專利名稱：用于寡核苷酸合成的中間體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及寡核苷酸中間體化合物和該化合物在寡核苷酸制備中的用途。
因此，本發(fā)明一方面提供了一種下式化合物
其中B1是一種核苷堿的殘基，R1是氫或一種羥基保護(hù)基團(tuán)，R2是氫、羥基或一種2’核苷修飾性原子或基團(tuán)，R3是一個(gè)未發(fā)生取代或已發(fā)生取代的C1至C10烷基、C2至C10鏈烯基、C4至C10環(huán)烷基烷基、C6至C10芳基或C7至C13芳烷基，Z是鹵素或一個(gè)下式基團(tuán)
其中R4與R5均獨(dú)立為一個(gè)未發(fā)生取代或已發(fā)生取代的C1至C10烷基、C2至C10鏈烯基、C4至C10環(huán)烷基烷基、C6至C10芳基或C7至C13芳烷基，或者R4為所述基團(tuán)且R5為氫，或者R4與R5以及它們所連接的氮原子共同表示一個(gè)五元至十三元雜環(huán)；或者Z是一個(gè)下式基團(tuán)Nuc-O-Ⅲ其中Nuc是一種天然或合成的核苷或寡核苷酸在除去通過5’亞甲基與所示氧原子連接的5’羥基后的殘基。
若R3、R4或R5表示一個(gè)取代的烷基、鏈烯基、環(huán)烷基烷基、芳基或芳烷基，該基團(tuán)優(yōu)選被鹵素、羥基、C1-C4烷氧基、氰基、硝基或三(C1-C15烴基)甲硅烷基取代，或者在R3的情況下，優(yōu)選被C1-C4烷基磺?；駽6-C10芳基磺酰基取代。
若式Ⅰ化合物中含有一個(gè)三(C1-C15烴基)甲硅烷基，該基團(tuán)例如可以是三烷基甲硅烷基，如三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三正丙基甲硅烷基、三異丙基甲硅烷基、三正丁基甲硅烷基、三異丁基甲硅烷基、異丙基二甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基或1,1,2,2-四甲基乙基二甲基甲硅烷基(thexyldimethylsilyl)；三芳基甲硅烷基，如三苯基甲硅烷基；三芳烷基甲硅烷基，如三芐基甲硅烷基；芳二烷基甲硅烷基，如苯基二甲基甲硅烷基、苯基二乙基甲硅烷基、苯基二異丙基甲硅烷基或苯基二叔丁基甲硅烷基；或烷基二芳基甲硅烷基，如甲基二苯基甲硅烷基、異丙基二苯基甲硅烷基或叔丁基二苯基甲硅烷基。如果R3、R4或R5具有一個(gè)三(C1-C15烴基)甲硅烷基取代基，該取代基優(yōu)選為三(C1-C4烴基)甲硅烷基，尤其是三甲基甲硅烷基。R1作為三(C1-C15烴基)甲硅烷基，優(yōu)選為C1-C6烷基二(C6-C8芳基)甲硅烷基，尤其是叔丁基二苯基甲硅烷基；或者支鏈C2-C10烷基二(C1-C4烷基)甲硅烷基，尤其是1,1,2,2-四甲基乙基二甲基甲硅烷基。
R1可以是任意羥基保護(hù)基團(tuán)，能夠保護(hù)5’羥基不發(fā)生所不需要的反應(yīng)。這樣的基團(tuán)是為人所熟知的，包括C1至C10脂族基團(tuán)，例如烷基；C3至C8環(huán)脂族基團(tuán)，例如環(huán)烷基；C6至C10芳族基團(tuán)，例如芳基；C7至C40芳脂族基團(tuán)，例如芳烷基或C1至C4烷氧基取代的芳烷基；式-COR或-SO2R基團(tuán)，其中R是一個(gè)C1至C10脂族基團(tuán)、C3至C8環(huán)脂族基團(tuán)、C6至C10芳族基團(tuán)或C7至C40芳脂族基團(tuán)；和三(C1-C15烴基)甲硅烷基。R1優(yōu)選為氫或一個(gè)常用于寡核苷酸合成的5’保護(hù)基團(tuán)，更優(yōu)選為氫、一個(gè)C7至C40芳脂族基團(tuán)或一個(gè)三(C1-C15烴基)甲硅烷基，尤其是一個(gè)未發(fā)生取代或已發(fā)生取代的三苯甲基，如甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基或三叔丁基三苯甲基，或一個(gè)C1-C6烷基二(C6-C8芳基)甲硅烷基，如叔丁基二苯基甲硅烷基，特別是二甲氧基三苯甲基或叔丁基二苯基甲硅烷基。
R2是2’核苷修飾性原子或基團(tuán)，也就是可以代替氫原子或羥基連接在核苷2’位上并使其修飾的原子或基團(tuán)，它可以是一個(gè)鹵素原子，如氟、氯或溴原子；C1至C10未取代的烷基，如甲基、三氟甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、辛基或癸基；C6至C10芳基，如苯基、甲苯基或二甲苯基；C7至C13芳烷基，如芐基；氨基；C1至C10烷基氨基，如甲氨基、乙氨基或辛氨基；C1至C10烷基硫基，如甲硫基、乙硫基或辛硫基；疊氮化物；硝酸鹽；亞硝酸鹽；氰化物；氰酸鹽；甲磺酸鹽；C1至C10氨基烷基氨基；式-OR6或-OCOR6基團(tuán)，其中R6是一個(gè)C1至C30有機(jī)基團(tuán)；取代的甲硅烷基；一個(gè)RNA切割基團(tuán)；一個(gè)膽甾烯基；共軛連接；一個(gè)報(bào)道基團(tuán)；一個(gè)嵌入基；一個(gè)可提高寡核苷酸藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)；或一個(gè)可提高寡核苷酸藥物效力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)。
