專利名稱：以二肽基礎(chǔ)的化合物生產(chǎn)的生物方法
背景技術(shù)：
以二肽中間物為基礎(chǔ)或至少部分為基礎(chǔ)的化合物的大規(guī)模生產(chǎn)需要很容易以很低的代價獲取大量的二肽中間物。實際上為此目的任何氨基酸的二肽都可以通過合成制備，但是合成二肽耗費時間，這將降低產(chǎn)品生產(chǎn)的效率并提高產(chǎn)品的價格。這些不利條件尤其對以二肽中間物為基礎(chǔ)的化合物的大規(guī)模生產(chǎn)尤其重要。
發(fā)明概述以下是生產(chǎn)二肽中間化合物的方法。這些二肽中間化合物由重組DNA技術(shù)生產(chǎn)，并從合成的DNA序列或自然產(chǎn)生的DNA序列中生產(chǎn)出來。這兩個序列都編碼含有特定重復(fù)二肽序列的蛋白質(zhì)或多肽。這些二肽中間物通過酶解作用從大的蛋白質(zhì)或多肽中釋放出來，然后進(jìn)一步加工以提供最終的化合物。發(fā)明詳述本發(fā)明描述了一個生產(chǎn)二肽中間化合物的方法。這些中間化合物進(jìn)一步加工用以生產(chǎn)最終化合物。這些二肽中間物可以通過重組DNA分子的表達(dá)在重組宿主細(xì)胞中得到生產(chǎn)，這些重組DNA分子至少編碼一個二肽中間物。重組DNA分子可以是合成的DNA分子或自然產(chǎn)生的DNA序列。編碼二肽的DNA被克隆進(jìn)一個表達(dá)載體，在重組的宿主細(xì)胞中表達(dá)。在宿主細(xì)胞中表達(dá)以后，二肽被純化出來做進(jìn)一步加工。在二肽被純化以前，把二肽從更大的多肽中分離出來是必須的。含有二肽中間物的一個稍大的多肽可以含有多個二肽序列的重復(fù)或者二肽做為稍大蛋白質(zhì)的一部分以一個或多個拷貝出現(xiàn)，此蛋白質(zhì)可以含有不是二肽序列的氨基酸序列。二肽序列的重復(fù)可以用酶切或者化學(xué)切割的方法分成單個二肽。單個二肽可以純化做進(jìn)一步加工。
用于生產(chǎn)二肽的重組宿主細(xì)胞可以是能夠表達(dá)重組DNA分子的任何宿主細(xì)胞。實際上適用于本發(fā)明方法的任何重組的宿主細(xì)胞對于本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員是顯而易見的，優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括，但不限于，細(xì)菌和真菌細(xì)胞，包括酵母細(xì)胞，適用于本發(fā)明的和現(xiàn)在商業(yè)上可以得到的細(xì)菌和真菌宿主細(xì)胞包括，但不限于，啤酒糖酵母，巴斯德畢赤酵母，大腸桿菌，黑曲霉，變青鏈霉菌，枯草芽孢桿菌。
用于表達(dá)編碼二肽DNA的表達(dá)載體可以是適用于所選擇宿主細(xì)胞的任何表達(dá)載體。這一點對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。優(yōu)選的載體包括，但不限于，那些適用于細(xì)菌真菌細(xì)胞并包括酵母的載體。適用于本發(fā)明的細(xì)菌和真菌表達(dá)載體和目前商業(yè)上可得到的包括，但不限于在此所列出的。
通過使用酶在合適的位置切開多肽而不損害二肽中間物，把二肽從剩余的非二肽中分離出來或把單個二肽從二肽重復(fù)序列中分離出來。適用于本發(fā)明方法中的酶可以是商業(yè)上得到的或者由那些擁有適合酶活力的組織所產(chǎn)生的。合適的酶的選擇依賴于所表達(dá)的特定的二肽序列。
二肽可以在它從多肽的剩余物或從二肽重復(fù)序列中分離之前或分離之后純化出來。標(biāo)準(zhǔn)的層析技術(shù)適用于本發(fā)明的方法用以純化單個二肽或含有二肽的多肽。標(biāo)準(zhǔn)的層析技術(shù)包括，但不限于鹽分級分離。離子交換層析，大小排阻層析，羥磷灰石吸附層析，疏水相互作用層析。
通過在此描述的方法，得到的克隆DNA可以重組表達(dá)。此方法是把分子克隆進(jìn)含有適合啟動子或其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)移進(jìn)原核或真核宿主細(xì)胞以產(chǎn)生重組肽。此技術(shù)的操作在Sambrook J，等，supra中得到詳盡描述，也是在本領(lǐng)域中熟知的。
