(xì)菌LPS通過(guò)SCARA5的內(nèi)化。
[0162] 為了 LPS的內(nèi)化，對(duì)小鼠 SCARA5轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。團(tuán)粒2 (Crb2)表達(dá)的 CHO細(xì)胞作為陰性對(duì)照。肌動(dòng)蛋白染色（紅色）表明細(xì)胞的存在。結(jié)果示于圖12。標(biāo)記 了 "Ab staining"的行表示成功轉(zhuǎn)染和表達(dá)（抗體識(shí)別SCARA5和Crb2得到綠染色）。標(biāo) 有"LPS internalization"的行顯示內(nèi)吞后的細(xì)胞內(nèi)LPS(綠色）。這些結(jié)果第一次表明 SCARA5能夠結(jié)合和內(nèi)化LPS。
[0163] 實(shí)施例16
[0164] 實(shí)施例16 :嵌合受體之間對(duì)于細(xì)菌親和性的差異
[0165] 表達(dá)并純化序列為SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :43和SEQ ID NO :35的嵌合受體蛋 白（API)，然后參照實(shí)施例8將其與珠子偶聯(lián)（Talon?, Clontech，U. S. A.)。將不含有蛋 白的空白珠子作為對(duì)照試驗(yàn)。
[0166] 兩種珠子都與嵌合受體偶聯(lián)，并且用PBS沖洗空白對(duì)照珠子，然后在人血清（未滅 活）中+4°C孵育過(guò)夜。第二天，四種細(xì)菌（ESBL大腸桿菌、肺炎鏈球菌、多重耐藥金黃色葡 萄球菌（MRSA)和生物素化的/熱殺死的MRSA)生長(zhǎng)至OD = 0. 5 ( ^ 3X 10exp8 CFU/ml)。 將細(xì)菌稀釋至在人血清中濃度為10exp3 CFU/ml，并保持在冰上。
[0167] 對(duì)于對(duì)照實(shí)驗(yàn)，100 空白珠子與500 ill人血清在振蕩器上37°C孵育10分鐘。 此對(duì)照實(shí)驗(yàn)將得到一個(gè)活菌數(shù)。
[0168] 然后在5ml柱中的100 ill經(jīng)涂覆的珠子中，加入500 ill細(xì)菌懸浮液，在振蕩器上 37°C孵育10分鐘。將珠子離心下來(lái)（1000轉(zhuǎn)，1分鐘），并且推壓細(xì)菌懸浮液通過(guò)珠子（級(jí) 分1)。用200 ill PBS洗滌珠子5次，然后用500 ill PBS洗滌珠子1次（級(jí)分2-7)。最后， 將珠子在500 ill PBS中重新懸浮（級(jí)分8)。
[0169] SEQ ID NO :35的嵌合蛋白也被生物素化，并結(jié)合到經(jīng)鏈霉親和素涂覆的珠子基質(zhì) (Pierce化學(xué)公司，美國(guó)）。測(cè)試生物素化的蛋白對(duì)MRSA的抗性。
[0170] 對(duì)每個(gè)級(jí)分進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)并繪制在曲線上，并且將每個(gè)級(jí)分樣品用于PBMC刺激 測(cè)定（如上所述）。分別對(duì)每個(gè)測(cè)試API進(jìn)行上述所有步驟。
[0171] 表1表明，選定病原體在經(jīng)過(guò)含有與不同嵌合受體蛋白偶聯(lián)的珠子的柱中，活力 相對(duì)下降。從所述柱流過(guò)物所得到的菌落數(shù)用菌落計(jì)數(shù)占進(jìn)入柱子之前的菌落計(jì)數(shù)的百分 比表示。整個(gè)過(guò)程中生物素、死亡的多重耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA)作為陰性對(duì)照。
[0172] 表 1

【權(quán)利要求】
1. 一種重組嵌合蛋白，包含： 來(lái)自哺乳動(dòng)物清道夫受體的病原體識(shí)別模塊；和錨定域。
2. 如權(quán)利要求1所述的蛋白，其在所述病原體識(shí)別模塊和所述錨定域之間還包含連接 體。
3. 如權(quán)利要求2所述的蛋白，其中所述連接體是約2個(gè)至約15個(gè)氨基酸的序列。
4. 如權(quán)利要求2所述的蛋白，其中所述連接體包括至少兩種不同的氨基酸。
5. 如權(quán)利要求4所述的蛋白，其中所述至少兩種不同的氨基酸選自由丙氨酸、組氨酸 和甘氨酸構(gòu)成的組。
6. 如權(quán)利要求1所述的蛋白，還包含親和標(biāo)記。
7. 如權(quán)利要求6所述的蛋白，其中所述親和標(biāo)記選自由血凝素、Avi標(biāo)記、V5、Myc、T7、 FLAG、HSV、VSV-G，6-His、生物素和 STREP 構(gòu)成的組。
8. 如權(quán)利要求1所述的蛋白，其中，所述病原體識(shí)別模塊為C-末端，并且所述錨定域來(lái) 自哺乳動(dòng)物清道夫受體。