R2優(yōu)選為氫、鹵素、羥基或一個(gè)式-OR6或-OCOR6基團(tuán)，其中R6是一個(gè)C1至C10烷基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、正己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、正壬基或正癸基；C2至C10鏈烯基，如乙烯基、烯丙基、甲代烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基或癸烯基；一個(gè)C3至C8環(huán)烷基，如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、甲基環(huán)戊基、環(huán)己基、甲基環(huán)己基、環(huán)庚基或環(huán)辛基；一個(gè)C4至C10環(huán)烷基烷基，如環(huán)丙基甲基、環(huán)丁基甲基、環(huán)己基甲基、甲基環(huán)己基甲基、環(huán)己基乙基或二甲基環(huán)己基乙基；一個(gè)C6至C10芳基，如苯基，鄰、間或?qū)妆交?，鄰、間或?qū)Χ妆交蜉粱?；或一個(gè)C7至C25芳烷基，如芐基、苯乙基、二苯甲基或三苯甲基，任意這些基團(tuán)可以是未取代的或被鹵素、羥基、C1至C4烷氧基或氰基取代，或者，如果R2為式-OR6基團(tuán)，則R6是一個(gè)三(C1-C15烴基)甲硅烷基。
在更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，R2為氫、羥基、氟、一個(gè)式-OR6基團(tuán)，其中R6是一個(gè)C1至C4烷基、一個(gè)C2至C4鏈烯基、一個(gè)C7至C13芳烷基；或者是一個(gè)式-(R7-O)N-R8基團(tuán)，其中R7為C1至C4亞烷基，R8為C1至C4烷基，n為1至8；或者R2是一個(gè)式-OCOR6，其中R6為C1至C4烷基或C6至C8芳基。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，R2為氫、羥基、氟、甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、芐氧基、甲氧基乙氧基、-O-(CH2-CH2-O-)3-CH3、乙酸基或苯甲酸基。
R3、R4或R5作為C1至C10烷基，例如可以是一種直鏈或支鏈基團(tuán)，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、正己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、正壬基或正癸基。R3、R4或R5作為C2至C10鏈烯基，例如可以是乙烯基、烯丙基、甲代烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基或癸烯基。R3、R4或R5作為C4至C10環(huán)烷基烷基，例如可以是環(huán)丙基甲基、環(huán)丁基甲基、環(huán)戊基甲基、環(huán)戊基乙基、甲基環(huán)戊基甲基、環(huán)己基甲基、環(huán)己基乙基、甲基環(huán)己基甲基、甲基環(huán)己基乙基、二甲基環(huán)己基甲基或二甲基環(huán)己基乙基。R3、R4或R5作為C6至C10芳基，例如可以是苯基、鄰甲苯基、間甲苯基、對(duì)甲苯基、鄰二甲苯基、間二甲苯基或?qū)Χ妆交3、R4或R5作為C7至C13芳烷基，例如可以是芐基、苯乙基或二苯甲基。作為R3、R4或R5的任意上述基團(tuán)可以是未取代的或已發(fā)生如前文所述的取代。
若R4與R5以及所連接的氮原子共同表示一個(gè)雜環(huán)，該環(huán)例如可以是一個(gè)五元環(huán)，如吡咯烷環(huán)；一個(gè)六元環(huán)，如哌啶、2,6-二甲基哌啶、N-甲基哌嗪、嗎啉或硫代嗎啉環(huán)；一個(gè)七元環(huán)，如全氫化吖庚因環(huán)；一個(gè)八元環(huán)，如全氫化吖辛因環(huán)；一個(gè)九元環(huán)，如全氫化偶氮寧環(huán)；一個(gè)十元環(huán)，如全氫化吖癸因環(huán)；一個(gè)十一元環(huán)，如氮雜環(huán)十一烷環(huán)；一個(gè)十二元環(huán)，如氮雜環(huán)十二烷環(huán)；或一個(gè)十三元環(huán)，如氮雜環(huán)十三烷環(huán)。
R3優(yōu)選為未發(fā)生取代或已發(fā)生取代的C1至C4烷基、C3至C5鏈烯基、C6至C8環(huán)烷基烷基或C7至C9芳烷基，尤其是甲基、乙基、2-氰乙基、2,2,2-三氯乙基、烯丙基、芐基或2-(三甲基甲硅烷基)乙基。
若式Ⅰ中的Z為式Ⅱ基團(tuán)，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，R4與R5獨(dú)立為未發(fā)生取代或已發(fā)生取代的C1至C4烷基、C3至C5鏈烯基、C6至C8環(huán)烷基烷基或C7至C9芳烷基；或R4為C1至C4烷基，優(yōu)選為分支的C1至C4烷基，如異丙基或叔丁基，或C7至C9芳烷基，如芐基，且R5為氫；或R4與R5以及所連接的氮原子共同表示一個(gè)五元或六元雜環(huán)，環(huán)中具有一或兩個(gè)雜原子。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，R4與R5獨(dú)立為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、烯丙基或芐基，或R4與R5以及所連接的氮原子共同表示一個(gè)吡咯烷、哌啶或嗎啉環(huán)。
若式Ⅰ中的Z為式Ⅲ基團(tuán)，Nuc殘基可以是任意天然或合成核苷在除去5’羥基后的殘基，例如腺苷、胞苷、鳥苷、胸苷、尿苷、2-氨基腺苷、6-N-芐基腺苷、5-N-甲基胞苷、4-N-苯甲?；?、5-丙炔基胞苷、2-N-異丁酰基鳥苷、N-芐氧甲基胸苷或5-氟尿嘧啶；或從其中派生的寡核苷酸，可以是二核苷酸、三核苷酸或更高級(jí)的寡聚物，并且具有天然的即磷酸二酯核苷間鍵或其合成的類似鍵，如硫代磷酸酯鍵或甲基膦酸酯鍵，或這樣的核苷間鍵的P(Ⅲ)前體。
式Ⅰ中的B1可以是一種見于天然來源的核苷堿的殘基，它可以是未發(fā)生取代或已發(fā)生取代的，例如在一個(gè)氮原子上被一個(gè)保護(hù)基團(tuán)如一種?；〈?，該?；梢允侵宓娜缫阴；?，或芳族的如苯甲酰基或硝基苯甲?；换虮灰粋€(gè)芳烷氧基烷基保護(hù)基團(tuán)取代，如芐氧甲基；或者是這種堿的合成的類似物。常用于核苷酸化學(xué)的其他類型保護(hù)基團(tuán)可以存在于B1中的氮原子上，包括脒基，如N,N-二甲基甲脒、N,N-二甲基乙脒和N-甲基吡咯烷脒基，和烷氧基羰基，如叔丁氧基羰基，它可將氨基轉(zhuǎn)化為氨基甲酸酯基。