在此定義的表達(dá)載體即這樣的DNA序列，在合適的宿主中它可以轉(zhuǎn)錄克隆基因的拷貝，并翻譯它們的mRNA。這樣的載體可以在各種各樣的宿主中表達(dá)真核基因，例如細(xì)菌，藍(lán)綠藻，植物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，真菌細(xì)胞，動物細(xì)胞。
特定設(shè)計的載體允許DNA在宿主之間的穿梭，例如細(xì)菌-酵母或細(xì)菌-動物細(xì)孢或細(xì)菌-真菌細(xì)胞，或細(xì)菌-無脊椎動物細(xì)胞。一個合適構(gòu)建的真核表達(dá)載體應(yīng)該包括一個在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的制備起點，選擇性標(biāo)記，限定數(shù)目的有用的限制酶切位點，一個有潛在能力高拷貝的有活力的啟動子。啟動子定義為這樣的DNA序列，它能指導(dǎo)RNA多聚酶連結(jié)到DNA上并啟動RNA的合成。一個強(qiáng)啟動子即它能以很高的頻率啟動mRNA的合成。表達(dá)載體可以包括，但不限制于克隆載體，修飾的克隆載體，特定設(shè)計的質(zhì)?；虿《?。
一系列哺乳動物表達(dá)載體可以在哺乳細(xì)胞中表達(dá)重組多肽。商業(yè)上可以得到的適合于重組多肽表達(dá)的哺乳動物表達(dá)載體包括，但不限于，pcDNA3(Invitrogen)，pMClneo(Stratagene)，pXT1(Stratagene)，pSG5(Stratage-ne)，EBO-pSV2-neo(ATCC 37593)，pBPV-1(8-2)(ATCC37110)，pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC 37224)，pRSVgpt(ATCC37199)，pRSVneo(ATCC 37198)，pSV2-dhfr(ATCC 37146)，pUCTag(ATCC 37460)，和λZD35(ATCC 37565).
各種細(xì)菌表達(dá)載體也可以用于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)重組多肽。商業(yè)上可以得到的適合于重組多肽表達(dá)的細(xì)菌表達(dá)載體包括，但不限于，pETlla(Novagen)，λgtll(Invitrogen)，pcDNAII(Invitrogen)，pKK223-3(Pharmacia)。
許多真菌細(xì)胞表達(dá)載體也可以用于在真菌細(xì)胞中表達(dá)重組多肽。商上可以得到的適合于重組多肽表達(dá)的真菌細(xì)胞表達(dá)載體包括，但不限于，pYES2(Invitrogen)，畢赤酵母屬表達(dá)載體(Invitrogen)。
許多昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體也可以用于在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)重組多肽。商業(yè)上可以得到的適合于重組多肽表達(dá)的昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體包括，但不限于，pBlueBacIII(Intvitrogen)。
一個含有編碼二肽中間物DNA的表達(dá)載體可以用于在一個重組宿主細(xì)胞中表達(dá)多肽。重組的宿主細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞，包括但不限于，細(xì)菌例如大腸桿菌，真菌細(xì)胞例如酵母，哺乳類細(xì)胞，包括但不限于，人、牛、豬、猴、嚙齒動物起源的細(xì)胞系，昆蟲細(xì)胞包括但不限于，果蠅屬和蠶起源的細(xì)胞系，起源于哺乳類的細(xì)胞系適合的并且商業(yè)上可得到的包括，但不限于，L細(xì)胞L-M(TK-)(ATCC CCL1.3)，L細(xì)胞L-M(ATCC CCL 1.2)，293(ATCC CRL1573)，Raji(ATCC CCL 86)，CV-(ATCC CCL 70)，COS-1(ATCC CRL 1650)，COS-7(ATCC CRL 1651)，CHO-KI(ATCC CCL 61)，3T3(ATCC CCL 92)，NIH/3T3(ATCC CRL1658)，Hela(ATCC CCL 2)，C127I(ATCC CRL 1616)，BS-C-1(ATCC CCL 26)和MRC-5(ATCC CCL 171)。
