專利名稱：生產紫杉烷型雙萜的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生產包括紫杉醇的紫杉烷型雙萜的方法，紫杉醇是用于治療卵巢癌、乳癌、肺癌等的很好的藥劑。
用于卵巢癌、乳癌、肺癌等的治療藥劑的紫杉醇是一種從短葉紫杉NUTT中分離出來后被鑒別出的紫杉烷(taxane)型雙萜，紫杉是一種屬于紫杉屬紫杉科族的植物，紫杉醇有一個與上述藥理活性有關的復雜的酯基。可以在短葉紫杉NUTT植物體的所有部分發(fā)現紫杉醇，但是據報導樹皮中的紫杉醇的含量比所有其他部分都多。目前是從天然或載培的植物體中收集紫杉醇，但是屬于紫杉屬的該植物生長很慢，需要生長10多年才長到離地20cm高，此外，剝掉樹皮后樹就死，因此不容易得到大量的紫杉醇。如果可以通過使用組織培養(yǎng)的方法來合成紫杉烷型雙萜例如紫杉醇和/或紫杉醇的前體的漿果赤霉素III的話，那會是很有利的，因為可以不用砍樹很容地得到大量的紫杉醇。
作為一種利用培養(yǎng)植物細胞來生產紫杉醇的一般方法，美國專利公開了一種利用培養(yǎng)的短葉紫杉NUTT的細胞生產紫杉醇的方法(USP5,019,504)，但是，其中所介紹的紫杉醇的生產量僅是1-3mg/l，因此可足以用于工業(yè)生產。此外，通過利用一般地組織培養(yǎng)技術的細胞培養(yǎng)來生產紫杉醇是不穩(wěn)定的，即使當通過選擇可以高生產率的得到初生細胞時也很難保持再次培養(yǎng)時它的含量[E.R.M.Wickremesine等，World Congress on Cell and TissueCulture(1992)]。
另一方面，作為生產紫杉醇的現有技術，在頒布的Holton等人的USP5,015,744的說明書中公開了一種由漿果赤霉素III生產紫杉醇的半合成方法，在紫杉醇的生物合成中漿果赤霉素III是一種前體。通過利用植物組織培養(yǎng)，可以生產半合成方法的原料例如漿果赤霉素III，因此，也可以通過上述的半合成方法用植物組織培養(yǎng)來生產紫杉醇。
本發(fā)明的目的是提供一種簡單的通過植物組織培養(yǎng)來生產紫杉烷型雙萜的方法。
通過深入細致的研究，本發(fā)明人發(fā)現，通過在如下的條件下進行培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)或生產紫杉烷型雙萜的植物的培養(yǎng)組織的培養(yǎng)，可以改善培養(yǎng)中紫杉烷型雙萜的生產率，因此完成了本發(fā)明，所說的條件是在暈斑素(Coronatines)、生產暈斑素的細菌、該細菌的培養(yǎng)液或培養(yǎng)提取物、環(huán)狀多糖類、脂肪酸或茉莉酸的亞氨基或氨基衍生物的存在條件下。
因此，本發(fā)明是一種生產紫杉烷型雙萜的方法，其中是在至少一種選自如下的物質的存在下把生產紫杉烷型雙萜的植物的細胞和/或組織進行培養(yǎng)，所選的物質是暈斑素、生產該暈斑素的細菌、該細菌的培養(yǎng)液或培養(yǎng)提取物、環(huán)狀多糖類、脂肪酸和由以下通式(X)所代表的化合物或由通式(XI)所代表的化合物 [式(X)中，Y是氫原子、羥基、氰基、NR28aR28b(其中R28a和R28b分別代表氫原子、氨基甲酰基、具有1-12個碳原子的酰基、具有1-12個碳原子的烷基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基、具有1個取代基的芳烷基或具有1-12個碳原子的烷基磺?；?、OR29(其中R29是具有1-12個碳原子的?；⒕哂?-12個碳原子的烷基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基或帶有1個取代基的芳烷基)、-CO-R30(其中R30代表氫原子、氨基、具有1-12個碳原子的烷基氨基)、具有1-12個碳原子的烷基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基、帶有1個取代基的芳烷基、氨基磺?；蚓哂?-12個碳原子的烷基亞硫?；?；R1a、R1b、R1c、R1d、R1e和R1f分別代表氫原子、羥基、具有1-12個碳原子的烷基、具有1-12個碳原子的烷氧基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基或帶有1個取代基的芳烷基；R20、R21、R22、R23和R24分別代表氫原子、羥基、具有1-12個碳原子的烷基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基或帶有1個取代基的芳烷基；由C1-C2-C3-C4-C5-C6組成的側鏈可以含有1個或多個雙鍵；R25代表羥基、OM(其中M是堿金屬原子、堿土金屬原子或NH4)、NR26aR26b(其中R26a和R26b分別代表氫原子、具有1-12個碳原子的?；⒕哂?-12個碳原子的烷基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基、帶有1個取代基的芳烷基或氨基酸殘基)、OR27(其中R27代表具有1-12個碳原子的烷基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基、帶有1個取代基的芳烷基或糖類殘基)、具有1-12個碳原子的烷基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基或帶有1個取代基的芳烷基；n是整數1-7；并且在上述的五員環(huán)中，在相鄰的環(huán)中碳原子之間可以形成雙鍵]， [式(XI)中，R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g分別代表氫原子、羥基、具有1-12個碳原子的烷基、具有1-12個碳原子的烷氧基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基或帶有1個取代基的芳烷基；R20、R21、R22、R23和R24分別代表氫原子、羥基、具有1-12個碳原子的烷基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基或帶有1個取代基的芳烷基；由C1-C2-C3-C4-C5-C6構成的側鏈可以含有1個或多個雙鍵；R25代表羥基、OM(其中M代表堿金屬原子、堿土金屬原子或NH4)、NR26aR26b(其中R26a和R26b分別代表氫原子、具有1-12個碳原子的?；⒕哂?-12個碳原子的烷基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基、帶有1個取代基的芳烷基或氨基酸殘基)、OR27(其中R27代表具有1-12個碳原子的烷基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基、帶有1個取代基的芳烷基或糖類殘基)、具有1-12個碳原子的烷基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基或帶有1個取代基的芳烷基；n是整數1-7；R31a和R31b分別代表氫原子、羥基、具有1-12個碳原子的?；?、具有1-12個碳原子的烷基、具有1-12個碳原子的烷氧基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基、帶有1個取代基的芳烷基或氨基酸殘基；并且，在上述的五員環(huán)中，在相鄰的環(huán)中碳原子之間可以形成雙鍵]，然后從形成的培養(yǎng)物中回收紫杉烷型雙萜。
作為本發(fā)明方法的目的產物的紫杉烷型雙萜不特別限于任一具有紫杉烷骨架的雙萜中，說明性的例子包括紫杉醇、10-脫乙?；仙即?、7-表紫杉醇、漿果赤霉素III、10-脫乙?；鶟{果赤霉素III、7-表漿果赤霉素III、頭胞滿寧(Cephalomannine)、10-脫乙?；^胞滿寧(10-deacetylcephalomannine)、7-表頭胞滿寧(7-epicephalomannine)、漿果赤霉素VI、紫杉烷Ia、木糖基頭胞滿寧(xylosylcephalomannine)、木糖基紫杉醇(xylosyltaxol)、紫杉醇c、10-脫乙?；仙挤覥、紫杉素I(taxicinI)、紫杉素II、紫杉堿I、紫杉堿II、taxagifine等等。
用于本發(fā)明的生產紫杉烷型雙萜的植物的例子是那些屬于紫杉屬的植物，例如漿果紫杉LINN、東北紅豆杉SIEB.et ZUCC、東北紅豆杉SIEB.et ZUCC Var.nana REHDER、短葉紫杉NUTT、加拿大紅豆杉MARSH、紅豆杉和Taxus media。在這些植物當中，漿果紫杉LINN和Taxus media是特別優(yōu)選的。