因此B1可以是嘌呤或嘧啶堿的殘基，如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶，或這些堿的類似物，如2-氨基腺嘌呤、6-羥基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶或二氫尿嘧啶，或者在這種殘基的一個(gè)氮原子上被例如上述的保護(hù)基團(tuán)取代的殘基。
在Z是一個(gè)式Ⅲ基團(tuán)的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，Nuc是一個(gè)上述核苷或寡核苷酸殘基，該殘基的末端3’位通過諸如琥珀酰基等一種連接基團(tuán)附著在固相載體如固相寡核苷酸合成中所使用的載體上，載體例如一種含有長(zhǎng)鏈烷氨基的基于二氧化硅的惰性載體，如受控制的多孔玻璃(controlled pore glass,CPG)。該固體載體還可含有對(duì)將在載體上合成的寡核苷酸來說起到3’末端修飾性基團(tuán)作用的基團(tuán)。
本發(fā)明化合物可以是可能的異構(gòu)體形式之一，例如非對(duì)映異構(gòu)體、旋光異構(gòu)體、外消旋物或其混合物。式Ⅰ化合物優(yōu)選的異構(gòu)體為下式
其中B1、R1、R2和R3如上文定義。
尤其優(yōu)選的式Ⅰ化合物具體如下文實(shí)施例所述。
使其中Z為鹵素的式Ⅰ化合物、即下式化合物
其中B1、R1、R2和R3如上文定義，Y為鹵素，與下式化合物反應(yīng)，
其中R4和R5如上文定義，可制得其中Z為式Ⅱ基團(tuán)的式Ⅰ化合物?？梢栽谟袡C(jī)溶劑例如鹵代烴(如氯仿)中，在叔氮堿如吡啶的存在下，在-78℃至50℃、優(yōu)選為-30℃至25℃的溫度下進(jìn)行該反應(yīng)。
通過下式化合物的非氧化性鹵化反應(yīng)可制得式Ⅴ化合物，
其中B1、R1、R2和R3如上文定義?？梢栽谝环N堿、優(yōu)選為一種叔氮堿如吡啶的存在下，在可以是吡啶但優(yōu)選為一種鹵代烴如氯仿的有機(jī)溶劑中，在-20℃至60℃、優(yōu)選為0℃至50℃的溫度下，使式Ⅶ化合物與一種非氧化性鹵化劑、例如一種鹵代正膦、如三苯基二氯正膦或二氯三(2,4,6-三溴苯氧基)正膦反應(yīng)，進(jìn)行非氧化性鹵化反應(yīng)。
式Ⅵ化合物是商業(yè)上可得到的或可按已知方法制備的胺類。
WO 96/08503描述了式Ⅶ化合物及其制備。
使其中R1為羥基保護(hù)基團(tuán)且Z為式Ⅱ基團(tuán)的式Ⅰ化合物與具有一個(gè)游離5’羥基的天然或合成核苷或寡核苷酸(包括具有一或多個(gè)P(Ⅲ)前體核苷間鍵的寡核苷酸)反應(yīng)，可以制得其中Z為式Ⅲ基團(tuán)的式Ⅰ化合物。該反應(yīng)可以在溶液中進(jìn)行，或者與附著在如前文所述的載體上的核苷或寡核苷酸反應(yīng)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，該反應(yīng)可以采用常規(guī)寡核苷酸合成中具有一個(gè)3’亞磷酰胺基的核苷與具有一個(gè)游離5’羥基的核苷或寡核苷酸之間的偶合反應(yīng)所已知的反應(yīng)條件和方法，例如參見《寡核苷酸與類似物一種實(shí)用的方法》F.Eckstein編著，IRL出版社1991。
因此，在一種胺-質(zhì)子化偶合催化劑(活化劑)如四唑或5-(4-硝基苯)四唑的存在下，其中Z為式Ⅱ基團(tuán)的式Ⅰ化合物可以與核苷或寡核苷酸反應(yīng)，得到其中Z為式Ⅲ基團(tuán)的式Ⅰ化合物。該反應(yīng)可以在-20至50℃、優(yōu)選在室溫下進(jìn)行。
若其中Z為式Ⅲ基團(tuán)的式Ⅰ化合物與一種附著在固相載體上的核苷或寡核苷酸反應(yīng)，其產(chǎn)物為一種式Ⅰ化合物，其中Z為式Ⅲ基團(tuán)且Nuc是附著在固相載體上的核苷或寡核苷酸殘基。
其中Z為式Ⅲ基團(tuán)的式Ⅰ化合物是用于寡核苷酸制備的中間體，該寡核苷酸具有比Nuc中的寡核苷酸殘基更多的核苷殘基。因此，本發(fā)明也提供了一種下式寡核苷酸的制備方法
其中B1、R1、R3和Nuc如上文定義，X為氧或硫，該方法包括使其中Z為式Ⅲ基團(tuán)的式Ⅰ化合物進(jìn)行氧化反應(yīng)，以生成其中X為氧的式Ⅷ寡核苷酸，或者進(jìn)行硫化反應(yīng)，以得到其中X為硫的式Ⅷ寡核苷酸。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，其中Z為式Ⅲ基團(tuán)的式Ⅰ化合物的氧化反應(yīng)或硫化反應(yīng)可以分別使用亞磷酸鹽核苷間鍵的氧化反應(yīng)或硫化反應(yīng)所用的方法。因此例如使用已知的寡核苷酸合成中亞磷酸鹽核苷間鍵的氧化反應(yīng)條件和方法，通過用碘與水，或用一種過氧化氫化物、如過氧化氫叔丁酯處理其中Z為式Ⅲ基團(tuán)的式Ⅰ化合物，可以使其進(jìn)行氧化反應(yīng)。例如使用已知的亞磷酸鹽核苷間鍵的硫化反應(yīng)方法，在一種有機(jī)溶劑、通常為二硫化碳中，在一種叔胺的存在下通過用硫處理，通過用[3H]1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物(Beaucage試劑)處理，或用四乙基秋蘭姆處理其中Z為式Ⅲ基團(tuán)的式Ⅰ化合物，可以使其進(jìn)行硫化反應(yīng)。氧化反應(yīng)與硫化反應(yīng)一般都是在室溫下進(jìn)行的。
因此，本發(fā)明在另一方面提供了寡核苷酸的制備方法，該方法包括使具有一個(gè)被保護(hù)的5’羥基和一個(gè)3’位下式基團(tuán)的核苷與一種具有一個(gè)游離5’羥基的天然或合成的核苷或寡核苷酸進(jìn)行核苷偶合反應(yīng)