表達(dá)載體可以通過下列許多種技術(shù)中的任一種導(dǎo)入宿主細(xì)胞，包括但不限于，轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體，原生質(zhì)體融合，和電穿孔。含有表達(dá)載體的細(xì)胞經(jīng)過克隆繁殖，單個分析去決定它們是否可以產(chǎn)生蛋白。產(chǎn)生多肽的宿主細(xì)胞克隆的確定可以通過以下方法，包括但不限于采用抗-肽抗體的免疫反應(yīng)，或者出現(xiàn)宿主細(xì)胞相關(guān)的B1反應(yīng)，例如肽-特異性的配體連結(jié)或信號傳導(dǎo)，即定義為B1-特異性配體在受體上的相互作用所介導(dǎo)的反應(yīng)。
DNA的表達(dá)也可以用體外產(chǎn)生的合成mRNA或天然mRNA來進(jìn)行。合成的mRNA或從產(chǎn)生多肽的細(xì)胞中分離的mRNA能有效地在各種無細(xì)胞體系中翻譯，包括但不限于，小麥胚提取物和網(wǎng)狀細(xì)胞提取物，也能夠有效地在以細(xì)胞為基礎(chǔ)的系統(tǒng)翻譯，包括但不限于，微注射入蛙卵母細(xì)胞，優(yōu)選的是微注射入蛙卵母細(xì)胞。
為了確定產(chǎn)生最佳蛋白水平的DNA序列，可構(gòu)建包括，但不限于下列的DNA分子DNA全長開讀框架和幾個含有編碼蛋白的DNA部分的結(jié)構(gòu)。
蛋白表達(dá)的水平可以通過把這些結(jié)構(gòu)單獨或聯(lián)合導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞以后來確定。確定DNA盒產(chǎn)生最佳水平的表達(dá)以后，例如，在瞬時表達(dá)實驗中，DNA結(jié)構(gòu)被轉(zhuǎn)移到一系列表達(dá)載體中，在宿主細(xì)胞中表達(dá)，宿主細(xì)胞包括，但不限于，哺乳類細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，大腸桿菌和酵母細(xì)胞，例如啤酒糖酵母。
宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染子和微注射的卵母細(xì)胞可以通過下面方法測試蛋白水平。經(jīng)過一段適宜的時間以允許表達(dá)，然后測定多肽水平。一個測定多肽水平的方法包括在整個細(xì)胞中或從轉(zhuǎn)染DNA的宿主細(xì)胞制備的細(xì)胞裂解液中直接測定多肽的水平。
二肽丙氨酰脯氨酸，Ala-Pro，是合成ACE抑制劑，enalapril的起始物質(zhì)。二肽賴氨酰脯氨酸是合成ACE抑制劑Lysinopril的起始物質(zhì)。商業(yè)上可得到的二肽目前是化學(xué)合成的。已經(jīng)開發(fā)了一個新的生物方法，它成功地消除了化學(xué)生產(chǎn)Ala-Pro或Lys-Pro的需要，此方法利用一個重組宿主來過量表達(dá)一個含有Ala-Pro或Lys-Pro二肽重復(fù)的多肽，然后此多肽用細(xì)菌的脯氨酰肽酶類(prolylpoptidases)水解成它的Ala-Pro或Lys-Pro組成單位。選擇大腸桿菌做為宿主是由于表達(dá)載體的可獲得性?；瘜W(xué)合成的編碼Ala-Pro重復(fù)和合適連結(jié)位點的寡核苷酸被克隆進(jìn)商業(yè)上可得到的表達(dá)載體，pMAL。發(fā)酵含有重組結(jié)構(gòu)的重組大腸桿菌產(chǎn)生所需的融合產(chǎn)物，此產(chǎn)物由蛋白質(zhì)凝膠來確定。然后采用酶切方法釋放Ala-Pro單位。盡管脯氨酰肽酶類酶切作用也很好，商業(yè)上可獲得的因子X被用來釋放(Ala-Pro)n-20肽。