所說的植物的組織培養(yǎng)是用一般地公知方法進行培養(yǎng)，只是該培養(yǎng)是在下述物質的存在下進行，這些物質是暈斑素、產生暈斑素的細菌、該細菌的培養(yǎng)液或培養(yǎng)提取物、環(huán)狀多糖類、脂肪酸，或根據本發(fā)明的上述通式(X)或(XI)所表示的化合物。
已經發(fā)現，用于本發(fā)明的暈斑素像由假單胞菌產生的誘發(fā)萎黃病的物質，它們具有誘導植物壞死、促使植物產生乙烯或老化的活性。它們正像茉莉酸一樣，也具有促進土豆的塊莖繁茂生長的活性。
作為產生暈斑素的細菌己知的有假單胞菌和黃單胞菌。說明性的假單胞菌的例子包括丁香假單胞菌(IFO3310)、大豆葉斑病假單胞菌、煙草野火病假單胞菌(IFO3508，IFO14081)、菾菜疫病假單胞菌(IFO12655)、燕麥暈斑假單胞菌、棲菜豆假單胞菌(IFO12656，IFO14078)、桑枝疫病假單胞菌(IFO14053，IFO14054，IFO14055)、向日葵葉斑病假單胞菌(IFO14077)等等。說明性的黃單胞菌的例子包括田野黃假單胞菌(IFO中13303，IFO13551)、柑桔黃單胞菌、黃瓜黃單胞菌(IFO13552)、菜豆黃單胞菌(IFO13553，IFO13554)桃李黃單胞菌(IFO3780，IFO13557)等等。
暈斑素的例子包括由通式(I)或通式(II)所表示的化合物 [其中，R1代表羥基、OR2(其中R2代表具有1-6個碳原子的烷基或糖類殘基)、OM1(其中M1代表堿金屬原子、堿土金屬原子或NH4)，或NR3aR3b(其中R3a和R3b分別代表氫原子、具有1-6個碳原子的?；⒕哂?-6個碳原子的烷基、氨基酸殘基或由通式(III)所代表的基因 (其中R4代表氫原子、羥基、具有1-6個碳原子的烷基、具有1-6個碳原子的烷氧基或由式-CO-R7代表的基團，(其中R7代表羥基、OM2(其中M2代表堿金屬原子、堿土金屬原子或NH4)、NR8aR8b(其中R8a和R8b分別代表氫原子、具有1-6個碳原子的酰基、具有1-6個碳原子的烷基或氨基酸殘基)、或OR9(其中R9代表具有1-6個碳原子的烷基或糖類殘基))；R5a、R5b、R6a和R6b分別代表氫原子、羥基、具有1-6個碳原子的烷基或具有1-6個碳原子的烷氧基)；R10a、R10b、R11a、R11b、R12、R13、R14a、R14b、R15a、R15b、R16a、R16b、R17和R19分別代表氫原子、羥基、具有1-6個碳原子的烷基或具有1-6個碳原子的烷氧基；R18代表氫原子、具有1-6個碳原子的烷基或糖類殘基；
在式子中的五員環(huán)或六員環(huán)中的相鄰環(huán)中碳原子之間可以形成雙鍵]。
在上述的通式(I)、(II)和(III)中，由R2、R3a、R3b、R4、R5a、R5b、R6a、R6b、R8a、R8b、R9、R10a、R10b、R11a、R11b、R12、R13、R14a、R14b、R15a、R15b、R16a、R16b、R17、R18或R19所代表的具有1-6個碳原子的烷基的說明性的例子包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、叔戊基、正己基和異己基。
在上述的通式(I)、(II)和(III)中，由R4、R5a、R5b、R6a、R6b、R10a、R10b、R11a、R11b、R12、R13、R14a、R14b、R15a、R15b、R16a、R16b、R17或R19所代表的具有1-6個碳原子的烷氧基的例子包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、新戊氧基、叔戊氧基、正己氧基和異己氧基。
當R1或R7為OM1或OM2時，由M1或M2代表的堿金屬原子或堿土金屬原子的例子包括鈉、鉀和鈣。
當R1或R7是NR3aR3b或NR8aR8b時，由R3a、R3b、R8a或R8b所代表的具有1-6個碳原子的?；蛘呖梢杂兄辨溁蛘呖梢杂兄ф湥鼈兊睦影柞；⒁阴；?、丙?；?、丁?；⑽祯；?、己?；捅；?。
當R1或R7是NR3aR3b或NR8aR8b時，由R3a、R3b、R8a或R8b所代表的氨基酸殘基的例子包括異亮氨?；⒗i氨?；?、谷氨?；唾嚢滨；?br> 當R1或R7是OR2或OR9時，由R2或R9代表的糖類殘基的例子是吡喃葡糖基。
在上述通式(II)中，由R18所代表的糖類殘基的例子包括吡喃葡糖殘基。
優(yōu)選的暈斑素的例子包括暈斑素(式IV)和暈斑酸(Coronafacicacid)(式V)。
暈斑素，它是一種由酰胺鍵把暈斑酸與2-乙基-1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸相連的化合物，在那些由通式(I)所表示的化合物中它有最高的活性。
用于本發(fā)明的暈斑素具有各種立體異構體(順反異構體和旋光異構體)，每種異構體可以單獨使用或以混合物的形式使用。
為了添加暈斑素、產生該暈斑素的細菌、該細菌的培養(yǎng)液或培養(yǎng)提取物到該培養(yǎng)基中，在該培養(yǎng)基中暈斑素的濃度通常要求為0.001-1000μM，根據本發(fā)明，特別優(yōu)選的要控制該暈斑素的濃度范圍為0.01-100μM。
根據本發(fā)明，通過使用含有一種或多種選自如下的物質的培養(yǎng)基培養(yǎng)上述植物的細胞和/或組織，與不添加所述物質的情況相比，可以得到具有較高紫杉烷型雙萜生產率的培養(yǎng)細胞和/或培養(yǎng)組織，所述的物質是暈斑素、產生該暈斑素的細菌、該細菌的培養(yǎng)液或培養(yǎng)提取物。
已報導，通過添加暈斑素到植物細胞培養(yǎng)液中來活化包括在某些第二代謝作用中的生物合成體系[W.Weiler等，FEBS Letters3451(1994)]，但是，沒有關于在作為介質添加劑的暈斑素的存在下進行產生紫杉烷型雙萜的植物的組織培養(yǎng)的報導，而且出乎人們意料的是由此增加了產生的紫杉烷型雙萜的量。
國際專利公開WO93/17121和USP5,019,504介紹了一種方法，該方法是把微生物或微生物培養(yǎng)提取物用作屬于紫杉屬的植物的培養(yǎng)細胞的引發(fā)劑來增加紫杉烷型雙萜的生產率。在這些公開文件中雖然規(guī)定其作為引發(fā)劑，但是沒有清楚的給出其效果的情況。此外，沒有介紹有關屬于假單胞菌屬或黃單胞菌屬的細菌，它是用于本發(fā)明的產生暈斑素的細菌。因此，出乎人們意料的是，通過在產生暈斑素的細菌或該細菌的培養(yǎng)液或培養(yǎng)提取物的存在條件下，培養(yǎng)屬于紫杉屬的植物的細胞，增加了產生的紫杉烷型雙萜的量。
用一般芽胞桿菌繁殖的培養(yǎng)基或基本培養(yǎng)基來實現產生暈斑素的細菌的繁殖。
在發(fā)明中所用的產生的暈斑素的細菌的培養(yǎng)液的說明性的例子包括用于培養(yǎng)細菌之后通過無菌過濾處理的培養(yǎng)液。
用于本發(fā)明的產生暈斑素的細菌的培養(yǎng)提取物的說明性的例子包括在其中已進行細菌培養(yǎng)之后在120C高壓熱處理15分鐘的培養(yǎng)液，或者在酸條件下用有機溶劑例如乙酸乙酯萃取的這些細菌的培養(yǎng)液的提取物，它可任意地進一步用Sephadex LH 20柱等精制得到部分精制的含有暈斑素或暈斑酸的餾分。
當該培養(yǎng)細胞是以指數生長相到穩(wěn)定相時，加入暈斑素、產生暈斑素的細菌、該細菌的培養(yǎng)液或培養(yǎng)提取物是有效的，對本發(fā)明的方法來說，特別優(yōu)選的是把它們在從指數增長相到穩(wěn)定相的過渡時期加入。例如，當細胞是每隔21天移種時，第7-16天是合適的加入暈斑素、產生暈斑素的細菌、這樣的細菌的培養(yǎng)液或培養(yǎng)提取物的時間。至于該添加，可以一次加預定量的該物質，或者可以分多份依次加入它們。
用于本發(fā)明的環(huán)狀多糖類的說明性的例子包括環(huán)糊精、環(huán)果糖聚糖(Cyclofructan)和它們的衍生物。
由于環(huán)狀多糖類的環(huán)狀結構，所以其內部有孔洞，孔洞的開口處和外邊顯示親水性，環(huán)的內部顯示疏水性，因此空在孔洞中具有吸收油物質的籠合活性。通過利用這一特性，它有很多的用途，例如把幾乎不溶于水的物質變成水溶的物質，穩(wěn)定不穩(wěn)定的物質，保留揮發(fā)性的物質例如香料及控制奇特的氣味。工業(yè)上它已用于食品例如干凍茶或火腿和香腸控制奇特氣味。