其中R3、R4和R5如前文定義，反應(yīng)生成一種具有一個(gè)下式核苷間鍵的寡核苷酸前體
其中R3如前文定義，再使該前體轉(zhuǎn)化為一種具有一個(gè)下式核苷間鍵的寡核苷酸
其中R3如前文定義，X為氧或硫，該轉(zhuǎn)化作用是通過氧化該前體得到具有式Ⅺ核苷間鍵(其中X為氧)的寡核苷酸或硫化該前體得到具有式Ⅺ核苷間鍵(其中X為硫)的寡核苷酸而實(shí)現(xiàn)的。
在3’位具有式Ⅸ基團(tuán)的核苷、具有一個(gè)游離5’羥基的核苷或寡核苷酸以及進(jìn)行這些反應(yīng)的方法可以如上文所述。
可以對(duì)其中Nuc是附著在固相載體上的核苷或寡核苷酸的殘基的式Ⅷ寡核苷酸進(jìn)行處理，以除去5’保護(hù)基團(tuán)R1，再使所得具有末端5’羥基的寡核苷酸與一種天然或合成的具有被保護(hù)的5’羥基與反應(yīng)性的或可被激活而具有反應(yīng)活性的3’位基團(tuán)的核苷或寡核苷酸進(jìn)行連續(xù)的偶合反應(yīng)，將去保護(hù)的式Ⅷ寡核苷酸上的游離5’羥基附著在載體上，直至得到所需長(zhǎng)度的寡核苷酸。因此，式Ⅷ寡核苷酸可以與具有3’亞磷酰胺基、H-膦酸酯基或磷酸二酯基和被保護(hù)的5’羥基的核苷或寡核苷酸偶合，或者可以與其中Z為式Ⅱ基團(tuán)的式Ⅰ化合物偶合，以得到一種鏈被延長(zhǎng)的寡核苷酸，進(jìn)一步進(jìn)行這兩種反應(yīng)之一可依次進(jìn)一步延長(zhǎng)鏈，直至得到所需長(zhǎng)度的寡核苷酸。在使用具有3’亞磷酰胺基、H-膦酸酯基或磷酸二酯基的核苷或寡核苷酸的情況下，可以使用寡核苷酸合成中的已知方法進(jìn)行這些偶合反應(yīng)。在使用其中Z為式Ⅱ基團(tuán)的式Ⅰ化合物的情況下，偶合反應(yīng)可如前文所述進(jìn)行。因此，在使用3’亞磷酰胺或其中Z為式Ⅱ基團(tuán)的式Ⅰ化合物的情況下，一個(gè)偶合周期涉及一個(gè)氧化或硫化步驟，而如果所用的是3’H-膦酸酯，則氧化反應(yīng)或硫化反應(yīng)是在鏈延長(zhǎng)完成后進(jìn)行的，如果所用的是3’磷酸二酯，則不需要氧化反應(yīng)。
在合成了具有所需數(shù)量核苷的寡核苷酸以后，可用常規(guī)方法對(duì)其進(jìn)行處理以除去羥基保護(hù)基團(tuán)如二甲氧基三苯甲基，例如用一種含水有機(jī)酸處理，如三氟乙酸。若寡核苷酸是在固相載體上合成的，則這種處理措施例如可以使用諸如濃氨水處理等常規(guī)方法在寡核苷酸從載體上脫離下來之前或之后進(jìn)行，該處理方法也除去了用于寡核苷酸合成的一個(gè)或多個(gè)核苷的環(huán)外氮原子上的保護(hù)基團(tuán)。由去保護(hù)作用產(chǎn)生的末端5’羥基通過反應(yīng)能引入一個(gè)5’末端修飾性基團(tuán)，如磷酸酯基或其他5’修飾性基團(tuán)，反應(yīng)方法例如Beaucage and lyer，四面體，49:1925-63(1993)所述。
本發(fā)明通過下列實(shí)施例進(jìn)行舉例說明。
在實(shí)施例化合物及其前體的結(jié)構(gòu)式中，Et為乙基，Me為甲基，T為l-胸腺嘧啶基，t-Bu為叔丁基，Ph為苯基，DMTr為二甲氧基三苯甲基。
如下制備實(shí)施例中所用的化合物及其前體化合物A
這是WO 96/08503的化合物87，按照WO 96/08503的實(shí)施例84所述制得。
化合物B
向化合物A(0.85g,1.22mmol)的無水甲醇(10ml)溶液中加入甲氧基鈉(1.5ml 4.4N的甲醇溶液)。在室溫下攪拌16小時(shí)后，濃縮并用閃蒸硅膠柱色譜法精制(梯度洗脫-氯仿、甲醇、三乙胺100∶20∶1-100∶35∶1)，然后使產(chǎn)物的含水0.5％三乙胺溶液通過Dowex 50W-X2離子交換柱(三乙胺型)進(jìn)行進(jìn)一步精制，濃縮后得到化合物B。
31P nmr1H去耦(CD3OD,162MHz)δ23.7ppm化合物C
這是WO 96/08503的化合物84，按照WO 96/08503的實(shí)施例81所述制得。
化合物D
在氬氣、室溫下，向化合物B(500mg,0.71mmol)與二環(huán)己基碳二亞胺(189mg,0.92mmol)的無水THF(5.4ml)溶液中加入3-羥基丙腈(58μl,0.85mmol)。所得溶液在55℃下加熱2小時(shí)。冷卻后，將混合物過濾，用乙酸乙酯(20ml)稀釋，并用水與鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮。將所得產(chǎn)物溶于二氯甲烷(5ml)，過濾并濃縮，根據(jù)需要重復(fù)該步驟以除去二環(huán)己基脲，得到化合物D，分離為關(guān)于磷的非對(duì)映異構(gòu)體混合物。
可供選擇的方法在氬氣下，向化合物B(12.3g,17.4mmol)與二環(huán)己基碳二亞胺(3.94g,19.1mmol)的無水THF(120ml)溶液中加入3-羥基丙腈(1.42ml,20.8mmol)，所得混合物在60℃下加熱4小時(shí)。濃縮至大約一半體積后，用等體積的乙酸乙酯稀釋，過濾除去所得沉淀。濾液用乙酸乙酯洗滌后，有機(jī)相約為200ml，用水(4×80ml)與飽和鹽水(6×80ml)洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥并濃縮。將所得固體再次溶于乙腈(200ml)，用己烷(6×50ml)萃取。然后將乙腈相濃縮并在高真空下干燥，得到化合物D。
實(shí)測(cè)C 62.2％；H 5.9％；N 6.5％C35H38N3O8P·H2O計(jì)算值C 62.05％；H 5.95％；N 6.2％31P nmr1H去耦(162MHz,CDCl3)δ37.5,37.3ppm化合物E
這是WO 96/08503的化合物100，按照WO 96/08503的實(shí)施例98所述制得。
化合物F