預(yù)選篩選脯氨酰肽酶類導(dǎo)致確認(rèn)了瑞士乳桿菌和嗜麥芽黃單孢菌菌種，這些菌種具抗Ala-Pro-pNA和合成的(Ala-Pro)n底物的活性。每種培養(yǎng)物的粗提取物部顯示能成功地把(Ala-Pro)n-20分解成Ala-Pro，此方法可以由HPLC分析來確認(rèn)。當(dāng)兩種培養(yǎng)物的提取物合并時，可觀察到協(xié)同效應(yīng)。瑞士乳桿菌的脯氨酰肽酶的活性被認(rèn)為是由于外肽酶活性，相對于嗜麥芽黃單孢菌顯示的則是內(nèi)肽酶活性。在此所描述的生物方法有著能避免化學(xué)合成中所用有毒物質(zhì)的優(yōu)點，并適用于其它肽類。
二肽中間物在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)以后，重組蛋白可以回收并以純化的形式提供二肽中間物。幾種純化方法可以得到并適于應(yīng)用。在此所描述的是，重組二肽中間物通過下面的單個技術(shù)或多個技術(shù)的組合從細(xì)胞裂解液或提取物中得到純化，這類技術(shù)有鹽分級分離，離子交換層析，大小排阻層析，羥磷灰石吸附層析，疏水相互作用層析。
二肽中間物經(jīng)過在此描述的一個或多個技術(shù)的純化以后，這些技術(shù)對于多肽純化領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的，二肽中間物被進(jìn)一步加工成最終產(chǎn)物，二肽中間物Ala-Pro進(jìn)一步加工成最終產(chǎn)物，即已知的enalapril和相關(guān)化合物，此方法在美國專利號4,374,829和4,555,502中得到描述，這兩者為此目的在此引入作為參考。二肽中間物L(fēng)ys-Pro進(jìn)一步加工成最終產(chǎn)物，即已知的Lisinopril和相關(guān)化合物，此方法在美國專利號4,374,829和4,555,502中得到描述，這兩者為此目的在此引入作為參考。
下面的實例用以提供說明本發(fā)明，然而并不僅限于此。
實施例1構(gòu)建二肽表達(dá)的載體一個質(zhì)粒被選擇做為構(gòu)建表達(dá)二肽重復(fù)的DNA序列的載體。選擇的載體應(yīng)含有適于所選宿主的復(fù)制起點，相應(yīng)的載體也可含有適于在多于一種生物種類中表達(dá)的起點以使它做為穿梭載體?？股乜剐曰?或營養(yǎng)缺陷型標(biāo)志在質(zhì)粒上也是必要的，它用于確認(rèn)載體轉(zhuǎn)化或進(jìn)入細(xì)胞已經(jīng)完成并通過選擇壓力用于維持載體的穩(wěn)定性。一個強(qiáng)的啟動子，例如可誘導(dǎo)的tac啟動子允許最大限度表達(dá)下游基因。還要包括一個共有的核糖體連接位點，能被優(yōu)選的宿主所識別。下游翻譯終止序列和終止密碼子也應(yīng)包括以確保重組肽的合適長度。
相應(yīng)的，可以在表達(dá)載體中編碼一個融合蛋白。目的載體可以編碼一個截斷的肽，它總能在優(yōu)選的宿主中從它的天然啟動子或另一個強(qiáng)啟動子得到高表達(dá)。編碼多肽中間物，比如Ala-Pro或Lys-Pro和重復(fù)的基因或寡核苷酸的克隆位點，可以由合成技術(shù)得到設(shè)計或依據(jù)重復(fù)的5′或3′DNA序列來放入。產(chǎn)生的DNA組建物在表達(dá)時可以產(chǎn)生一個蛋白，它或者含有截斷酶，或者含有連結(jié)蛋白，例如從大腸桿菌中得到的麥芽糖結(jié)合蛋白融合到二肽中間物序列中。利用融合部分，分離可以很容易完成，接下來的加工可以去除5′肽。在某些宿主中，信號肽或引導(dǎo)肽允許正確的細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)，用于分泌所要產(chǎn)物。
