固相合成胸腺肽α1的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種胸腺肽α1的固相合成方法，所述方法包括步驟：以固相合成樹脂為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸或多肽，獲得保護(hù)的二十八肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，用縮合劑進(jìn)行接肽反應(yīng)，得保護(hù)的二十八肽樹脂后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得胸腺肽α1，所述方法在35-85℃下進(jìn)行。
【專利說明】固相合成胸腺肽α1

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥多肽類原料藥的化學(xué)合成，尤其涉及一種高溫下固相合成胸腺肽 α1〇

【背景技術(shù)】
[0002] 胸腺肽α?是一種化學(xué)合成藥物，有廣泛的臨床應(yīng)用的非特異性免疫調(diào)節(jié)劑。目 前胸腺肽α1的合成與制備方法主要有生物化學(xué)提取法、基因工程法和化學(xué)固相合成法， Genentech公司公布了關(guān)于胸腺肽α1的基因重組方法：以化學(xué)合成的DNA與大腸桿菌 trpE基因連接職稱融合蛋白，通過精制分離，再用溴化氣處理，將切下來的肽經(jīng)過乙?；?， 可制得胸腺肽α1，基因工程方法的難點(diǎn)是高效表達(dá)，且所用費(fèi)用昂貴。
[0003] 專利CN201110186259. 6采用的是固相合成技術(shù)，以CTC樹脂為載體，采用HATU和 NMM為激活試劑，在含有三氟乙酸/二巰基乙醇/水的溶液中裂解，用乙醚為沉降液得到胸 腺肽α1粗品，最后用不同的反相C18填料進(jìn)行兩次純化得到胸腺肽α1純品。
[0004] 專利US2009/0171068A1公布了一種固相多肽合成方法，采用PEG樹脂為載體， Fmoc保護(hù)氨基酸為原料合成胸腺肽α1粗品?！兜|師專學(xué)報》1999年04期《Fmoc固相 合成胸腺肽ct1的工藝研究》描述了一種以Fmoc-Asn(Trt) -WangRisin為多肽合成起 點(diǎn)，在羥基樹脂上進(jìn)行逐個延伸的縮合接肽反應(yīng)，最終合成胸腺素α1的多肽序列，將其用 50%TFA酸解脫離樹脂得粗產(chǎn)品。
[0005] 這些合成方法都在常溫下進(jìn)行（10-30°C)，一個氨基酸的脫保護(hù)過程至少需要30 分鐘，縮合反應(yīng)需要至少2小時，雖然耗時長，產(chǎn)率卻低，方法成本高。在高溫下進(jìn)行固相多 肽合成能使反應(yīng)時間減少，但是會增加副反應(yīng)，尤其會產(chǎn)生明顯的差向異構(gòu)化現(xiàn)象。
[0006] 因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種既能縮短反應(yīng)時間，同時又能避免副反應(yīng)發(fā)生、產(chǎn) 率較高的固相合成胸腺肽α1的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明旨在提供一種胸腺肽α1的固相合成方法。
[0008] 本發(fā)明提供了一種胸腺肽α1的固相合成方法，所述方法包括步驟：
[0009] 以固相合成樹脂為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有Fmoc保護(hù)基團(tuán) 的氨基酸或多肽，獲得保護(hù)的二十八肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，用縮合劑進(jìn)行 接肽反應(yīng)，得保護(hù)的二十八肽樹脂后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得胸腺肽α1，所 述方法在35-85 °C下進(jìn)行。
[0010] 在另一實(shí)施例中，所述方法在40-80°C下進(jìn)行。
[0011] 在另一實(shí)施例中，所述方法在45-70°C下進(jìn)行。
[0012] 在另一實(shí)施例中，所述方法在50-60°C下進(jìn)行。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述方法在35-59 °C和在61-85 °C下進(jìn)行。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，進(jìn)行縮合時的溶劑是二甲基甲酰胺（DMF);所述縮合劑為DIC/ HOBt。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)的時間為20秒-4分鐘；更佳地，連續(xù)兩次 脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，一次進(jìn)行20-40秒，一次2-4分鐘。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述接肽反應(yīng)時間為5-25分鐘。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，依次連接具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，獲得保護(hù)的二十八肽樹 月旨，依次包括如下步驟：
[0018] (a)裝載Fmoc-Asn(Trt)-Wang樹脂；
[0019] (b)在35-85°C下，用含有DMF的溶液連續(xù)兩次進(jìn)行脫保護(hù)處理，然后樹脂用DMF 洗漆；
[0020] (c)在35-85°C下在DMF中使用DIC/HOBt進(jìn)行接肽反應(yīng)，然后再加入脫保護(hù)劑處 理，再加入具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，如此重復(fù)，獲得Fmoc-Ser1 (tBu) -Asp2 (OtBu) -Ala3 -Ala4-Val5-Asp6 (OtBu) -Thr7 (tBu) -Ser8 (tBu) -Ser9 (tBu) -Glu10 (OtBu)-IIe11-Thr12 (tBu)-T hr13 (tBu) -Lys14 (Boc) -Asp15 (OtBu) -Leu16-Lys17 (Boc) -Glu18 (OtBu) -Lys19 (Boc) -Lys20 (Boc)-Glu21 (OtBu) -Val22-Val23-GluM (OtBu) -Glu25 (OtBu) -Ala26-Glu27 (OtBu) -Asn28 (Trt)-樹脂。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述方法中還包括將獲得的胸腺肽a1經(jīng)制備HPLC進(jìn)行純化， 所述純化方法采用下述的一種或一種以上溶液作為流動相：ΡΗ5-8的醋酸銨溶液、ρΗ3-5的 磷酸鹽溶液、ΡΗ1-3的磷酸溶液。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所獲胸腺肽a1的HPLC純度為"大于96%";略佳地，可為"大于 97%"；較佳地，可為"大于98%"；更佳地，可為"大于99%"；最佳地，可為"大于99. 5%"。
[0023] 據(jù)此，本發(fā)明提供了一種既能縮短反應(yīng)時間，同時又能避免副反應(yīng)發(fā)生、產(chǎn)率較高 的固相合成胸腺肽α1的方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1顯示了不同反應(yīng)溫度下獲得的胸腺肽α1粗品的HPLC檢測圖譜；其中A是在 50-55 °C，B是在 20-25?。
[0025] 圖2顯示了高溫（50_55°C)和室溫（20_25°C)不同反應(yīng)溫度下獲得胸腺肽α1 時氨基酸消旋結(jié)果的對比；其中A是在室溫（20-25°C)下，B是在高溫（50-55°C)下。
[0026] 圖3是實(shí)施例1得到的獲得胸腺肽a1粗品和純品的HPLC檢測圖譜；其中A是粗 品的，B是純品的（純度97. 59% )。
[0027] 圖4是實(shí)施例2得到的獲得胸腺肽α1純品（純度99. 2% )的HPLC檢測圖譜。
[0028] 圖5是實(shí)施例3得到的獲得胸腺肽α1純品（純度99. 74% )的HPLC檢測圖譜。
[0029] 圖6是實(shí)施例得到的胸腺肽α1的MS圖譜。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，驚奇地發(fā)現(xiàn)選擇適當(dāng)?shù)娜軇┖涂s合劑可以在高溫 下使用較短的時間固相合成胸腺肽α1，并且沒有通常所認(rèn)為的高溫下會產(chǎn)生的副產(chǎn)物。
[0031] 具體地，本發(fā)明提供的胸腺肽α 1的固相合成在35-85°C下進(jìn)行，使用的溶劑是 DMF，縮合劑為DIC/HOBt。
[0032] 本發(fā)明中所使用的縮寫或英文全稱的含義列于下表：
[0033]