在氬氣下，向化合物E(0.47g,0.60mmol)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(0.148g,0.72mmol)和鹽酸三乙胺(0.24g,1.8mmol)的無水氯仿(3ml)溶液中加入3-羥基丙腈(81μl,1.2mmol)。所得溶液在60℃下加熱四小時(shí)。然后將混合物在真空下濃縮，溶于乙酸乙酯(50ml)并過濾。所得澄清溶液用水(3×20ml)和飽和鹽水(8×20ml)萃取。經(jīng)硫酸鈉干燥后，過濾并在減壓下濃縮，得到含有DCC的粗產(chǎn)物。將該粗產(chǎn)物溶于乙腈，并反復(fù)用己烷萃取，可除去DCC。
實(shí)測(cè)C 63.35％；H 6.50％；N 8.80％C40H46N5O7P·H2O計(jì)算值C 63.40％；H 6.40％；N 9.25％31P nmr1H去耦(162MHz,CDCl3)δ38.1,37.4ppm化合物G
在氬氣、5℃下，向化合物B(1.0g,1.41mmol)的二氯甲烷(15ml)溶液中加入三乙胺(98μl,0.71mmol)，然后滴加氯甲酸甲酯(142μl,1.84mmol)。5分鐘后，使溶液溫度升至室溫，攪拌45分鐘?；旌衔镉枚燃淄橄♂?，用水洗滌，干燥(硫酸鈉)并濃縮。閃蒸硅膠柱色譜法精制(洗脫液乙酸乙酯∶甲醇10∶1)，得到化合物G，為一關(guān)于磷的非對(duì)映體混合物。
31P nmr1H去耦(CDCl3,162MHz)δ37.3,37.0ppm.1H nmr(CDCl3,500MHz)δ8.10(1H,brs,NH),7.55(1H,s,H6),7.35(2H,d,ArH),7.25(6H,m,ArH),7.15(1H,m,ArH),7.00(1H,d,PH,J530Hz),6.80(4H,d,ArH),3.75(1H,m,H4’),3.70(6H,s,ArOCH3),3.55(1H,dd,H5’),3.25(1H,dd,H5’),2.70(1H,m,H3’),2.45(1H,m,H2’),2.20(1H,m,H2’),1.75(1H,m,H6’),1.60(1H,m,H6’),1.45(3H,brs,TCH3)ppm.
化合物H
通過與無水吡啶進(jìn)行共蒸發(fā)(4×50ml)，小心地將三唑(20.7g,0.3mol)干燥，然后在氬氣下溶于吡啶(80ml)并冷卻至0℃。加入三乙胺(41.8ml,0.3mol)，在加入磷酰氯(6.87ml,75mmol)的過程中攪拌混合物。所得溶液在0℃下攪拌15分鐘。滴加如WO 96/08503實(shí)施例80所述制備的WO 96/08503化合物83(20.6g,30mmol)經(jīng)小心干燥(與3×50ml吡啶共蒸發(fā))后的吡啶(50ml)溶液。使所得深色溶液溫度升至室溫。18小時(shí)后，將混合物濃縮并溶于THF(300ml)。加入濃氨(90ml)，混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。濃縮并用閃蒸硅膠柱色譜法精制(乙酸乙酯加甲醇梯度洗脫10％-25％)，得到化合物H，為一關(guān)于磷的非對(duì)映異構(gòu)體混合物。
31P nmr1H去耦(CD3OD,162MHz)δ50.0,49.5ppm
化合物J
在氬氣下，向化合物H(7.87g,11.5mmol)的無水THF(110ml)溶液中加入三乙胺(6.4ml,45.9mmol)，并在加入苯甲酰氯(2.00ml,17.21mmol)的過程中將所得溶液冷卻至-70℃。然后使溶液溫度升至室溫，并攪拌過夜。將所得混合物部分濃縮，溶于乙酸乙酯，并用水洗滌兩次，然后用鹽水洗滌一次。溶液經(jīng)硫酸鈉干燥，濃縮并用閃蒸硅膠柱色譜法精制(己烷∶乙酸乙酯1∶5-純乙酸乙酯梯度洗脫)，得到化合物J，為一關(guān)于磷的兩種非對(duì)映異構(gòu)體混合物。
31P nmr1H去耦(CDCl3,162MHz)δ47.0,46.8ppm實(shí)測(cè)C 61.85％；H 7.25％；N 5.10％C42H56O8N3PSi.3/2H2O計(jì)算值C 61.75％；H 7.30％；N 5.15％化合物K
向化合物J(14.5g,18.34mmol)的無水THF(160ml)溶液中緩慢加入氟化四丁銨的THF溶液(20.2ml,20.2mmol)。所得溶液在室溫下攪拌6小時(shí)，蒸發(fā)得到一黃色油狀物，然后用閃蒸硅膠柱色譜法精制(乙酸乙酯-乙酸乙酯∶乙醇7∶1梯度洗脫)，得到化合物K，為一關(guān)于磷的兩種非對(duì)映異構(gòu)體混合物。
31P nmr1H去耦(CDCl3,162MHz)δ48.9,48.8ppm實(shí)測(cè)C 55.65％；H 7.00％；N 7.35％C26H38O8N3P·1/2H2O計(jì)算值C 55.70％；H 7.00％；N 7.50％化合物L(fēng)
從無水甲苯(3×20ml)中通過共蒸發(fā)，小心地將化合物K(2.48g,4.50mmol)干燥。在氬氣、室溫下，加入二氯甲烷(45ml)，再加入乙醇(2.62ml,45mmol)。在加入三甲基甲硅烷基氯(5.69ml,45.0mmol)的過程中將所得溶液攪拌并冷卻至-15℃。將所得化合物完全脫去氬氣，并緩慢升至室溫。在室溫下攪拌6小時(shí)后，混合物用二氯甲烷稀釋，用碳酸氫鈉溶液洗滌兩次，經(jīng)硫酸鈉干燥并濃縮，得到化合物L(fēng)，為一關(guān)于磷的兩種非對(duì)映異構(gòu)體混合物。
31P nmr1H去耦(CDCl3,162MHz)δ35.5,34.2ppm實(shí)測(cè)C 55.5％；H 6.10％；N 9.70％C20H26N3O6P計(jì)算值C 55.15％；H 6.00％；N 9.65％
化合物M
通過與無水吡啶共蒸發(fā)(6×50ml)，小心地將化合物L(fēng)(4.79g,11.0mmol)干燥，然后在氬氣、室溫下溶于吡啶(80ml)，再加入三乙胺(3.1ml,22mmol)，然后加入二甲氧基三苯甲基氯(4.10g,12.1mmol)。在室溫下16小時(shí)后，將混合物濃縮并在-20℃下貯藏過夜。將所得固體溶于THF(50ml)、三乙胺(15ml)和水(10ml)中，并在室溫下攪拌7小時(shí)。將所得混合物濃縮并用閃蒸硅膠柱色譜法精制(乙酸乙酯、三乙胺50∶1-乙酸乙酯、甲醇、三乙胺55∶45∶2梯度洗脫)，得到化合物M。