環(huán)糊精是一種在其中6-8個葡萄糖單元以環(huán)狀物形式連接的物質，它是從淀粉通過環(huán)糊精合成酶的作用而合成的，環(huán)糊精合成酶是通過這樣一種特殊微生物例如軟化芽孢桿菌產生的。該環(huán)果糖聚糖是一種在其中6-8個果糖單元以環(huán)狀物形式連接的物質，它是由菊粉通過環(huán)果糖聚糖合成酶的作用而合成的，該合成酶是由像環(huán)狀芽孢桿菌這樣的特殊微生物產生的。
作為本發(fā)明所用物質的環(huán)糊精和其衍生物的例子包括α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精。γ-環(huán)糊精或其支鏈糊精和其部分甲基化的糊精，所有這些都可以用。支鏈環(huán)糊精的例子包括糖基-α-環(huán)糊精、麥芽糖基-α-環(huán)糊精、麥芽三糖基-α-環(huán)糊精、糖基-β-環(huán)糊精、糖基-γ-環(huán)糊精、半乳糖基-α-環(huán)糊精等等，其中一個糖基作為支鏈連到環(huán)上。作為環(huán)果糖聚糖或其衍生物，其中通過β2-1果糖鏈連接6-8果糖單元的化合物、其支鏈環(huán)果糖聚糖和其部分甲基化的環(huán)果糖聚糖都可以使用。
根據本發(fā)明，在培養(yǎng)基中的上述環(huán)狀多糖類的濃度優(yōu)選為0.01-50mM，更優(yōu)選控制環(huán)狀多糖類的濃度為0.1-30mM。
根據本發(fā)明，通過使用其中加入環(huán)狀多糖類的培養(yǎng)基進行上述植物的細胞和/或組織的組織培養(yǎng)。與其中不加該物質的情況相比，可以得到具有較高紫杉烷型雙萜生產率的培養(yǎng)細胞或培養(yǎng)組織。
還沒有在作為介質添加劑的環(huán)狀多糖的存在下進行生產紫杉烷型雙萜的植物的組織培養(yǎng)的報導，出乎人們意料的是由此促進了分泌紫杉烷型雙萜進到介質中，并增加了生產的紫杉烷型雙萜的量。
特別是當該環(huán)狀多糖類與其他的改善生產率的物質(誘發(fā)劑)一起使用時會提高效果。這樣的改善生產率的物質的例子不僅包括暈斑素、產生該暈斑素的細菌、這樣的細菌的培養(yǎng)液或培養(yǎng)提取物、脂肪酸或由本發(fā)明通式(X)或通式(XI)所代表的化合物，也包括下述日本專利申請6-252528中所述的茉莉酸、其烷基酯、重金屬、胺和抗乙烯劑。在日本專利申請6-146826中所述的低氧濃度的氣氛下環(huán)狀多糖類與該培養(yǎng)物結合在一起使用也是特別有效的。
用于本發(fā)明的脂肪酸的例子包括合成的或天然脂肪酸，其中在主鏈中的碳原子數是10-22，它們之中，在它的主鏈上具有偶數碳原子的脂肪酸是特別優(yōu)選的。這些脂肪酸可以是飽和脂肪酸或在它的碳鏈上具有1個或多個雙鍵不飽和脂肪酸。連到該碳鏈上的1個或多個氫原子可以被具有1-6個碳原子的烴基、羥基或氨基取代。在上述的不飽和脂肪酸中所含的雙鍵可以或者是順式或者是反式或者是它們的混合物。但是含有順式雙鍵的是優(yōu)選的。
上述的脂肪酸的說明性的例子包括直鏈脂肪酸如癸酸、癸烯酸、月桂酸、十二碳烯酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻腦酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、11-十八碳烯酸、亞油酸、α-亞麻酸、γ-亞麻酸、四-十八碳烯酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、山菕酸、二十二碳六烯酸，羥基脂肪酸或蓖麻油酸，和支鏈脂肪酸如14-甲基棕櫚酸。在這些酸當中，油酸、亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸是優(yōu)選的，但特別優(yōu)選的是α-亞麻酸。
在這些取代基中，具有1-6個碳原子的烴基如例子包括甲基、乙基、丙基、環(huán)丙基、丁基、異丁基、戊基或己基。
在這些取代基中，氨基的例子包括氨基、單甲基氨基和二甲基氨基。
加入到培養(yǎng)基中的脂肪酸可以是由下面的通式(XII)代表的脂肪酸衍生物R32-COR33(XII)[其中，R32-C0代表由上述脂肪酸衍生的一個原子團；R33代表OR34(其中R34代表具有1-6個碳原子的烷基或糖類殘基)、OM(其中M代表堿金屬原子、堿土金屬原子或NH4)、或NR35aR35b(其中R35a和R35b分別代表氫原子、具有1-6個碳原子的烷基或氨基酸殘基)]。
在上述的通式(XII)中，由R34、R35a和R35b代表的具有1-6個碳原子的烷基的例子包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、叔戊基、正己基和異己基。
當R33是OM時，由M代表的堿金屬原子或堿土金屬原子的例子包括鈉、鉀和鈣。
當R33是NR35aR35b時，由R35a或R35b代表的氨基酸殘基的例子包括甘氨?；?、亮氨酰基、谷氨酰基，賴氨?；⒈奖滨；惲涟滨；⒗野滨；蜕滨；?。
當R33是OR34時，由R34代表的糖類殘基的例子是吡喃葡糖基。
從有效的改善紫杉烷型雙萜的生產率的觀點考慮，用于本發(fā)明的脂肪酸和/或其衍生物優(yōu)選的是加到培養(yǎng)基中，使?jié)舛葹?.01-1000μM，特別優(yōu)選的是控制濃度在0.1-500μM(當兩種或多種脂肪酸和/或衍生物一起使用時，上面表示的濃度范圍為總的濃度)。
根據本發(fā)明，也可以使用含有脂肪酸或其酶催化水解產物的天然油。天然油的例子包括植物油如菜子油、豆油、亞麻子油和紅花油，酶催化水解產物的例子包括由脂酶分解的上述植物油的那些水解產物。在培養(yǎng)基中的上述天然油或其酶催化水解產物的濃度優(yōu)選為1-1000mg/l。
除了從系統(tǒng)外添加脂肪酸外，也可以加脂解酶到培養(yǎng)基中，以便部分水解該脂類例如構成所述組織和/或細胞的甘油脂，以便釋放脂肪酸到培養(yǎng)基中。脂解酶的例子包括脂酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2和磷脂酶B，在酸區(qū)具有最佳pH的磷酯酶A1、磷脂酶A2和磷脂酶B是特別優(yōu)選的。根據本發(fā)明，加入到培養(yǎng)基中的上述酶的優(yōu)選濃度為0.1-100mg/升培養(yǎng)基。
根據本發(fā)明，滿足上述條件的脂肪酸，其衍生物、天然油和脂解酶可以單獨使用，或它們可以隨意結合使用及一起使用。
可以在培養(yǎng)開始時或在培養(yǎng)過程中把這些脂肪酸或其衍生物、天然油或脂解酶加到培養(yǎng)基中?？梢栽谂囵B(yǎng)過程的任何時候一起加入，或可以分批加入它們。
把上述脂肪酸和天然油加到培養(yǎng)基中的說明性的方法包括如下的方法一種方法是把它們溶于有機溶劑如乙醇中再加入，一種方法是把它們與表面活性劑如辛基-β-D-葡糖苷一起加入，或者另一種方法是把它們直接加到培養(yǎng)基中，接著進行超聲波等處理而形成膠束。也可以在油-水分離的條件下把它們直接加到培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
用于本發(fā)明的茉莉酸的亞氨基或氨基衍生物是分別由通式(X)或(XI)表示的化合物。
在上述的通式(X)或(XI)中，由R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R1g、R20、R21、R22、R23、R24、R25、R28a、R28b、R29、R26a、R26b、R27、R31a、R31b或y代表的具有1-12個碳原子的烷基的例子包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基。具有3個或多個碳原子的烷基包括環(huán)烷基例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基。
在上述的通式(X)或(XI)中，由R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R1g、R31a或R31b所代表的具有1-12個碳原子的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基、庚氧基、辛氧基、壬氧基、癸氧基、十一烷氧基和十二烷氧基。具有3個或多個碳原子的烷氧基包括含有一個環(huán)烷基如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基的烷氧基。
在上述的通式(X)或(XI)中，由R28a、R28b、R26a、R26b、R29、R31a或R31b所代表的具有1-12個碳原子的?；梢允侵辨溁蛑ф湥蚱淇梢允欠甲逶訄F，其說明性的例子包括甲?；?、乙酰基、丙?；⒍□；⑽祯；?、己酰基、丙烯酰基、辛?；⑷甚；⒈郊柞；?、甲苯?；⑺畻铛；腿夤瘐；?。