【權(quán)利要求】
1. 一種胸腺肽a 1的固相合成方法，所述方法包括步驟： 以固相合成樹脂為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨 基酸或多肽，獲得保護(hù)的二十八肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，用縮合劑進(jìn)行接肽 反應(yīng)，得保護(hù)的二十八肽樹脂后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得胸腺肽a 1，其特征 在于，所述方法在35_85°C下進(jìn)行。
2. 如權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述方法在40-80°C下進(jìn)行。
3. 如權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述方法在45-70°C下進(jìn)行。
4. 如權(quán)利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述方法在50-60°C下進(jìn)行。
5. 如權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于，進(jìn)行縮合時的溶劑是二甲基甲酰胺 (DMF);所述縮合劑為DIC/HOBt。
6. 如權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于，脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)的時間為20秒-4 分鐘。
7. 如權(quán)利要求6所述的合成方法，其特征在于，連續(xù)兩次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，一次進(jìn) 行20-40秒，一次2-4分鐘。
8. 如權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述接肽反應(yīng)時間為5-25分鐘。
9. 如權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于，依次連接具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸， 獲得保護(hù)的二十八肽樹脂，依次包括如下步驟： (a) 裝載 Fmoc-Asn (Trt) -Wang 樹脂； (b) 在35-85°C下，用含有DMF的溶液連續(xù)兩次進(jìn)行脫保護(hù)處理，然后樹脂用DMF洗滌； (c) 在35-85°C下在DMF中使用DIC/HOBt進(jìn)行接肽反應(yīng)，然后再加入脫保護(hù)劑處理，再 加入具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，如此重復(fù)，獲得？111〇〇-561'1(^1311)-48。2((^1311)-413 3-4134- Val5-Asp6 (OtBu) -Thr7 (tBu) -Ser8 (tBu) -Ser9 (tBu) -Glu10 (OtBu) -Ilen-Thr12 (tBu) -Thr13 (t Bu) -Lys14 (Boc) -Asp15 (OtBu) _Leu16_Lys17 (Boc) -Glu18 (OtBu) -Lys19 (Boc) -Lys20 (Boc) -Glu21 ( OtBu) -Val22-Val23-Glu24 (OtBu) -Glu25 (OtBu) -Ala26-Glu27 (OtBu) -Asn28 (Trt)-樹脂。
10. 如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的合成方法，其特征在于，所述方法中還包括將獲得的 胸腺肽a 1經(jīng)制備HPLC進(jìn)行純化，所述純化方法采用下述的一種或一種以上溶液作為流動 相：PH5-8的醋酸銨溶液、pH3-5的磷酸鹽溶液、pHl-3的磷酸溶液。
【文檔編號】C07K14/575GK104327181SQ201410509534
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】白俊才, 張國慶, 張若平 申請人:上海昂博生物技術(shù)有限公司