31P nmr1H去耦(CDCl3,202MHz)δ22.4ppm實(shí)測(cè)C 64.5％；H 6.65％；N 6.4％C45H55N4O8P·3/2H2O計(jì)算值C 64.5％；H 6.95％；N 6.7％化合物N
按照化合物D所述的可供選擇的方法制備化合物N，不過用化合物M代替化合物B作為原料，并省略乙腈-己烷分配步驟。31P nmr1H去耦(CDCl3,162MHz)δ37.2,36.8ppmMS(FAB)M/Z 763(MH+)實(shí)施例1
向小心干燥后的化合物C(40mg,70μmol)的含有吡啶(80μl,1mmol)的氘代氯仿(0.5ml)溶液中加入二氯三苯基正膦(113mg,350μmol)。振搖所得混合物以溶解正膦，然后保持在環(huán)境溫度下。用31P nmr監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)程。產(chǎn)物即化合物1在201ppm下共振。16小時(shí)后，另加入二氯三苯基正膦(45mg,140μmol)。再過24小時(shí)后，31P nmr顯示反應(yīng)已完成了95％。在-30℃下，向粗反應(yīng)混合物中分次加入二異丙胺(150μl,1.07mmol)，每次30μl。使所得混合物溫度升至室溫，然后用二氯甲烷(20ml)稀釋，用去離子水(2×10ml)洗滌兩次，干燥(硫酸鈉)并濃縮。用閃蒸硅膠柱色譜法精制(4∶1-2∶1己烷-乙酸乙酯梯度洗脫)，得到化合物2，為一兩種非對(duì)映異構(gòu)體混合物。
31P nmr1H去耦(CDCl3,162MHz)δ123.0,122.3實(shí)施例2
使用實(shí)施例1的方法，先將化合物D(30mg,44μmol)轉(zhuǎn)化為化合物3，然后用吡咯烷(56μl,0.67mmol)代替實(shí)施例1所用的二異丙胺，將其轉(zhuǎn)化為化合物4。
實(shí)施例3除了在合成過程的適當(dāng)步驟中用化合物4代替常用的3’-亞磷酰胺取代的核苷以外，按照如《寡核苷酸與類似物一種實(shí)用的方法》(F.Eckstein編著，IRL出版社，1991)所述的標(biāo)準(zhǔn)固相亞磷酰胺寡核苷酸合成法，制備具有5’-TTT tTC TCT CTC TCT-3’序列(其中t代表一個(gè)來自化合物4的核苷單元)的寡核苷酸1，以生成其中Z為式Ⅲ基團(tuán)(其中Nuc為核苷酸TC TCT CTC TCT殘基)的式Ⅰ化合物，然后在標(biāo)準(zhǔn)氧化步驟中將其氧化為其中X為氧的式Ⅷ寡核苷酸，該寡核苷酸進(jìn)一步被偶合得到寡核苷酸1。
實(shí)施例4
在氬氣、5℃下，向攪拌的雙(三氯甲基)碳酸酯(1.01g,3.40mmol)的無水二氯甲烷(10ml)溶液中加入三苯膦(2.68g,10.21mmol)的無水二氯甲烷(8ml+7ml洗液)溶液。立即將混合物溫度在5分鐘內(nèi)升至室溫，然后加入吡啶(1.24ml)，混合物充分混合并再次冷卻至5℃。向所得淡棕色溶液中加入化合物D(3.45g,5.11mmol)的含有吡啶(1.24ml)的無水二氯甲烷(10ml+5ml洗液)溶液。加完溶液后，使溶液溫度升至室溫。在室溫下攪拌1小時(shí)后，混合物含有化合物3(31P nmrδ206.7ppm)。將混合物冷卻至-30℃，歷時(shí)5分鐘加入二并丙胺(3.57ml,27mmol)。歷時(shí)10分鐘將混合物的溫度升至室溫，然后在真空下濃縮至一半體積。將該溶液立即轉(zhuǎn)移至閃蒸硅膠色譜柱(300g，硅膠)頂部，用己烷∶四氫呋喃∶三乙胺25∶25∶1洗脫。得到一些純產(chǎn)物部分。不純的部分進(jìn)一步進(jìn)行閃蒸硅膠色譜，用己烷∶四氫呋喃∶二氯甲烷∶三乙胺25∶25∶10∶1洗脫。匯集所有的產(chǎn)物部分，濃縮得到化合物5，這是一種白色泡沫，為關(guān)于磷的非對(duì)映異構(gòu)體混合物。
實(shí)測(cè)C 66.2％；H 7.25％；N 7.5％C41H51O7N4P計(jì)算值C 66.3％；H 6.9％；N 7.55％31P nmr1H去耦(162MHz,CDCl3)δ128.3,127.8ppmM/Z(ES+)743(M+H)+(ES-)741(M-H)-實(shí)施例5
按照實(shí)施例4的方法制備化合物6和7，但是用化合物F代替化合物D。用相同摩爾數(shù)、但是一半濃度的試劑進(jìn)行該反應(yīng)。在制備的最初階段，反應(yīng)進(jìn)行2小時(shí)而不是1小時(shí)，得到化合物6(31P nmrδ205.7ppm)。最終步驟涉及用水洗滌粗產(chǎn)物兩次，濃縮并用閃蒸硅膠柱色譜法精制(洗脫液為乙酸乙酯/甲醇10∶1+2％Et3N)，得到化合物7，為兩種對(duì)映異構(gòu)體的混合物。
實(shí)測(cè)C 63.85％；H 7.05％；N 9.55％C46H59N6O6P·2H2O計(jì)算值C 64.25％；H 7.35％；N 9.80％31P nmr1H去耦(CDCl3,162MHz)δ128.6,128.1ppmM/Z(ES+)823(MH+)實(shí)施例6
按照實(shí)施例4的方法制備化合物8和9，但是用化合物G代替化合物D。反應(yīng)的最初階段得到化合物8(31P nmrδ207.7ppm)。反復(fù)用閃蒸硅膠柱色譜法進(jìn)行最終的精制，其中先用己烷/乙酸乙酯2∶1+2％Et3N洗脫，隨后用己烷/二乙醚1∶3+2％Et3N洗脫，得到化合物9，其為兩種對(duì)映異構(gòu)體的混合物。
31P nmr1H去耦(CDCl3,202MHz)δ128.8,127.8ppmMZ(ES+)(704,705,706,MH+)(ES-)(702,703,704,M-H-)實(shí)施例7