在上述的通式(X)或(XI)中，由R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R1g、R20、R21、R22、R23、R24、R25、R28a、R28b、R29、R26a、R26b、R27、R31a、R31b或Y代表的芳基或帶有取代基的芳基的例子包括苯基、對甲氧基苯基、對氯苯基、對氟苯基和萘基。
在上述的通式(X)或(XI)中，由R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R1g、R20、R21、R22、R23、R24、R25、R28a、R28b、R29、R26a、R26b、R27、R31a、R31b或Y所代表的芳烷基或帶有一個取代基的芳烷基的例子包括芐基、對甲氧基芐基、對氯芐基和對氟芐基。
在上述的通式(X)或(XI)中，當R25是OM時，由M代表的堿金屬原子或堿土金屬原子的例子包括鈉、鉀和鈣。
在上述的通式(X)中，R28a或R28b代表的具有1-12個碳原子的烷基磺?；睦影谆酋；?、乙磺?；?、正丙磺酰基和異丙磺?；?br> 在上述的通式(X)中，當R29是-CO-R30時，由R30代表的具有1-12個碳原子的烷基氨基的例子包括甲氨基、乙氨基、正丙氨基和異丙氨基。
在上述的通式(X)中，由R28a或R28b代表的具有1-12個碳原子的烷基亞磺?；睦影谆鶃喕酋；?，乙基亞磺酰基、正丙基亞磺酰基和異丙基亞磺?；?br> 在上述的通式(X)或(XI)中，當R25是NR26aR26b時，由R26a或R26b表示的氨基酸殘基的例子及在通式(XI)中由R31a或R31b所代表的氨基酸殘基的例子包括異亮氨?；?、酪氨酰基和色氨?；?br> 在上述的通式(X)或(XI)中，當R25是OR27時，由R27代表的糖類殘基的例子是吡喃葡糖基。
在由通式(X)或(XI)所表示的化合物中，在五員環(huán)中鄰近的環(huán)中碳原子之間可以形成雙鍵。
由通式(X)代表的化合物的說明性的例子包括如下所示的那些化合物(化合物A)Y-OHR1a，R1b，R1c，R1d，Re，R1f，R20，R21，R22，R23，R24HC3和C4之間形成一個雙鍵。R25-OCH3n1 (化合物B)Y-OCH3R1a，R1b，R1c，R1d，R1e，R1f，R20，R21，R22，R23，R24HC3和C4之間形成一個雙鍵。R7-OCH3n1 (化合物C)Y-NH2R1a，R1b，R1c，R1d，R1e，R1f，R20，R21，R22，R23，R24HC3和C4之間形成一個雙鍵。R7-OCH3n1 (化合物D)Y-NHCONH2R1a，R1b，R1c，R1d，R1e，R1f，R20，R21，R22，R23，R24HC3和C4之間形成一個雙鍵。R7-OCH3n1 (化合物E)Y-NHCHOR1a，R1b，R1c，R1d，R1e，R1f，R20，R21，R22，R23，R24HC3和C4之間形成一個雙鍵。R7-OCH3n＝1 (化合物F)Y-NHSO2CH3R1a，R1b，R1c，R1d，R1e，R1f，R20，R21，R22，R23，R24HC3和C4之間形成一個雙鍵。R7-OCH3n＝1 (化合物G)Y-CNR1a，R1b，R1c，R1d，R1e，R1f，R20，R21，R22，R23，R24HC3和C4之間形成一個雙鍵。R7-OCH3n＝1 (化合物H)Y-SO2NH2R1a，R1b，R1c，R1d，R1e，R1f，R20，R21，R22，R23，R24HC3和C4之間形成一個雙鍵。R7-OCH3n＝1 由通式(X1)所代表的化合物的說明性的例子如下所示(化合物I)R1a，R1b，R1c，R1d，R1e，R1f，R1g，R20，R21，R22，R23，R24，R31aHR31bOHC3和C4之間形成一個雙鍵。R25-OCH3n1 用于本發(fā)明的由通式(X)或(XI)所代表的化合物有各種立體異構體，每種異構體可以單獨使用，或以它們的混合物的形式使用這些異構體。在化合物A-H的側鏈當中，異戊烯基和甲氧羰基-甲基它們的順式構型是優(yōu)選的。
用如下的方法可以很容易地制備由通式(X)或(XI)所代表的化合物，該方法是例如茉莉酸與氨衍生物的加成反應(例如，見″NewExperimental Chemistry Course No.14，Synthesis andReaction of Organic Compourds[III]″edited by TheChemical Society of Japan)。
氨衍生物的說明性的例子包括羥胺、苯肼、氨基脲、O-甲基羥胺、O-乙基羥胺、甲酰肼、甲烷磺酰肼等或它們的鹽。當用鹽時，如果需要，可以通過在羰基衍生物(茉莉酸)的存在下加乙酸鈉或乙酸鉀由該鹽釋放出堿性試劑。
在加成反應中，堿性氮化合物親核地連到羰基的碳上，最好控制反應溶液有合適的酸性。
以這樣的方法得到的茉莉酸的亞氨基衍生物進一步與復合氫化合物例如氫化鋰鋁、氰基硼氫化鈉和硼氫化鈉或還原劑如甲硼烷反應，得到茉莉酸的氨基衍生物。
在培養(yǎng)基中，由通式(X)或(XI)代表的化合物的濃度優(yōu)選0.001-1000μM，更優(yōu)選控制該濃度在0.1-500μM的范圍。
DE4122208公開了一種方法，它是通過把茉莉酸加到植物細胞培養(yǎng)液中來促進產生特定的第二代代謝物，但是它沒有介紹生產紫杉烷型雙萜。本發(fā)明人已發(fā)現，通過加入茉莉酸可以增加在生成的培養(yǎng)液中產生的紫杉烷型雙萜的量[日本專利申請6-104211，6-104212，7-47580]，然而出乎人們意料的是，根據本發(fā)明，與茉莉酸的結果相比，茉莉酸的亞氨基或氨基衍生物具有更高的生產改善效果。
當培養(yǎng)的細胞是處在指數生長相或靜態(tài)相時，加入由通式(X)或(XI)代表的化合物是最有效的，對于本發(fā)明的方法來說特別優(yōu)選的是把該化合物在從指數生長相到靜態(tài)相的過渡期加入。例如，當細胞是每21天移種時，加該化合物的合適的時間是第7-14天。該添加可以一次加或分多次加入。
當用由通式(X)或(XI)代表的化合物進行兩步培養(yǎng)時，也可以在第一培養(yǎng)步驟在沒有加該化合物的介質中，而在第二培養(yǎng)步驟加該化合物的介質中繁殖該細胞。要接種到第二培養(yǎng)步驟的這些細胞優(yōu)選是處在指數生長相或靜態(tài)相。
根據本發(fā)明，是在含有至少一種選自下述物質的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞或組織，這些物質是上述的暈斑素、產生該暈斑素的細菌、該細菌的培養(yǎng)液或培養(yǎng)提取物、環(huán)狀多糖類、脂肪酸和由通式(X)或(XI)代表的化合物，然后從生成的包括培養(yǎng)的組織、培養(yǎng)的細胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中回收該紫杉烷型雙萜。
用于本發(fā)明的培養(yǎng)基的例子包括那些已知的通常用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基，例如Murashige & Skoog的培養(yǎng)基(1962)、Linsmaier Skoog的培養(yǎng)基(1965)、Woody Plant Medium培養(yǎng)基(1981)、Gamborg′s B-5培養(yǎng)基和Mitsui′s M-9培養(yǎng)基。
植物激素，如果需要的話，碳源、無機組分、維生素、氨基酸等也可以加到這些培養(yǎng)基中。
作為植物激素，可以使用例如茁長素如吲哚基乙酸(IAA)、萘基乙酸(NAA)和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和細胞分裂素類如激動素、玉米素和二氫玉米素。
作為碳源，可以使用二糖例如蔗糖、麥芽糖和乳糖，單糖如葡萄糖、果糖和半乳糖、淀粉或這樣的糖源中的兩種或幾種按適當比例混合的混合物。
無機組分的說明性的例子包括磷、氮、鉀、鈣、鎂、硫、鐵、錳、鋅、硼、銅、鉬、氯、鈉、碘和鈷，這些組分可以以像硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸鈣、氯化鉀、磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸鈉、硫酸鐵、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硼酸、硫酸銅、鉬酸鈉、三氧化鉬、碘化鉀、氯化鈷等這樣的化合物的形式加入。
