一種適于二維電泳的豬肺炎支原體外膜蛋白的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種適于二維電泳的豬肺炎支原體外膜蛋白提取方法，包括菌體培養(yǎng)與收集、液氮研磨、蛋白提取裂解、融凍、超聲震蕩和醋酸銨乙醇溶液處理等步驟，然后收集蛋白質(zhì)沉淀并用丙酮漂洗，真空冷凍處理；再經(jīng)樣品裂解，最后離心處理后得到上清液。該發(fā)明能大大提高蛋白提取的效率和純凈度，具有操作簡(jiǎn)便、省工省時(shí)、提取效率高、干擾物少等特點(diǎn)，比較適合于蛋白提取困難、提取收率低、干擾雜質(zhì)多的材料；同時(shí)所得蛋白易于二次溶解、雜質(zhì)和干擾物少，完全滿足雙向電泳第一向和第二向的要求，可獲得分辨率高、重復(fù)性好、蛋白點(diǎn)分布均勻、蛋白點(diǎn)清晰的圖譜，對(duì)豬肺炎支原體組學(xué)研究及免疫蛋白的篩選和疫苗候選蛋白篩選的研究具有重要意義。
【專利說(shuō)明】一種適于二維電泳的豬肺炎支原體外膜蛋白的提取方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種蛋白的提取方法，具體涉及一種適于二維電泳的豬肺炎支原體外 膜蛋白提取方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬支原體肺炎（mycoplasmal pneumonia of swine, MPS)，又稱豬地方流行性肺 炎，俗稱豬氣喘病，是由豬肺炎支原體引起的一種慢性呼吸道傳染病，主要臨診癥狀為咳嗽 和氣喘，主要病理變化特征是肺的尖葉、心葉、中間葉和膈葉前緣呈肉樣或蝦肉樣實(shí)變。該 病廣泛分布于世界各地，患病豬長(zhǎng)期生長(zhǎng)發(fā)育不良，飼料轉(zhuǎn)化率低，死亡率高，若繼發(fā)感染 可造成嚴(yán)重死亡，所致經(jīng)濟(jì)損失很大，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重危害。豬支原體常與藍(lán)耳病和 豬圓環(huán)病毒混合感染，也常與其他多種細(xì)菌、病毒及環(huán)境因子協(xié)同作用，引起豬呼吸道疾病 綜合征（PRDC)，氣喘病常常是PRDC的原發(fā)性病因。該病以肺間質(zhì)淋巴管、結(jié)蹄組織和肺泡 組織的滲出性炎癥以及漿液性纖維素性胸膜肺炎為主要特征，廣泛分布于世界各個(gè)國(guó)家， 曾在許多國(guó)家的豬群中引起巨大經(jīng)濟(jì)損失。豬支原體已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，給世界 養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 本病自然病例僅見(jiàn)于豬，不同年齡、性別和品種的豬均能感染，但乳豬和斷乳仔豬 易感性最高，發(fā)病率和死亡率較高，其次是懷孕后期和哺乳期母豬，肥育豬發(fā)病較少，母豬 和成年豬多呈慢性和隱性。病豬和帶毒豬是本病的傳染源。很多地區(qū)和豬場(chǎng)由于從外地引 進(jìn)豬只時(shí)，未經(jīng)嚴(yán)格檢疫購(gòu)入帶菌豬，引起本病的爆發(fā)。仔豬從患病的母豬感染，本病一旦 傳入，如不采取嚴(yán)密措施，很難徹底撲滅。病豬與健康豬直接接觸，或通過(guò)飛沫經(jīng)呼吸道感 染。本病一年四季均可發(fā)生，但在寒冷、多雨、潮濕或氣候驟變時(shí)較為多見(jiàn)。飼養(yǎng)管理和衛(wèi) 生條件是影響本病發(fā)病率和死亡率的重要因素，尤以飼料質(zhì)量、豬舍潮濕和擁擠、通風(fēng)不良 等因素影響較大。如繼發(fā)或并發(fā)其他疾病，常引起臨診癥狀加劇和死亡率升高。該病近年 來(lái)在我國(guó)發(fā)生呈逐年上升趨勢(shì)，已成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成 嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0004] 近年來(lái)，由支原體所引起的豬支原體肺炎已成為影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的一種重要細(xì)菌 性疾病。