按照實(shí)施例6的方法制備化合物10，但是用二甲胺代替實(shí)施例6所用的二異丙胺，使中間體化合物8與2.0摩爾二甲胺的THF溶液反應(yīng)。最終用閃蒸硅膠柱色譜法精制(洗脫液為乙酸乙酯/己烷3∶1+2％Et3N)，得到化合物10，為兩種非對(duì)映異構(gòu)體混合物。
31P nmr1H去耦(CDCl3,162MHz)δ144.3,144.2ppm實(shí)施例8
按照實(shí)施例10的方法制備化合物11和12，但是用化合物N代替化合物D。在這種情況下，終產(chǎn)物化合物12用閃蒸硅膠柱色譜法精制(己烷-THF-三乙胺50∶50∶1)。
31P nmr1H去耦(CDCl3,162MHz)δ128.1,127.6ppmMZ(ES+)846,847,848,(MH)+(ES-)844,845,846,(M-H)-實(shí)施例9-15按照標(biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)，使用亞磷酰胺策略，制備下列被修飾的寡核苷酸。所有偶合反應(yīng)為雙重偶合，也就是說使結(jié)合于載體上的寡核苷酸暴露于亞磷酰胺溶液或修飾性溶液若干秒鐘后，將該溶液用一批新制得的單體溶液置換。在與亞磷酰胺偶合的情況下，在氧化或硫雜化(硫化)前洗滌載體。在與其中Z為式Ⅱ基團(tuán)的式Ⅰ的被修飾單體(已知也是亞磷酰胺)偶合的情況下，載體不經(jīng)洗滌階段立即暴露于氧化溶液或硫雜化溶液。該方法最大程度地減少結(jié)合于載體上的PⅢ中間體可能發(fā)生的水解反應(yīng)。
在如下給出的被修飾的寡核苷酸的核苷酸序列中，T、C、A和G具有它們通常的意義，且來自常見的亞磷酰胺單體，t表示來自化合物5的核苷酸單元，c表示來自化合物7的核苷酸單元，化合物5與化合物7被用于合成法的適當(dāng)步驟中。硫化了的核苷酸間鍵由s表示；所有其他的核苷酸間鍵均被氧化。
實(shí)施例95′TTTTtCTCTCTCTCT 3′TOF MS實(shí)測(cè)=計(jì)算值=4424.3實(shí)施例105′tttttCTCTCTCTCT 3′TOF MS實(shí)測(cè)=4415.3計(jì)算值=4415.9實(shí)施例115′GCGttttttttttGCG 3′TOF MS實(shí)測(cè)=4859.8計(jì)算值=4865實(shí)施例125′TTTTTTTTTTTTTTTtttT 3′TOF MS實(shí)測(cè)=5709.3計(jì)算值=5711.7
實(shí)施例135′ttctcGsCsCsCsGsCsTsCsCstcctcC 3′TOF MS實(shí)測(cè)=6086.6計(jì)算值=7001.5實(shí)施例145′tstscstscsGsCsCsCsGsCsTsCsCstscscstscsC 3′TOF MS實(shí)測(cè)=6214.5計(jì)算值=6246.1實(shí)施例155′tstscstscsGsCsTsGsGsTsGsAsGstststscsA 3′TOF MS實(shí)測(cè)=6092.9計(jì)算值=6114
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人(A)姓名Novartis AG(B)街道Schwarzwaldallee 215(C)城市巴塞爾(E)國(guó)家瑞士(F)郵編(ZIP)4058(G)電話+41 61 324 1111(H)電傳+41 61 322 7532(ⅱ)發(fā)明題目用于寡核苷酸合成的中間體(ⅲ)序列數(shù)6(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC可兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:TTTTTCTCTC TCTCT 15(2)SEQ ID NO:2的信息
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:TCTCTCTCTC T11(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:GCGTTTTTTT TTTGCG16(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:TTTTTTTTTT TTTTTTTTT 19(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:TTCTCGCCCG CTCCTCCTCC20(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:TTCTCGCTGG TGAGTTTCA 19
權(quán)利要求
1．一種下式化合物
其中B1是一種核苷堿的殘基，R1是氫或一種羥基保護(hù)基團(tuán)，R2是氫、羥基或一種2’核苷修飾性原子或基團(tuán)，R3是一個(gè)未發(fā)生取代或已發(fā)生取代的C1至C10烷基、C2至C10鏈烯基、C4至C10環(huán)烷基烷基、C6至C10芳基或C7至C13芳烷基，Z是鹵素或一個(gè)下式基團(tuán)
其中R4與R5均獨(dú)立為一個(gè)未發(fā)生取代或已發(fā)生取代的C1至C10烷基、C2至C10鏈烯基、C4至C10環(huán)烷基烷基、C6至C10芳基或C7至C13芳烷基，或者R4為所述基團(tuán)且R5為氫，或者R4與R5以及它們所連接的氮原子共同表示一個(gè)五元至十三元雜環(huán)；或者Z是一個(gè)下式基團(tuán)Nuc-O-Ⅲ其中Nuc是一種天然或合成的核苷或寡核苷酸在除去通過5’亞甲基與所示氧原子連接的5’羥基后的殘基。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中已發(fā)生取代的基團(tuán)是被鹵素、羥基、C1-C4烷氧基、氰基、硝基或三(C1-C15烴基)甲硅烷基取代的。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的化合物，其中R1為氫、一個(gè)C7至C40芳脂族基團(tuán)或一個(gè)三(C1-C15烴基)甲硅烷基。