維生素的說明性的例子包括生物素、硫胺素(維生素B1)、吡哆素(維生素B6)、泛酸、肌醇和煙酸。
作為氨基酸，例如可以使用甘氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸、半胱氨酸等。
一般使用的植物激素的濃度為約0.01-約10μM，碳源濃度為約1-約30g/l，無機組分濃度為約0.1μM-約100mM，維生素和氨基酸濃度分別為約0.1-約100mg/l。
根據本發(fā)明，可以使用液體培養(yǎng)基和含有瓊脂和gelan膠的含量通常為0.1-1％的固體培養(yǎng)基，但是，通常優(yōu)選液體培養(yǎng)基。
一片所述植物的根、生長點，葉、莖、種子、花粉、花藥和花萼等的組織或細胞，或其用上述培養(yǎng)基或其他常規(guī)培養(yǎng)基組織培養(yǎng)得到的培養(yǎng)細胞可以用于本發(fā)明的組織培養(yǎng)。
本發(fā)明也可以用于由根瘤土壤桿菌或生根土壤桿菌感染該植物組織得到的贅生物細胞和/或多毛根。
根據本發(fā)明，在至少一種選自如下的物質的存在下進行這些組織或細胞的組織培養(yǎng)，所選用的物質為暈斑素、產生該暈斑素的細菌、這樣細菌的培養(yǎng)液或培養(yǎng)提取物、環(huán)狀多糖類、脂肪酸和由通式(X)或(XI)代表的化合物，與不加該化合物或沒有進行處理的情況相比，可以得到具有較高紫杉烷型雙萜生產率的培養(yǎng)組織或培養(yǎng)細胞。
通過用有機溶劑如甲醇和二氯甲烷萃取，可以從按照上述方法得到的培養(yǎng)物如培養(yǎng)的組織、培養(yǎng)的細胞和培養(yǎng)基中分離出紫杉烷型雙萜。通過使合適的吸附劑或有機溶劑一起存在于培養(yǎng)基中，也可以連續(xù)回收該紫杉烷型雙萜。
根據本發(fā)明的一個優(yōu)選的組織培養(yǎng)的例子可以按如下加以說明。
把一片屬于紫杉屬植物的植物體例如根、生長點、葉、莖、種子等殺菌并放在用凝膠固化的Woody Plant Medium培養(yǎng)基上，在10-35℃保持約14-60天，以便部分組織片段變成愈傷組織。再次培養(yǎng)這樣得到的愈傷組織，生長的速度逐漸加快，并可以得到穩(wěn)定的愈傷組織。對于該穩(wěn)定的愈傷組織，我們指的是在培養(yǎng)期間保持在愈合狀態(tài)而沒有顯示分化成幼芽或根并且其細胞有均勻的生長速度的愈傷組織。
把這樣的穩(wěn)定的愈傷組織接種到適于增生的液體培養(yǎng)基，例如液體Woody Plant Medium培養(yǎng)基中并增生。在液體培養(yǎng)基中生長速度進一步增加。按照本發(fā)明，該穩(wěn)定的愈傷組織或構成上述愈傷組織的細胞在含有至少一種選自如下物質的固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基中生長，所述的物質為暈斑素，產生該暈斑素的細菌、該細菌的培養(yǎng)液或培養(yǎng)提取物，環(huán)狀多糖類、脂肪酸和由通式(X)或(XI)代表的化合物。
根據本發(fā)明，該組織培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度通常為約10-約35℃，優(yōu)選約23-約28℃，因為生長速度快。至于培養(yǎng)周期，優(yōu)選的是14-42天。
根據本發(fā)明，當用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)時，在培養(yǎng)完成之后用如傾析或過濾這樣的方法可以從培養(yǎng)基中分離出培養(yǎng)的細胞，使用例如用有機溶劑萃取的方法可以從培養(yǎng)的細胞和/或培養(yǎng)基中分離出所需要的紫杉烷型的雙萜。
本發(fā)明的方法可以與在茉莉酸存在下進行的培養(yǎng)方法一起使用，以便提高本發(fā)明的效果，在日本專利申請7-47580、6-104211、6-104212和6-104213中公開了茉莉酸作為促進生產紫杉烷型化合物的物質。
茉莉酸的說明性的例子包括茉莉酸、它的鹽、它的烷基酯、南瓜酸(Cucurbic acid)、它的鹽、它的烷基酯，晚香玉酸(tuberonic acid)、它的鹽和其烷基酯。
在這些化合物中，特別優(yōu)選的化合物，從它們的改善生產率的高有效性的觀點考慮例舉如下茉莉酸、茉莉酸甲酯、晚香玉酸、晚香玉酸甲酯、和南瓜酸或南瓜酸甲酯。
可以用于本發(fā)明的茉莉酸包括所有的立體異構體和它們的混合物。
在培養(yǎng)基中茉莉酸的濃度為0.01-1000μM，特別優(yōu)選的是控制茉莉酸的濃度為0.1-500μM。
當培養(yǎng)的細胞是在指數生長相或靜態(tài)相時，加入茉莉酸是有效的，特別優(yōu)選的是把茉莉酸在從指數生長相到靜態(tài)相的過渡期加入。為了增加要生產的內生的茉莉酸的量，可以對處理的時間安排作同樣的假定。例如，當每21天接種細胞時，第7-16天是合適的加茉莉酸或處理的時間，以便增加要生產的內生的茉莉酸的量。為了增加要生產的內生的茉莉酸的量，可以一次或分多次加該茉莉酸或處理。
另外，本發(fā)明可以與日本專利申請6-146826中公開的方法一起使用，在該申請中是從培養(yǎng)的最初階段開始就通過控制培養(yǎng)容器中氣相中氧的濃度小于大氣中氧的濃度來進行培養(yǎng)，或者從培養(yǎng)的初始階段開始就控制與該組織或細胞接觸的流體培養(yǎng)基中溶解的氧的濃度使其小于在該溫度下飽和溶解的氧濃度來進行培養(yǎng)。
在此，所說的培養(yǎng)的初始階段，我們指的是從開始培養(yǎng)的時間到開始培養(yǎng)后第7天的時間，控制培養(yǎng)容器中氣相中氧濃度或控制與該組織或細胞接觸的流體培養(yǎng)基中溶解氧濃度優(yōu)選從培養(yǎng)開始就進行?？刂频臅r間不受特別的限制，可以在整個培養(yǎng)周期按所述條件進行控制，或僅在整個的培養(yǎng)周期的部分時間進行控制，但是，優(yōu)選的是在整個的培養(yǎng)周期內至少進行控制3天。
在培養(yǎng)容器中氣相中的氧濃度需要控制到4-15％，特別優(yōu)選的是控制到6-12％。在流體培養(yǎng)基中溶解的氧濃度要求控制到在該溫度下飽和溶解氧濃度的1-75％，特別優(yōu)選的是將其控制到10-75％。
本發(fā)明也可以與日本專利公開7-135967和日本專利申請6-104213中公開的方法一起使用，其中這些細胞根據它們的比重的差別分成多個層，并培養(yǎng)至少一個層中所含有的細胞。
本發(fā)明也可以與日本專利申請6-201150中公開的方法一起使用，其中是在至少一種選自如下的物質的存在下進行培養(yǎng)，所述的物質為含重金屬的化合物、含重金屬的配位離子和重金屬離子。
至于重金屬，使用由銀代表的銅族金屬或由鈷代表的鐵族金屬是優(yōu)選的。優(yōu)選以含有所述重金屬的化合物的形式、含有所述重金屬的配位離子的形式，或以所述金屬離子的形式使用。特別優(yōu)選的是硫代硫酸銀離子。重金屬的濃度優(yōu)選是10-8M-10-2M。
本發(fā)明也可以與日本專利申請6-201151中公開的方法一起使用，其中是在胺的存在下進行培養(yǎng)。
優(yōu)選的是使用至少一種類型的選自如下的胺，這些胺為多胺如腐胺，亞精胺、精胺、乙二胺、N，N-二乙基-1，3-丙烷二胺、二亞乙基三胺和它們的鹽。胺的濃度優(yōu)選是10-8M-10-1M。
本發(fā)明的方法也可以與上述已有的專利中公開的兩種或多種方法結合在一起。
根據本發(fā)明，通過使用含有至少一種選自如下的物質的組織培養(yǎng)基，把產生紫杉烷型雙萜的植物進行組織培養(yǎng)，可以很容易地得到大量的紫杉烷型雙萜，所選用的物質為暈斑素、產生該暈斑素的細菌、該細菌的培養(yǎng)液或培養(yǎng)提取物、環(huán)狀多糖類、脂肪酸或茉莉酸的亞氨基或氨基衍生物。
用下面的實施例，比較例、參考例和合成例對本發(fā)明作進一步說明，但是，不應把這些例子看作是對本發(fā)明的范圍的限制。把一段已經預先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液或其他溶液消毒過的漿果紫杉LINN的莖放在已經加入萘基乙酸的其濃度為10-5M的固體Woody Plant Medium培養(yǎng)基(含有gelan膠0.25％(重量))上，在暗處25℃進行靜態(tài)培養(yǎng)，得到漿果紫杉LINN的愈傷組織。把1克(鮮重)該愈傷組織接種到含有20ml已加入上述組分得到相同濃度的液體Woody Plant Medium培養(yǎng)基的Erlenmeyer燒瓶中，并用旋轉搖動器(放大25mm，120rpm)進行搖動培養(yǎng)，每21天再次培養(yǎng)該愈傷組織，以便加速其生長速度。