在宿主組織中密碼子的優(yōu)先性得到應(yīng)用以加強(qiáng)表達(dá)。在宿主細(xì)胞中，密碼子的應(yīng)用總是有偏向性以致于在某些特定基因的表達(dá)中，主要使用一個或多個密碼子。產(chǎn)生高水平的蛋白或多肽的高表達(dá)的基因總是由被優(yōu)先使用或比別的更高頻率使用的密碼子來編碼。在大腸桿菌中，得到賴氨酸的兩個密碼子是AAA和AAG，四個密碼子有可能得到脯氨酸，CCA，CCC，CCG和CCU，CCG的密碼子序列是一個更高頻率使用的密碼子，這樣在合成的Lys-Pro寡核苷酸中Pro殘基設(shè)計成CCG。Lys只被兩個密碼子編碼，這兩個密碼子沒有明顯的優(yōu)先性，因此當(dāng)設(shè)計寡核苷酸時AAA和AAG都可選用，這些寡核苷酸會變成Lys-Pro的重復(fù)表達(dá)為Lys-Pro多肽。對于Ala-Pro寡核苷酸，GCT和GCA是優(yōu)先的密碼子序列，因此在大腸桿菌中被選用以最大限度的表達(dá)。
實施例2把DNA克隆進(jìn)大腸桿菌表達(dá)載體把肽表達(dá)盒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)載體以后，重組肽在大腸桿菌中產(chǎn)生，大腸桿菌表達(dá)載體包括，但不限于，pET系列(Novagen)、pET載體把肽置于噬菌體T7啟動子的嚴(yán)格調(diào)控之下。把此重組物導(dǎo)入大腸桿菌宿主以后，此宿主含有T7 RNA聚合酶基因的一個染色體拷貝，此基因由可誘導(dǎo)的lac啟動子驅(qū)動。當(dāng)把合適的lac底物(IPTG)加入培養(yǎng)基，多肽的表達(dá)可從誘導(dǎo)。多肽表達(dá)的水平由在此描述的實驗來確定。
編碼多肽的整個開讀框架的cDNA插入pET11a的NdeI位點。正方向的重組物由序列分析來確認(rèn)，然后用以轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌種BL21。轉(zhuǎn)化物接著用以孵育培養(yǎng)物以產(chǎn)生蛋白。培養(yǎng)物可以在M9或ZB培養(yǎng)基中生長，它們的配方對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的。當(dāng)生長到OB600＝1.5以后，肽的表達(dá)用1mM IPTG在37℃下誘導(dǎo)3小時。
實施例3把DNA克隆進(jìn)能在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的載體桿狀病毒載體，它來源于AcNPV病毒的基因組，被設(shè)計用于在昆蟲細(xì)胞系Sf9(ATCC CRL#1711)中提供cDNA的高表達(dá)。表達(dá)編碼二肽中間物DNA的重組桿狀病毒通過以下標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生(InVitrogenMaxbac手冊中)，DNA組建物被連入一系列桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的多角體蛋白基因中，這些轉(zhuǎn)移載體包括pAC360和Blue Bac載體(InVitrogen)。重組的桿狀病毒是通過同源重組得到的，即把桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體和線性化的AcNPV基因組DNA〔kitts，P.A.，《核酸研究》18，5667(1990)〕共轉(zhuǎn)染進(jìn)入Sf9細(xì)胞。重組PAC360病毒是經(jīng)過在感染細(xì)胞中內(nèi)含物的缺失來確認(rèn)，重組pBlue Bac病毒是依據(jù)β-半乳糖苷酶的表達(dá)(Summers，M.D。和Smith，G.E.，得克薩斯農(nóng)業(yè)實驗站公報號1555)來確認(rèn)。斑狀純化后，肽的表達(dá)由在此描述的實驗來測定。
編碼肽整個開讀框架的cDNA插入pBlue BacII的BamHI位點。正方向的重組物經(jīng)序列分析來確認(rèn)，并和線性化AcNPV野生型DNA一起轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞。
真正的肽被發(fā)現(xiàn)與感染的細(xì)胞有關(guān)。多肽通過低滲或去污劑的裂解從感染的細(xì)胞中抽取出來。