發(fā)病后及時(shí)采用抗生素進(jìn)行治療可顯著降低動(dòng)物死亡率，同時(shí)在生產(chǎn)過(guò)程中適當(dāng) 添加抗生素也可在一定程度上降低該病的發(fā)生率。但隨著大量抗菌藥特別是廣譜抗菌藥在 養(yǎng)豬業(yè)中的廣泛使用，細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性問(wèn)題日趨突出，與此同時(shí)也有研究資料表 明，亞抑制濃度的抗生素可以影響細(xì)菌的代謝過(guò)程而改變細(xì)菌的毒力或細(xì)菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng) 能力等。
[0005] 20世紀(jì)人類對(duì)人的基因組進(jìn)行了系統(tǒng)研究，對(duì)整個(gè)基因組進(jìn)行了測(cè)序，其中大部 分遺傳密碼被破譯，還有些基因的功能未研究清楚，一些重大疾病的致病機(jī)理還未完全解 析。隨著人類現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，許多種類的生物基因組測(cè)序已經(jīng)完成，現(xiàn)代生命科 學(xué)技術(shù)研究的重點(diǎn)已經(jīng)從結(jié)構(gòu)基因組研究轉(zhuǎn)移到后基因組時(shí)代即功能基因組的研究。蛋白 質(zhì)是基因功能的體現(xiàn)者，執(zhí)行生理功能。在眾多生物學(xué)機(jī)制研究中，許多問(wèn)題在基因水平上 不能完全被揭示，所以就要研究其功能，從其體現(xiàn)者蛋白質(zhì)的角度來(lái)研究。蛋白質(zhì)組起初由 澳大利亞學(xué)者提出，它包含兩個(gè)方面的含義，一個(gè)是蛋白質(zhì)組方面的研究，一個(gè)是基因組方 面的研究，它的具體含義是細(xì)胞或組織基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)信息。蛋白質(zhì)組學(xué)是以 蛋白質(zhì)組為研究中心，在整體水平上系統(tǒng)研究細(xì)胞或組織的全部蛋白質(zhì)信息，它具有大規(guī) 模、高通量的特點(diǎn)。21世紀(jì)是生命科學(xué)領(lǐng)域大發(fā)展時(shí)期，基因組學(xué)研究已進(jìn)入后基因組學(xué) 時(shí)代，即功能蛋白質(zhì)組學(xué)。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容非常廣泛，主要包括以下幾個(gè)方面：即結(jié) 構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)、表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)、功能蛋白質(zhì)組學(xué)、差異蛋白質(zhì)組學(xué)等幾個(gè)方面的內(nèi)容。二 維凝膠電泳（2-dementional gel electrophoresis, 2-DE)是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最成 熟最經(jīng)典的蛋白分離技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)是建立在聚丙烯酰胺凝膠電泳的基礎(chǔ)上，從蛋白質(zhì)的 等電點(diǎn)和分子量這兩個(gè)特征將復(fù)雜的蛋白質(zhì)成分進(jìn)行高通量的分離，首先根據(jù)等電點(diǎn)不同 在固定pH梯度的干膠條中等電聚焦（IEF)，將蛋白進(jìn)行第一向分離，然后再垂直方向按照 分子量的大小進(jìn)行第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)分離，實(shí)現(xiàn)橫向和縱向兩個(gè)方 向的分離，提高了蛋白分離的靈敏度。