作為產生暈斑素的細菌，在含有3ml細菌培養(yǎng)基802(多胨1.0％，酵母提取物0.2％，MgSO4·7H2O0.1％，pH7.0)的試管中，在180rpm、 30℃下培養(yǎng)丁香假單胞菌(IFO3310)24小時，以使細菌增殖。然后，把100μl所述的含有該增殖細菌的培養(yǎng)液接種到含有50ml葡萄糖基本培養(yǎng)基(葡萄糖8.8g/l，KH2PO42.6g/l，Na2HPO4·2H2O6.9g/l，NH4Cl2.5g/l，Na2SO41g/l，FeSO40.01g/l，MnSO40.01g/l，MgCl20.05g/l，pH6.8)的Erlenmeyer燒瓶中，并在30℃再培養(yǎng)24小時。把這樣得到的產生暈斑素的細菌的培養(yǎng)液濃縮到約1/20，然后用2N H2SO4調節(jié)pH到pH3，并用乙酸乙酯萃取。減壓干燥得到的羧酸餾分，然后溶于2ml乙醇中，其無菌過濾得到的濾液用作產生暈斑素的細菌的培養(yǎng)提取液。
把這樣得到的1g(鮮重)漿果紫杉LINN的培養(yǎng)細胞接種到含有20ml液體Woody Plant Medium培養(yǎng)基的Erlenmeyer燒瓶中，在25℃搖動培養(yǎng)14天。在開始培養(yǎng)后的第14天，把50μl產生暈斑素的細菌的培養(yǎng)提取液加到培養(yǎng)基中，再進一步培養(yǎng)7天。
培養(yǎng)完成之后，通過過濾和冷凍干燥收獲漿果紫杉LINN的培養(yǎng)細胞，然后測其干重，得到每升液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)細胞的產率。用甲醇或類似物從干的愈傷組織萃取紫杉烷型雙萜，通過用高性能液相色譜與標準的紫杉醇，頭胞滿寧和漿果赤霉素III比較來確定它們，以測定紫杉烷型雙萜的產率。結果列于表1中。重復實施例1，只是不加產生暈斑素的細菌的培養(yǎng)提取液。結果列于表1。重復實施例1，只是加入1ml在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)丁香假單胞菌生成的培養(yǎng)液通過無菌過濾得到的濾液來代替細菌的培養(yǎng)提取液并進行培養(yǎng)。結果列如表1。重復實施例1，只是加入1ml在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)丁香假單胞菌生成的培養(yǎng)液通過高壓滅菌得到的液體來代替細菌的培養(yǎng)提取液并進行培養(yǎng)。結果列于表1。重復實施例1，只是用田野黃胞菌(IFO13551)作為產生暈斑素的細菌。結果列于表1。重復實施例1，只是在開始培養(yǎng)后第的14天直接把丁香假單胞菌作為產生暈斑素的細菌接種到紫杉培養(yǎng)基中，并再另外培養(yǎng)7天。培養(yǎng)完成后，按類似于所述實施例的方法進行。結果列于表1。重復實施例1，只是在開始培養(yǎng)后的第14天直接把田野黃單胞菌接種到紫杉培養(yǎng)基中作為產生暈斑素的細菌，并且另外培養(yǎng)7天。培養(yǎng)完成后，按類似于所述實施例的方法進行。結果列于表1。
表1
該產率是根據總產量(在細胞中的＋在培養(yǎng)基中的)計算的]把一段已經預先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶或其他溶液消毒過的漿果紫杉LINN的莖放在已經加入萘基乙酸的其濃度為10-5M的固體Woody Plant Medium培養(yǎng)基(含gelan膠0.25％(重量))上，在暗處25℃下進行靜態(tài)培養(yǎng)，得到漿果紫杉LINN的愈傷組織。把1克(鮮重)該愈傷組織接種到含有20ml已經加入上述組分得到相同濃度的液體Woody Plant Medium培養(yǎng)基的Erlenmeyer燒瓶中，并用旋轉搖動器(放大25mm，120rpm)進行搖動培養(yǎng)，每21天再次培養(yǎng)該愈傷組織，以便加速其生長速度。
把這樣得到的1克(鮮重)培養(yǎng)細胞接種到含有20ml已經加入上述組分得到同樣濃度的液體Woody Plant Medium培養(yǎng)基的Erlenmeyer燒瓶中，在25℃搖動培養(yǎng)14天。開始培養(yǎng)后的第14天，把50μl暈斑素[式(IV)]作為暈斑素加入到培養(yǎng)基中，使最終濃度為0.001-1000μM，并另外再培養(yǎng)7天。
培養(yǎng)完成后，通過過濾和冷凍干燥收獲漿果紫杉LINN的培養(yǎng)細胞，然后測其干重，得到每升液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)細胞的產率。用甲醇或類似物從干的愈傷組織萃取紫杉燒型雙萜，通過使用高性能液相色譜與標準的紫杉醇、頭胞滿寧和漿果赤霉素III進行比較來確定它們，以測定紫杉烷型雙萜的產率，結果列于表2。重復實施例7，只是不加暈斑素。結果列于表2。
重復實施例7，只是將1μM N-暈斑?；i氨酸(N-Coronafacoylvaline)[式(IX)]作為暈斑素加入。結果列于表2。 [實施例9]重復實施例7，只是1μM暈斑素的甲酯作為暈斑素加入，結果列于表2。重復實施例7，只是10μM暈斑酸[式(V)]作為暈斑素加入，結果列于表2。重復實施例7，只是將10μM暈斑酸的甲酯作為暈斑素加入。結果列于表2重復實施例7，只是用類似于所述實施例的方法得到的紫杉培養(yǎng)基的培養(yǎng)細胞，并將暈斑素作為暈斑素加入，得到最終濃度1μM。結果列于表2。重復實施例12，只是不加暈斑素。結果列于表2。
表2 。把一段已經預先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液或類似溶液消毒過的漿果紫杉LINN的莖放在已經加入萘基乙酸的其濃度為10-5M的固體Woody Plant Medium培養(yǎng)基(含有gelan膠0.25％(重量))上，在暗處25℃下靜態(tài)培養(yǎng)，得到漿果紫杉LINN的愈傷組織。把0.1克(鮮重)該愈傷組織接種到內徑18mm含有1ml已經加入上述組分得到相同濃度的液體Woody Plant Medium培養(yǎng)基的管中，并用旋轉搖動器(放大25mm，120rpm)進行搖動培養(yǎng)，每28天再次培養(yǎng)該愈傷組織，以便加速其生長速度。
把這樣得到的1克(鮮重)培養(yǎng)細胞接種到裝有20ml已加入上述組份得到相同濃度的液體Woody Plant Medium培養(yǎng)基的Erlenmeyer燒瓶中，在25℃搖動培養(yǎng)14天。在開始培養(yǎng)后的第14天加入β-環(huán)糊精使其最終濃度為0.01mM，并另外再培養(yǎng)7天。
培養(yǎng)完成后，通過過濾和冷凍干燥收獲漿果紫杉LINN的培養(yǎng)細胞，然后測其干重，得到每升液體培養(yǎng)基的其產率。用甲醇或類似物從干的愈份組織萃取紫杉烷型雙萜，通過使用高性能液相色譜與標準紫杉醇、頭胞滿寧和漿果赤霉素III進行比較來確定它們，以測定紫杉烷型雙萜的產率。結果列于表3。重復實施例13，只是不加β-環(huán)糊精。結果列于表3。重復實施例13，只是加β-環(huán)糊精使最終濃度為0.1mM。結果列于表3。重復實施例13，只是加β-環(huán)糊精使最終濃度為1mM。結果列于表3。重復實施例13，只是加β-環(huán)糊精使最終濃度為10mM。結果列于表3。重復實施例13，只是加6-0-α-D-葡萄糖基-β-環(huán)糊精代替β-環(huán)糊精；使最終濃度為50mM。結果列于表3。重復實施例13-17，只是再加入茉莉酸的甲酯，使最終濃度為100μM。結果列于表4。重復比較例4，只是再加入茉莉酸的甲酯，使最終濃度為100μM。結果列于表4。重復實施例21，只是加入α-環(huán)糊精代替β-環(huán)糊精，使最終濃度為10mM。結果列于表5。重復實施例21，只是加入γ-環(huán)糊精代替β-環(huán)糊精，使最終濃度10mM。結果列于表5。重復實施例21，只是加入環(huán)果糖聚糖(一種連接7個果糖單元的化合物)代替β-環(huán)糊精，使最終濃度為10mM。結果列于表5。
表3 [**)用6-0-α-D-葡糖基-β-環(huán)糊精。]
表4 [**)用6-0-α-D-葡糖基-β-環(huán)糊精。]
表5<<