可替代地，肽可以在果蠅的Schneider2細(xì)胞系中通過兩個載體共轉(zhuǎn)染Schneider2細(xì)胞來表達(dá)，一個載體含有肽DNA下游并在可誘導(dǎo)的金屬硫蛋白啟動子調(diào)控下，另一個載體編碼有G418抗性新霉素基因。在G418中生長以后，可以得到抗性細(xì)胞，并通過加入硫酸銅誘導(dǎo)肽的表達(dá)。
實施例4把DNA克隆進(jìn)一個酵母表達(dá)載體把最佳DNA順反子插入到用于異源蛋白細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外表達(dá)的表達(dá)載體以后，可以在酵母的啤酒糖酵母中生產(chǎn)重組多肽。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時，載體例如EmBLyex4或類似的可以連結(jié)到順反子上〔Rinas，U.et al《生物技術(shù)》8，543-545(1990)；Holowitz B.等，《生物化學(xué)雜志》265，4189-4192(1989)〕。對于細(xì)胞外表達(dá)，順反子可以連結(jié)到酵母表達(dá)載體，它融合一個分泌信號。表達(dá)多肽的水平由在此描述的實驗來確定。
實施例5重組肽的純化重組產(chǎn)生的肽可以由抗體親合性層析來純化。
肽抗體親和柱的制備是把抗-肽抗體加到Affigel-10(Biorad)上，它是用N-羥基琥珀酰亞胺酯預(yù)活化的凝膠支持物以便抗體能和瓊脂糖凝膠珠支持物形成共價抗體連結(jié)?？贵w通過酰氨鍵用空間臂偶聯(lián)到凝膠上。剩余的活性酯用1M乙醇胺鹽酸(pH8)滅活。此柱在用0.23M甘氨酸鹽酸去除任何非-連結(jié)抗體或外來蛋白以后用水沖洗。此柱然后用磷酸緩沖鹽水(pH7.3)和合適的膜溶解劑比如去污劑一起來平衡，含有溶解肽的細(xì)胞培養(yǎng)物上清或細(xì)胞抽提物慢慢通過此柱。此柱用磷酸緩沖鹽水和去污劑一起沖洗直至光密度(A280)降到背景，然后蛋白用0.23M甘氨酸-鹽酸(pH2.6)加上去污劑一起洗脫。純化的蛋白然后從磷酸緩沖鹽水中透析出來。
實施例6重組生產(chǎn)Ala-Pro二肽Ala-Pro的表達(dá)在大腸桿菌中生產(chǎn)一個Ala-Pro多肽的策略包含克隆一個編碼Ala-Pro重復(fù)的序列。一系列商業(yè)上可得到的系統(tǒng)可以使用。為了減少開發(fā)時間，從新英格蘭生物實驗室購買了商業(yè)上可得到的表達(dá)系統(tǒng)pMAL。此系統(tǒng)利用了一個含有麥芽糖結(jié)合蛋白基因的載體，此基因毗鄰一個多克隆位點，在此目的DNA序列例如Ala-Pro重復(fù)密碼子可以克隆進(jìn)去。把含有上述載體的克隆導(dǎo)入后，會表達(dá)一個融合蛋白(麥芽糖-Ala-Pron)，麥芽糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域用于連結(jié)到一個麥芽糖柱上，麥芽糖結(jié)構(gòu)域被下面分離的因子X切去。
為了此目標(biāo)，兩個互補(bǔ)的寡核苷酸得到設(shè)計(87聚體和91聚體)，以編碼14個Ala-Pro單位和一個終止密碼子。寡核苷酸通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行分析。寡核苷酸通過SDS-PAGE純化，并從膠中抽提出來。一個定向性的克隆策略，用一個平末端和一個粘末端，以確保ala-pro基因正確排列和連入質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后選擇克隆。在一個克隆AP/2上，蛋白分析和誘導(dǎo)實驗表明誘導(dǎo)后產(chǎn)生了融合蛋白。在SDS-PAGE凝膠上帶的大小表示不止一個融合產(chǎn)物，然而融合蛋白的誘導(dǎo)和產(chǎn)生是明確的。