二維凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中常用的一種蛋白 質(zhì)分離技術(shù)，其步驟較多，研究?jī)?nèi)容復(fù)雜，主要包括以下幾個(gè)方面的內(nèi)容：原料的采集與回 收、蛋白質(zhì)的提取、蛋白質(zhì)的純化、蛋白質(zhì)的透析脫鹽、第一向等電聚焦、第二向聚丙烯酰胺 凝膠電泳、質(zhì)譜鑒定、生物信息學(xué)分析等內(nèi)容。
[0006] 目前，2-DE技術(shù)憑著高通量、高分辨率、高靈敏度和重復(fù)性好等特點(diǎn)，仍不失為蛋 白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的蛋白質(zhì)分離方法。雖然2-DE技術(shù)可以將組織或細(xì)胞或體液樣品 中絕大部分蛋白質(zhì)分離，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中應(yīng)用的也越來(lái)越廣，但是仍存在許多問(wèn)題 需要解決，等電聚焦對(duì)樣品的要求極其嚴(yán)格，若樣品中含有過(guò)多雜質(zhì)將使等電聚焦過(guò)程終 止。目前有很多種蛋白質(zhì)提取方法，但沒(méi)有一種方法是通用的，因此要對(duì)不同的生物組織采 取不同的措施。細(xì)菌中含有大量干擾物質(zhì)，這些物質(zhì)嚴(yán)重干擾等電聚焦及影響電泳圖譜的 分析。如對(duì)于極酸、極堿、過(guò)大過(guò)小、難溶蛋白質(zhì)的分離以及電泳圖譜的重復(fù)性和分辨率不 佳，疏水性蛋白和大分子蛋白很難轉(zhuǎn)入第二向電泳，痕量調(diào)控蛋白往往會(huì)被高含量的結(jié)構(gòu) 蛋白掩蓋等問(wèn)題，這些缺陷往往與蛋白的提取方法相關(guān)，這些缺陷在一定程度上使2-DE技 術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)方面的應(yīng)用受到了限制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于：提供一種適于二維電泳的豬肺炎支原體外膜蛋白的提取方 法，本方法操作簡(jiǎn)便、蛋白提取效率高、雜質(zhì)少，不干擾第一向等電聚焦和第二向的聚丙烯 酰胺凝膠電泳，能大大提高了蛋白提取的效率和純凈度。
[0008] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： 一種適于二維電泳的豬肺炎支原體外膜蛋白的提取方法，包括以下步驟： (1) 菌體的培養(yǎng)與收集，將冷凍凍干保存的豬肺炎支原體在支原體培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)蘇， 挑取單菌落接種于支原體培養(yǎng)基上，經(jīng)菌體培養(yǎng)，得到冷凍保存的菌體，備用； (2) 取冷凍菌體，經(jīng)液氮研磨后，準(zhǔn)確稱取0. I g的菌體至離心管中； (3) 往離心管中加入I. 0 ml蛋白提取液； (4) 將上述溶液充分混勻后，放入-20°C冰箱中2 h，取出融化后，再次放入-20°C冰箱 中2 h ; (5) 融化后將上述溶液充分混勻后，恒溫超聲震蕩； (6) 經(jīng)12000 rpm 4?離心15 min,收集上清液，向其中加入4倍上清液體積的醋酸 銨乙醇溶液，其中醋酸銨乙醇溶液中含有0.5%的β-二巰基乙醇，-20°C沉淀過(guò)夜，然后于 12000 rpm 4°C離心30 min,收集沉淀； (7) 將沉淀用所述的醋酸銨乙醇溶液漂洗三次，然后再用-20°C的丙酮漂洗三次， 12000rpm 4°C真空離心30 min,獲得蛋白粉末； (8) 將蛋白粉末加入樣品裂解液中進(jìn)行裂解； (9) 將上述溶液充分混勻，12000 rpm 4°C離心15 min，保留上清液，去除沉淀，上清液 保存于_80°C的冰箱中備用。