>[*)該產率是根據總產量(在細胞中的＋在培養(yǎng)基中的)計算的。][實施例26]該一段已經預先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液或類似溶液消毒過的漿果紫杉LINN的莖放在已經加入萘基乙酸的其濃度為10-5M的固體Woody Plant Medium培養(yǎng)基(含有gelan膠0.25％(重量))上，在暗處25℃下靜態(tài)培養(yǎng)，得到漿果紫杉LINN的愈傷組織。把1克(鮮重)該愈傷組織接種到裝有20ml液體Woody Plant Medinm培養(yǎng)基的Erlenmeyer燒瓶中，并用旋轉搖動器(放大25mm，100rpm)進行搖動培養(yǎng)，每21天再次培養(yǎng)該愈傷組織，以便加快其生長速度。
把2克(鮮重)這樣通過液體培養(yǎng)得到的該培養(yǎng)細胞接種到在100ml Erlenmeyer燒瓶中的20ml液體Woody Plant Medium培養(yǎng)基中，向該培養(yǎng)基加入α-亞麻酸0.01-1000μM(溶于乙醇的)，在暗處25℃下用旋轉搖動器(放大25mm，100rpm)進行搖動培養(yǎng)。
培養(yǎng)14天完成后，通過過濾和冷凍干燥培養(yǎng)的細胞，然后測量干重，得到其產率。用甲醇或類似物從干愈份組織和培養(yǎng)基中萃取紫杉烷型雙萜，用高性能液相色譜與標準的紫杉醇比較來確定它們，以測定紫杉醇的產率。結果列于表6。重復實施例26，只是加油酸100μM來代替α-亞麻酸。結果列于表7。重復實施例26，只是加亞油酸100μM來代替α-亞麻酸。結果列于表7。重復實施例26，只是加入花生四烯酸100μM代替α-亞麻酸。結果列于表7。重復實施例26，只是加入菜子油100mg/l代替α-亞麻酸。結果列于表7。重復實施例26，只是所用的植物種類是Taxus media(用于愈傷組織引發(fā)的部分是種子)。結果列于表8。重復實施例26，只是不加α-亞麻酸。結果列于表6。重復實施例31，只是不加α-亞麻酸。結果列于表8。
表6
表7
<p>表8 把1克(4.5mmol)茉莉酸甲酯溶于50ml甲醇中并用冰冷卻，然后加0.74g(4.5mmol)硫酸羥胺和0.88g(9.0mmol)醋酸鉀進行反應。將反應混合物靜置一夜，蒸發(fā)除去甲醇，加飽和碳酸氫鈉水溶液，用乙酸乙酯重復萃取生成的產物。收集乙酸乙酯萃取物，用無水硫酸鈉除去水，然后減壓下干燥除去乙酸乙酯，得到化合物A。
用類似合成化合物A的方法合成化合物B-I，只是用下面的試劑代替硫酸羥胺。
化合物 試劑BO-甲基羥胺鹽酸化物C水合肼D氨基脲鹽酸化物E甲酰肼F甲基磺酰肼G氨基氰H硫酰胺[合成實施例2]把1g合成實施例1合成的化合物A溶于50ml甲醇中。然后向其中滴加0.084g(2.2mmol)硼氫化鈉在5ml甲醇中的溶液，滴加完后，進一步攪拌反應混合物30分鐘。濃縮該溶液直到其變成約10ml。向該溶液中加入飽和碳酸氫鈉溶液，用乙酸乙酯重復萃取產物。收集乙酸乙酯萃取物，用無水硫酸鈉除去水，然后減壓干燥除去乙酸乙酯，得到化合物I。把已經預先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液或類似溶液消毒過的一部分Taxus media的胚芽放在已向其中加入萘基乙酸的其濃度為10-5M的固體Woody Plant Medium培養(yǎng)基(含有gelan膠0.25％(重量))上，并在暗處25℃下靜態(tài)培養(yǎng)，得到Taxus media的愈傷組織。把1g(鮮重)該愈傷組織接種到裝有20ml已向其中加入上述組分得到相同濃度的液體Woody Plant Medium培養(yǎng)基的Erlemeyer燒瓶中，用旋轉搖動器(放大25mm，100rpm)進行搖動培養(yǎng)，每14天再次培養(yǎng)該愈傷組織，以便加速其生長速度。
把2g(鮮重)這樣得到的培養(yǎng)細胞接種到含有20ml液體WoodyPlant Medium培養(yǎng)基的Erlenmeyer燒瓶中，把化合物A作為茉莉酸的衍生物加入；使最終濃度0.01-1000μM，并進一步再培養(yǎng)14天。
培養(yǎng)完成后，通過過濾和冷凍干燥收獲Taxus media的培養(yǎng)細胞，然后測其干重得到每升液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)細胞的產率。用甲醇或類似物從干的愈傷組織和培養(yǎng)基中萃取紫杉烷型雙萜，用高性能液相色譜與標準紫杉醇、頭胞滿寧和漿果赤霉素III比較來確定它們測定紫杉烷型雙萜的產率。結果列于表9。重復實施例32，只是不加茉莉酸的衍生物。結果列于表9。重復實施例32，只是加入茉莉酸甲酯100μM作為茉莉酸的衍生物。結果列于表9。重復實施例32，只是加入化合物B100μM作為茉莉酸的衍生物。結果列于表9。重復實施例32，只是加入化合物C100μM作為茉莉酸的衍生物。結果列于表9。重復實施例32，只是加入化合物D100μM作為茉莉酸的衍生物。結果列于表9。重復實施例32，只是加入化合物E100μM作為茉莉酸的衍生物。結果列于表9。重復實施例32，只是加入化合物F100μM作為茉莉酸的衍生物。結果列于表9。重復實施例32，只是加入化合物G100μM作為茉莉酸和衍生物。結果列于表9。重復實施例32，只是加入化合物H100μM作為茉莉酸的衍生物。結果列于表9。重復實施例32，只是加入化合物I100μM作為茉莉酸的衍生物。結果列于表9。
表9
權利要求
1.一種生產紫杉烷型雙萜的方法，其中在至少一種選自如下的物質的存在下培養(yǎng)產生紫杉烷型雙萜的植物的細胞和/或組織，所述的物質是暈斑素、產生該暈斑素的細菌、該細菌的培養(yǎng)液或培養(yǎng)提取液、環(huán)多糖類、脂肪酸和由通式(X)代表的化合物或通式(XI)代表的化合物 [式(X)中，Y是氫原子、羥基、氰基、NR28aR28b(其中R28a和R28b分別代表氫原子、氨基甲酰基、具有1-12個碳原子的酰基、具有1-12個碳原子的烷基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基、具有1個取代基的芳烷基或具有1-12個碳原子的烷基磺?；?、OR29(其中R29是具有1-12個碳原子的?；⒕哂?-12個碳原子的烷基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基或帶有1個取代基的芳烷基)、-CO-R30(其中R30代表氫原子、氨基、具有1-12個碳原子的烷基氨基)、具有1-12個碳原子的烷基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基、帶有1個取代基的芳烷基、氨基磺?；蚓哂?-12個碳原子的烷基亞硫酰基；R1a、R1b、R1c、R1d、R1e和R1f分別代表氫原子、羥基、具有1-12個碳原子的烷基、具有1-12個碳原子的烷氧基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基或帶有1個取代基的芳烷基；R20、R21、R22、R23和R24分別代表氫原子、羥基、具有1-12個碳原子的烷基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基或帶有1個取代基的芳烷基；由C1-C2-C3-C4-C5-C6組成的側鏈可以含有1個或多個雙鍵；R25代表羥基、OM(其中M是堿金屬原子、堿土金屬原子或NH4)、NR26aR26b(其中R26a和R26b分別代表氫原子、具有1-12個碳原子的?；?、具有1-12個碳原子的烷基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基、帶有1個取代基的芳烷基或氨基酸殘基)、OR27(其中R27代表具有1-12個碳原子的烷基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基、帶有1個取代基的芳烷基或糖類殘基)、具有1-12個碳原子的烷基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基或帶有1個取代基的芳烷基；n是整數1-7；并且在上述的五員環(huán)中，在相鄰的環(huán)中碳原子之間可以形成雙鍵]， [式(XI)中，R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f和R1g分別代表氫原子、羥基、具有1-12個碳原子的烷基、具有1-12個碳原子的烷氧基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基或帶有1個取代基的芳烷基；R20、R21、R22、R23和R24分別代表氫原子、羥基、具有1-12個碳原子的烷基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基或帶有1個取代基的芳烷基；由C1-C2-C3-C4-C5-C6構成的側鏈可以含有1個或多個雙鍵；R25代表羥基、OM(其中M代表堿金屬原子、堿土金屬原子或NH4)、NR26aR26b(其中R26a和R26b分別代表氫原子、具有1-12個碳原子的?