存在對克隆序列的重排以及設(shè)計進(jìn)寡核苷酸的終止密碼子的正確識別的疑慮，導(dǎo)致對插入DNA進(jìn)行測序。使用M13通用引物對來源于克隆的DNA進(jìn)行測序。有趣的是，插入序列編碼了20個ALA-PRO重復(fù)而不是14個Ala-Pro重復(fù)。終止密碼子出現(xiàn)在20個重復(fù)的末端。(Ala-Pro)20的出現(xiàn)被認(rèn)為是兩個寡核苷酸以搖擺的方式退火，產(chǎn)生的裂口在重組方法中由聚合酶補(bǔ)平。由于高度重復(fù)的序列，退火并非少見。在此情況下，由于它產(chǎn)生了一個更長的基因(因此有更長的Ala-Pro重復(fù))，它可能是有利的。水解Ala-Pro底物從ATCC得到三種細(xì)菌培養(yǎng)物，瑞士乳桿菌，LSP和嗜麥芽黃單孢菌在文獻(xiàn)上報導(dǎo)能產(chǎn)生脯氨酰肽酶的活性。培養(yǎng)物在250ml燒瓶中生長并用商業(yè)上可得到的比色底物，Ala-Pro-pNA(來源)來檢測水解活性。三種培養(yǎng)物都能提供脯氨酰肽酶活性，且大部分是和細(xì)胞相關(guān)的(表1)。接下來培養(yǎng)物的儲存做在斜面上并凍存在FVM′s中。為了最佳生長，乳酸桿菌對于斜面培養(yǎng)需要一個微型需氣小室，在燒瓶中則靜止液體培養(yǎng)。表1在(ALA-PRO)2上脯氨酰肽酶的特異活性
1.其中U指在37℃和最佳pH下每分鐘釋放的ALA-PRO(μmol)。2.在最佳溫度時的檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖液3.在pH8.0進(jìn)行4.來自Virtis勻漿細(xì)胞的酶提取物想要得到底物，它能反應(yīng)大腸桿菌生長方法中實際的低聚Ala-Pro底物。為此目的，由生物合成公司合成了用于脯氨酰肽酶底物的肽寡聚物。發(fā)展了一個分離低分子量肽和游離氨基酸的HPLC的方法以估計對Ala-Pro底物的酶的活性。接下來使用HPLC方法純化了從生物合成而來的肽聚合酶。從HPLC分部收集以后，可得到2，4，6重復(fù)的Ala-Pro肽。肽的溫度和最佳pH對每一個粗提取物都已確定(表2)。瑞士乳桿菌提供最高的酶活和特異性活性。從文獻(xiàn)(ref)中推薦的復(fù)雜的培養(yǎng)基用于所有研究，沒有做培養(yǎng)基的優(yōu)化與篩選。依據(jù)水解產(chǎn)物出現(xiàn)的差異，很明顯乳酸桿菌產(chǎn)生一個內(nèi)-脯氨酰二肽酶(endo-propyldipeptidase)，而黃單孢菌產(chǎn)生一個外肽酶，通過合并兩種酶得到(Ala-Pro)6水解的協(xié)同效應(yīng)顯示出此項觀察的益處。
1.單位定義為在35℃，pH7.0下每分鐘所釋放ALA-PRO的mmol數(shù)2.來自“珠打漿機(jī)”勻漿細(xì)胞的酶提取物。
已發(fā)現(xiàn)當(dāng)過量的酶(是正常實驗條件濃度的600倍)，引入Ala-Pro底物水解成丙氨酸和脯氨酸。金屬和半胱氨酸蛋白酶抑制劑對于抑制Ala-Pro的水解是有效的，卻對(Ala-Pro)6的水解無任何效果，這表明是不同的酶作用于Ala-Pro的分解。部分的純化應(yīng)從這些粗提取物中除去不需要的活性。
在此情況中，二肽中間物Ala-Pro進(jìn)一步加工成終產(chǎn)物，已知為enalapril和相關(guān)的化合物，這個方法在美國專利號4,374,829和4,555,502中得到描述,此兩者在此引用作為參考。
實施例7從重組的植物蛋白中重組產(chǎn)生Lys-Pro二肽富含Lys-Pro編碼序列的天然發(fā)生的序列可以在大豆(甘氨酸最多)〔從Hong et al，《生物化學(xué)雜志》1990〕的細(xì)胞壁蛋白基因家族中發(fā)現(xiàn)。大豆三個富含脯氨酸的蛋白基因是SbPRP1，SbPRP2和SbPRP3它們?nèi)齻€在長度上分別是256，230和90個氨基酸。這些蛋白的氨基酸組成表明殘基的34％至40％是脯氨酸，18％至25％是賴氨酸。由于特殊的目的，SbPRP1在肽序列中含有37個Lys-Pro氨基酸對，因此是Lys-Pro二肽的極好來源。SbPRP3編碼12個Lys-Pro二肽序列，它包含兩個Lys-Pro-Lys-Pro重復(fù)，編碼在此基因的183和195堿基處。
依據(jù)報導(dǎo)的DNA序列(文獻(xiàn))產(chǎn)生PCR引物，富含Lys-Pro的SbPRP1基因的克隆得以完成。用引物和含有大豆DNA的文庫產(chǎn)生含有目的序列的DNA片段。產(chǎn)生的富含Lys-Pro密碼子的DNA，連入表達(dá)載體的合適的限制性內(nèi)切酶位點。使用大腸桿菌宿主，大豆肽得到表達(dá)并從裂解細(xì)胞中回收。用瑞士乳桿菌和起源于此菌種的脯氨酰肽酶，蛋白水解成組成氨基酸和含有Lys-Pro殘基的小肽。層析或抽提將提供較純的Lys-Pro。