[0009] 所述的提取方法中菌體培養(yǎng)過(guò)程為：在支原體培養(yǎng)基上37°C震蕩培養(yǎng)，收集支原 體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌，2000 rpm離心10 min，除去多余的培養(yǎng)基，用pH為7. 4的預(yù)冷 PBS緩沖液清洗3次，清洗干凈后將菌體移至I. 5 ml的離心管中，離心管裝入的細(xì)菌量為離 心管總體積的1/3,用移液槍移出多余的PBS緩沖液，用封口膜封住管口，-80°C冷凍保存菌 體。
[0010] 所述的提取方法中，進(jìn)一步采用以下優(yōu)選條件： 其中恒溫超聲震蕩時(shí)要求：震蕩時(shí)間為20-25 min，恒溫4°C，功率為110 W ; 步驟（3)中所用蛋白提取裂解液的配比為：濃度為92. 5 mM、pH為7. 4的Tris-HCl以 及1. 5%的SDS、3. 5%的巰基乙醇，其余為純凈水； 步驟（8)中樣品裂解液的組成為：2%的NP-40、5. 4 M的尿素、65 mM的DTT、0. 002%的 溴酚藍(lán)、1. 5%的載體兩性電解質(zhì)Bio-lyte。
[0011] 本發(fā)明的積極有益效果： 1、本發(fā)明的適于二維電泳的豬肺炎支原體外膜蛋白的提取方法，對(duì)蛋白提取步驟和所 使用試劑進(jìn)行優(yōu)化，增加了蛋白裂解液、液氮研磨和超聲波處理方法，這樣能對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白 進(jìn)行有效釋放，大大提高了蛋白提取的效率和純凈度，有效除去了雙向電泳中干擾第一向 和第二向的雜質(zhì)，建立了一種適于二維電泳的豬肺炎支原體外膜蛋白的提取方法。
[0012] 2、本發(fā)明采用液氮研磨，可充分使細(xì)菌細(xì)胞壁破壁，研磨效果較好；同時(shí)優(yōu)化了蛋 白裂解液配方，可有效除去樣品中的雜質(zhì)，并且使蛋白質(zhì)充分釋放，使等電聚焦順利進(jìn)行； 增加了在冰箱中反復(fù)凍融的步驟，提高了蛋白提取的效率；本發(fā)明采用的反復(fù)凍融是利用 凍結(jié)-解凍過(guò)程中在細(xì)菌內(nèi)部的冰晶體對(duì)細(xì)胞壁的機(jī)械作用而使其破裂的一種物理方法， 反復(fù)凍融可以降低物質(zhì)團(tuán)聚體的水穩(wěn)性，使其內(nèi)部的平衡狀態(tài)發(fā)生改變；同時(shí)采用在恒溫 4 °C條件下超聲震蕩，防止蛋白變性并促進(jìn)蛋白釋放。
[0013] 3、本發(fā)明在蛋白上清液中加入醋酸銨乙醇溶液和二巰基乙醇，經(jīng)沉淀過(guò)夜、離心、 收集沉淀等操作，可有效除去蛋白中的鹽類、酸性雜質(zhì)；反復(fù)用醋酸銨乙醇和丙酮漂洗，可 有效除去樣品中的雜質(zhì)，提1?蛋白收率。
[0014] 4、本發(fā)明將蛋白質(zhì)粉末加入樣品裂解液中，能再次除去蛋白質(zhì)中的雜質(zhì)部分；經(jīng) 高速離心能進(jìn)一步除去樣品中的鹽類、核酸、色素、油脂雜質(zhì)，使蛋白更加純凈，可保證蛋白 的二次溶解和提高樣品的上樣量及等電聚焦的順利進(jìn)行。
[0015] 5、本發(fā)明方法有效提高了樣品中的蛋白含量，省去了傳統(tǒng)方法中的透析除鹽等繁 瑣步驟；該方法整個(gè)過(guò)程在4 °C條件下進(jìn)行，減少了蛋白變性的可能。
[0016] 6、本發(fā)明所得蛋白易于二次溶解，雜質(zhì)和干擾物少，完全滿足雙向電泳第一向和 第二向的要求，蛋白的純凈度較高，可獲得清晰、均勻、重復(fù)性好、分辨率高的電泳圖譜，有 利于蛋白點(diǎn)的后續(xù)質(zhì)譜分析，為豬肺炎支原體的組學(xué)研究提供了技術(shù)支持；對(duì)豬支原體的 致病機(jī)理及免疫蛋白的篩選和疫苗候選蛋白篩選的研究具有重要意義。