；?、具有1-12個碳原子的烷基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基、帶有1個取代基的芳烷基或氨基酸殘基)、OR27(其中R27代表具有1-12個碳原子的烷基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基、帶有1個取代基的芳烷基或糖類殘基)、具有1-12個碳原子的烷基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基或帶有1個取代基的芳烷基；n是整數1-7；R31a和R31b分別代表氫原子、羥基、具有1-12個碳原子的酰基、具有1-12個碳原子的烷基、具有1-12個碳原子的烷氧基、芳基、帶有1個取代基的芳基、芳烷基、帶有1個取代基的芳烷基或氨基酸殘基；并且，在上述的五員環(huán)中，在相鄰的環(huán)中碳原子之間可以形成雙鍵]，然后從形成的培養(yǎng)物中回收紫杉烷型雙萜。
2.根據權利要求1的方法，其中是在至少一種選自暈斑素、產生該暈斑素的細菌、該細菌的培養(yǎng)液或培養(yǎng)提取液的物質的存在下進行培養(yǎng)。
3.根據權利要求2的方法，其中，暈斑素是由通式(I)或通式(II)代表的物質 [其中，R1代表羥基、OR2(其中R2代表具有1-6個碳原子的烷基或糖類殘基)、OM1(其中M1代表堿金屬原子、堿土金屬原子或NH4)，或NR3aR3b(其中R3a和R3b分別代表氫原子、具有1-6個碳原子的酰基、具有1-6個碳原子的烷基、氨基酸殘基或由通式(III)所代表的基團 (其中R4代表氫原子、羥基、具有1-6個碳原子的烷基、具有1-6個碳原子的烷氧基或由式-CO-R7代表的基團，(其中R7代表羥基、OM2(其中M2代表堿金屬原子、堿土金屬原子或NH4)、NR8aR8b(其中R8a和R8b分別代表氫原子、具有1-6個碳原子的酰基、具有1-6個碳原子的烷基或氨基酸殘基)、或OR9(其中R9代表具有1-6個碳原子的烷基或糖類殘基))；R5a、R5b、R6a和R6b分別代表氫原子、羥基、具有1-6個碳原子的烷基或具有1-6個碳原子的烷氧基)；R10a、R10b、R11a、R11b、R12、R13、R14a、R14b、R15a、R15b、R16a、R16b、R17和R19分別代表氫原子、羥基、具有1-6個碳原子的烷基或具有1-6個碳原子的烷氧基；R18代表氫原子、具有1-6個碳原子的烷基或糖類殘基；在式子中的五員環(huán)或六員環(huán)中的相鄰環(huán)中碳原子之間可以形成雙鍵]。
4.根據權利要求2的方法，其中暈斑素是由式(IV)代表的暈斑素
5.根據權利要求2的方法，其中暈斑素是由式(V)代表的暈斑酸
6.根據權利要求2的方法，其中產生暈斑素的細菌是屬于假單胞菌屬的微生物。
7.根據權利要求2的方法，其中產生暈斑素的細菌是丁香假單胞菌。
8.根據權利要求2的方法，其中產生暈斑素的細菌是屬于黃單胞菌屬的微生物。
9.根據權利要求2的方法，其中產生暈斑素的細菌是田野黃單胞菌。
10.根據權利要求2的方法，其中產生暈斑素的細菌的培養(yǎng)液是通過無菌過濾該細菌的培養(yǎng)液得到的濾液。
11.根據權利要求2的方法，其中產生暈斑素的細菌的培養(yǎng)提取液是在酸性條件下用有機溶劑萃取該細菌的培養(yǎng)液得到提取液。
12.根據權利要求2的方法，其中產生暈斑素的細菌的培養(yǎng)提取液是通過熱處理該細菌的培養(yǎng)液得到的。
13.根據權利要求2的方法，其中在培養(yǎng)基中暈斑素的濃度是0.001-1000μM。
14.根據權利要求1的方法，其中是在環(huán)多糖類存在下進行培養(yǎng)。
15.根據權利要求14的方法，其中環(huán)多糖類是α-環(huán)糊精。
16.根據權利要求14的方法，其中環(huán)多糖類是β-環(huán)糊精。
17.根據權利要求14的方法，其中環(huán)多糖類是γ-環(huán)糊精。
18.根據權利要求14的方法，其中環(huán)多糖類是環(huán)果糖聚糖。
19.根據權利要求14的方法，其中在培養(yǎng)基中環(huán)多糖類的濃度是0.01-50mM。
20.根據權利要求14的方法，其中也是在至少一種選自茉莉酸、其鹽、其烷基酯、南瓜酸、其鹽、其烷基酯、晚香玉酸，其鹽及其烷基酯的化合物的存在下進行培養(yǎng)的。
21.根據權利要求1的方法，其中是在脂肪酸的存在下進行培養(yǎng)的。
22.根據權利要求21的方法，其中脂肪酸是在主鏈上有10-22個碳原子的直鏈飽和的或不飽和的脂肪酸。
23.根據權利要求21的方法，其中脂肪酸在主鏈上有10-22個碳原子并具有1個或多個一種或多種類型的取代基，該取代基選自具有1-6個碳原子的烴基、羥基和氨基。
24.根據權利要求21的方法，其中脂肪酸是在主鏈上有10-22個碳原子并在主鏈上有1個或多個順式雙鍵的不飽和脂肪酸。
25.根據權利要求21的方法，其中脂肪酸是一種或多種選自油酸、亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸的化合物。
26.根據權利要求21的方法，其中脂肪酸是一種或多種選自癸酸、癸烯酸、月桂酸、十二碳烯酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻腦酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、11-十八碳烯酸、四-十八碳烯酸、花生酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、山萮酸、二十二碳六烯酸的化合物。
27.根據權利要求21的方法，其中脂肪酸是由通式(XII)代表的脂肪酸衍生物R32-COR33(XII)[其中，R32-CO代表由權利要求22-26的任一項的脂肪酸所衍生的原子團；R33代表OR34(其中R34代表具有1-6個碳原子的烷基或糖類殘基)、OM(其中M是代表堿金屬原子、堿土金屬原子或NH4)、或NR35aR35b(其中R35a和R35b分別代表氫原子、具有1-6個碳原子的烷基或氨基酸殘基]。
28.根據權利要求21的方法，其中加入到培養(yǎng)基中的脂肪酸的濃度是0.01-1000μM。
29.根據權利要求21的方法，其中加入到培養(yǎng)基中的脂肪酸的濃度是0.1-500μM。
30.根據權利要求21的方法，其中用作脂肪酸的天然植物油的用量相對于培養(yǎng)基的體積為1-1000mg/l。
31.根據權利要求1的方法，其中是在通式(X)或(XI)所代表的化合物的存在下進行培養(yǎng)。
32.根據權利要求31的方法，其中在培養(yǎng)基中由通式(X)或(XI)所代表的化合物的濃度是0.001-1000μM。
33.根據權利要求1的方法，其中紫杉烷型雙萜是至少一種選自如下的物質紫杉醇、10-脫乙?；仙即?、7-表紫杉醇、漿果赤霉素III、10-脫乙?；鶟{果赤霉素III、7-表漿果赤霉素III、頭胞滿寧、10-脫乙酰基頭胞滿寧、7-表頭胞滿寧、漿果赤霉素VI、紫杉烷Ia、木糖基頭胞滿寧、木糖基紫杉醇、紫杉醇C、10-脫乙酰基紫杉醇C、紫杉素I、紫杉素II、紫杉堿I、紫杉堿II和taxagifine。
34.根據權利要求1的方法，其中產生紫杉烷型雙萜的植物是屬于紫杉屬的植物。
35.根據權利要求1的方法，其中產生紫杉烷型雙萜的植物是漿果紫杉。
36.根據權利要求1的方法，其中產生紫杉烷型雙萜的植物是Taxus media。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生產紫杉烷型雙萜的方法，其中在至少一種選自如下物質的存在下培養(yǎng)產生紫杉烷型雙萜的植物的細胞和/或組織，所述的物質是暈斑素、產生暈斑素的細菌、該細菌的培養(yǎng)液或培養(yǎng)提取液、環(huán)多糖類、脂肪酸、茉莉酸的亞氨基或氨基衍生物，然后從生成的培養(yǎng)物中回收紫杉型雙萜。
文檔編號C07C233/63GK1132792SQ9512189
公開日1996年10月9日 申請日期1995年11月25日 優(yōu)先權日1994年11月25日
發(fā)明者行宗敬人, 原康弘, 丹弘明, 富野郁夫 申請人:三井石油化學工業(yè)株式會社