替代的方法是合成對應(yīng)于SbPRP3中Lys-Pro-Lys-Pro重復(fù)的寡核苷酸(或把這兩段背靠背放在一起，而這兩段在天然序列中是不連續(xù))，再加上設(shè)計的合適的限制性位點即可插入目的表達(dá)載體，在合適宿主中的表達(dá)會產(chǎn)生大量的寡肽形式的Lys-Pro。使用瑞士乳桿菌或起源于此菌種的脯氨酰肽酶，賴氨酸和脯氨酸富含的肽水解成Lys-Pro殘基。相應(yīng)地，一來源于腦膜膿毒性金黃桿菌〔Yoshimoto，T，等，《農(nóng)業(yè)的生物化學(xué)》，422417，1978〕的脯氨酸特異性蛋白酶用于水解肽，層析或抽提可以提供較純的Lys-Pro。
二肽中間物L(fēng)ys-Pro進(jìn)一步加工成終產(chǎn)物，即Lysinopril和相關(guān)的化合物，此方法在美國專利號4,374,829或4,555,502中得到描述，此兩者在此引入作為參考。
實施例8來源于重組兩棲類蛋白的Ala-Pro二肽的重組生產(chǎn)在爪蟾皮膚腺體的儲存小顆粒中發(fā)現(xiàn)了一個大約75KDa的酸性多肽，被認(rèn)為是APEG蛋白，富含Ala-Pro二肽〔Gmachl，M.等，《歐洲生物化學(xué)學(xué)會聯(lián)合會公報》260145-148〕此物質(zhì)的至少80％是以比率2∶2∶1∶1出現(xiàn)的丙氨酸，脯氨酸，谷氨酸和甘氨酸。
用從發(fā)表的序列中得到的探針篩選存在于λ起源的載體中的cDNA表達(dá)文庫，以分離目的片段。相應(yīng)的，對APEG的抗體可以用來篩選這樣一個cDNA表達(dá)文庫。目的片段從目的克隆中分離出來，插入一表達(dá)載體(得到的多肽的加工與例6一樣即水解Ala-Pro底物)。
一個優(yōu)選的方法是對應(yīng)于Ala-Pro-Ala-Pro-Ala-Pro(CAC CAG CTC CAG CAC CAG)的天然APEG DNA序列合成-寡核苷酸。再加上寡核苷酸上的合適的限制性位點，象上面一樣，DNA可以克隆進(jìn)一表達(dá)載體中在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)。象上述描述一樣，含有二肽中間物重復(fù)的肽可以水解，二肽中間物Ala-Pro可以分離出來進(jìn)一步加工成終產(chǎn)物。
二肽中間物Ala-Pro進(jìn)一步加工成終產(chǎn)物，即已知的enalapril和相關(guān)化合物，此方法在美國專利號4,374,829和4,555,502中得到描述，這兩者在此引入作為參考。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)以二肽為基礎(chǔ)的化合物的二肽中間物的方法，包括a)在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)重組的DNA分子，該DNA分子編碼了以多肽形式出現(xiàn)的二肽中間物的多個重復(fù)；b)用一個酶把步驟a)的多肽切割成游離的二肽中間物；c)分離和純化步驟b)的二肽中間物；和d)修飾二肽中間物以產(chǎn)生以二肽為基礎(chǔ)的化合物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中二肽中間物選自Ala-Pro和Lya-Pro。
3.權(quán)利要求1的方法，其中步驟1)的重組DNA分子選自SbPRP1，SbPRP2，SbPRP3和APEG。
全文摘要
公開了可產(chǎn)自二肽中間物的化合物的生產(chǎn)的生物方法。該方法包括含二肽中間物的重組多肽的生產(chǎn)。二肽中間物被進(jìn)一步處理以最終提供終產(chǎn)品。
文檔編號C07K5/00GK1193998SQ96194302
公開日1998年9月23日 申請日期1996年4月8日 優(yōu)先權(quán)日1995年4月11日
發(fā)明者W·S·伯爾納曼, A·戈亞爾, M·J·康德, V·A·芬奇 申請人:麥克公司