[0017] 7、本發(fā)明對(duì)豬肺炎支原體外膜蛋白的提取進(jìn)行了優(yōu)化，建立了一套穩(wěn)定、高效適 于雙向電泳的豬支原體的外膜蛋白提取方法；與傳統(tǒng)方法相比，該方法省工省時(shí)、操作簡(jiǎn) 便、蛋白提取效率高、雜質(zhì)少、能有效除去等電聚焦干擾物等優(yōu)點(diǎn)，該方法比較適合于蛋白 難提取的材料及雜質(zhì)含量較多的材料。
[0018] 表1為本發(fā)明方法與其它幾種方法在蛋白的提取效率和純凈度的比較。

【權(quán)利要求】
1. 一種適于二維電泳的豬肺炎支原體外膜蛋白的提取方法，其特征在于，該方法包括 以下步驟： (1) 菌體的培養(yǎng)與收集，將冷凍凍干保存的豬肺炎支原體在支原體培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)蘇， 挑取單菌落接種于支原體培養(yǎng)基上，經(jīng)菌體培養(yǎng)，得到冷凍保存的菌體，備用； (2) 取冷凍菌體，經(jīng)液氮研磨后，準(zhǔn)確稱取0. I g的菌體至離心管中； (3) 往離心管中加入I. 0 ml蛋白提取液； (4) 將上述溶液充分混勻后，放入-20°C冰箱中2 h，取出融化后，再次放入-20°C冰箱 中2 h ; (5) 融化后將上述溶液充分混勻后，恒溫超聲震蕩； (6) 經(jīng)12000 rpm 4?離心15 min,收集上清液，向其中加入4倍上清液體積的醋酸 銨乙醇溶液，其中醋酸銨乙醇溶液中含有0.5%的β-二巰基乙醇，-20°C沉淀過(guò)夜，然后于 12000 rpm 4°C離心30 min,收集沉淀； (7) 將沉淀用所述的醋酸銨乙醇溶液漂洗三次，然后再用-20°C的丙酮漂洗三次， 12000rpm 4°C真空離心30 min,獲得蛋白粉末； (8) 將蛋白粉末加入樣品裂解液中進(jìn)行裂解； (9) 將上述溶液充分混勻，12000 rpm 4°C離心15 min，保留上清液，去除沉淀，上清液 保存于_80°C的冰箱中備用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述菌體培養(yǎng)過(guò)程為：在支原體培養(yǎng) 基上37°C震蕩培養(yǎng)，收集支原體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌，2000 rpm離心10 min，除去多余的培 養(yǎng)基，用pH為7. 4的預(yù)冷PBS緩沖液清洗3次，清洗干凈后將菌體移至I. 5 ml的離心管 中，離心管裝入的細(xì)菌量為離心管總體積的1/3,用移液槍移出多余的PBS緩沖液，用封口 膜封住管口，_80°C冷凍保存菌體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于：其中恒溫超聲震蕩時(shí)要求：震蕩時(shí)間 為20-25 min，恒溫4°C，功率為110 W。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于：步驟（3)中所用蛋白提取裂解液的 配比為：濃度為92. 5 mM、pH為7. 4的Tris-HCl以及1. 5%的SDS、3. 5%的巰基乙醇，其余為 純凈水。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的提取方法，其特征在于：步驟（8)中樣品裂解液的組 成為：2%的即-40、5.4]?的尿素、65 1111的01'1'、0.002%的溴酚藍(lán)、1.5%的載體兩性電解質(zhì) Bio-Iyte0
【文檔編號(hào)】C07K14/30GK104211789SQ201410492912
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月24日
【發(fā)明者】李海利, 王克領(lǐng), 郎利敏, 徐引弟, 朱文豪, 施巧婷, 游一, 張清嫻, 張立憲, 鄭萬(wàn)錄, 許峰 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所