9. 如權(quán)利要求8所述的蛋白，其中，所述病原體識(shí)別模塊來(lái)自哺乳動(dòng)物A類清道夫受 體。
10. 如權(quán)利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述錨定域是免疫球蛋白的Fc區(qū)。
11. 如權(quán)利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述錨定域來(lái)自與所述病原體識(shí)別模塊不 同的哺乳動(dòng)物清道夫受體。
12. 如權(quán)利要求1所述的蛋白，其中所述錨定域?yàn)閬?lái)自哺乳動(dòng)物A類清道夫受體的 α -螺旋卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。
13. 如權(quán)利要求8所述的蛋白，其中的病原體識(shí)別模塊是SRCR結(jié)構(gòu)域、膠原結(jié)構(gòu)域Ε、 富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域、C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域（CTLD)，溶酶體相關(guān)膜蛋白（LAMP)樣結(jié)構(gòu)域，粘 蛋白樣結(jié)構(gòu)域或EGF樣結(jié)構(gòu)域。
14. 如權(quán)利要求1所述的蛋白，還包含信號(hào)肽。
15. -種編碼權(quán)利要求1所述的蛋白的核酸序列。
16. -種載體，包含編碼權(quán)利要求1所述蛋白的核酸序列。
17. -種宿主細(xì)胞，包括載體，該載體含有編碼權(quán)利要求1所述蛋白的核酸序列。
18. -種藥物組合物，包含嵌合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體； 其中，所述嵌合蛋白包含：來(lái)自清道夫受體的病原體識(shí)別模塊；和錨定域。
19. 一種親和介質(zhì)，包括固相和固定在該固相上的嵌合蛋白； 其中，所述嵌合蛋白包含：來(lái)自清道夫受體的病原體識(shí)別模塊；和錨定域，所述錨定域 附著至所述固相上。
20. -種用于治療與病原體或病原體衍生分子相關(guān)的疾病的方法，包括： 接收包括固相和固定在該固相上的嵌合蛋白的親和介質(zhì)，該嵌合蛋白包含（i)來(lái)自清 道夫受體的病原體識(shí)別模塊和（ii )錨定域； 使生物樣品與所述親和介質(zhì)接觸，以使得所述的病原體或病原體衍生分子與所述親和 介質(zhì)結(jié)合。
21. -種用于確定受試親和介質(zhì)對(duì)病原劑的有效性的方法，包括： 接收含有所述病原劑的生物樣品； 使所述生物樣品與所述受試親和介質(zhì)的病原體識(shí)別模塊接觸；以及 檢測(cè)所述病原劑和所述病原體識(shí)別模塊之間結(jié)合的量。
22. 如權(quán)利要求21所述的方法，還包括將所述病原劑和所述受試親和介質(zhì)的病原體識(shí) 別模塊之間結(jié)合的量與參考值對(duì)比。
23. -種用于預(yù)防或治療與病原體或病原體衍生分子相關(guān)的疾病的藥物，包含位于適 合于局部施用的載體中的嵌合蛋白。
24. -種重組嵌合蛋白，由以下組成： 信號(hào)肽； 至少一種親和標(biāo)記； 連接體； 來(lái)自哺乳動(dòng)物清道夫受體的病原體識(shí)別模塊；和 錨定域。
25. 如權(quán)利要求24所述的重組嵌合蛋白，其中所述病原體識(shí)別模塊和錨定域來(lái)自于不 同的哺乳動(dòng)物清道夫受體。
26. -種用于診斷患者是否患有與病原體或病原體衍生分子相關(guān)的疾病的方法，包 括： 接收親和介質(zhì)，該親和介質(zhì)包括固相和固定在該固相的固定空間內(nèi)的嵌合蛋白，該嵌 合蛋白包含（i)來(lái)自清道夫受體的病原體識(shí)別模塊和（ii )錨定域； 接收由所述患者獲得的生物樣品； 使所述生物樣品與所述親和介質(zhì)接觸，使任何病原體或病原體衍生分子結(jié)合至所述固 定空間；以及 檢驗(yàn)所述固定空間是否存在有任何結(jié)合的病原體或病原體衍生分子。
27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述檢驗(yàn)通過(guò)使任何結(jié)合的病原體或病原體衍生 分子與標(biāo)記探針雜交來(lái)進(jìn)行。
【文檔編號(hào)】C07K14/705GK104321339SQ201380024894
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2013年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月12日
【發(fā)明者】卡爾·特呂格瓦松, 蒂莫·皮卡賴寧, 尤哈·奧賈拉, 約納斯·艾克賽森 申請(qǐng)人:斯凱拉泰克醫(yī)療公司