4．根據(jù)權(quán)利要求3的化合物，其中R1為氫、一個(gè)未發(fā)生取代或已發(fā)生取代的三苯甲基或C1-C6烷基二(C6-C8芳基)甲硅烷基。
5．根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中R1為二甲氧基三苯甲基或叔丁基二苯基甲硅烷基。
6．根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的化合物，其中R2為氫，鹵素，羥基或一個(gè)式-OR6或-OCOR6基團(tuán)，其中R6是一個(gè)未發(fā)生取代或已發(fā)生取代的C1至C10烷基、C2至C10鏈烯基、C3至C8環(huán)烷基、C4至C10環(huán)烷基烷基、C6至C10芳基或C7至C25芳烷基或一個(gè)三(C1-C15烴基)甲硅烷基。
7．根據(jù)權(quán)利要求6的化合物，其中R2為氫，羥基，氟，一個(gè)式-OR6基團(tuán)，其中R6是一個(gè)C1至C4烷基、C2至C4鏈烯基、C7至C13芳烷基，或者一個(gè)式-(R7-O-)N-R8基團(tuán)，其中R7為C1至C4亞烷基、R8為C1至C4烷基、n為1至8；或者R2為一個(gè)式-OCOR6基團(tuán)，其中R6是C1至C4烷基或C6至C8芳基。
8．根據(jù)權(quán)利要求6的化合物，其中R2為氫、羥基、氟、甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、芐氧基、甲氧基乙氧基、-O-(CH2-CH2-O-)3-CH3、乙酸基或苯甲酸基。
9．根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的化合物，其中R3是一個(gè)未發(fā)生取代或已發(fā)生取代的C1至C4烷基、C3至C5鏈烯基、C6至C8環(huán)烷基烷基或C7至C9芳烷基。
10．根據(jù)權(quán)利要求9的化合物，其中R3為甲基、乙基、2-氰乙基、2,2,2-三氯乙基、烯丙基、芐基或2-(三甲基甲硅烷基)乙基。
11．根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的化合物，其中Z為一個(gè)式Ⅱ基團(tuán)，其中R4與R5獨(dú)立為一個(gè)未發(fā)生取代或已發(fā)生取代的C1至C4烷基、C3至C5鏈烯基、C6至C8環(huán)烷基烷基或C7至C9芳烷基，或者R4為C1至C4烷基或C7至C9芳烷基，且R5為氫，或者R4與R5以及它們所連接的氮原子共同表示一個(gè)五元或六元雜環(huán)，該環(huán)中具有一或兩個(gè)雜原子。
12．根據(jù)權(quán)利要求11的化合物，其中R4與R5獨(dú)立為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、烯丙基或芐基，或者R4與R5以及它們所連接的氮原子共同表示一個(gè)吡咯烷、哌啶或嗎啉環(huán)。
13．根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的化合物，其中Z為式Ⅲ基團(tuán)，其中Nuc是附著在一種固相載體上。
14．根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中Z為氯或溴。
15．根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的化合物，其為下式化合物
其中B1、R1、R2、R3和Z如任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所定義。
16．根據(jù)權(quán)利要求1或15的化合物，其中B1為胸腺嘧啶基、5-甲基胞嘧啶基、或者是在一個(gè)氮原子上被一種保護(hù)基團(tuán)取代的胸腺嘧啶基或5-甲基胞嘧啶基；R1為二甲氧基三苯甲基或叔丁基二苯基甲硅烷基；R2為氫；R3為甲基、乙基或2-氰乙基；Z為氯，或者式Ⅱ基團(tuán)，其中R4與R5均為甲基或異丙基，或者Z為式Ⅲ基團(tuán)。
17．一種制備權(quán)利要求1的化合物的方法，其中Z為式Ⅱ基團(tuán)，該方法包括使其中Z為鹵素的式Ⅰ化合物與下式化合物反應(yīng)，
其中R4與R5如權(quán)利要求1所定義。
18．根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中該反應(yīng)是在-78℃至50℃的溫度下、存在一種叔氮堿的情況下，在一種有機(jī)溶劑中進(jìn)行的。
19．一種制備其中Z為鹵素的式Ⅰ化合物的方法，該方法包括用一種非氧化性鹵化劑對(duì)下式化合物進(jìn)行非氧化性的鹵化反應(yīng)，
其中B1、R1、R2和R3如權(quán)利要求1所定義。
20．根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中該非氧化性鹵化劑是一種鹵代正膦。
21．根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中該鹵化反應(yīng)是在-20℃至60℃的溫度下、在一種有機(jī)溶劑中、存在一種堿的情況下進(jìn)行的。
22．一種制備權(quán)利要求1的其中Z為式Ⅲ基團(tuán)的化合物的方法，該方法包括使其中R1為羥基保護(hù)基團(tuán)且Z為式Ⅱ基團(tuán)的權(quán)利要求1的化合物與一種天然或合成的具有一個(gè)游離5’羥基的核苷或寡核苷酸反應(yīng)。
23．一種制備下式寡核苷酸的方法，
其中B1、R1、R3和Nuc如權(quán)利要求1所定義，X為氧或硫，該方法包括使其中Z為式Ⅲ基團(tuán)的權(quán)利要求1的化合物進(jìn)行氧化反應(yīng)，得到其中X為氧的式Ⅷ寡核苷酸，或者進(jìn)行硫化反應(yīng)，得到其中X為硫的式Ⅷ寡核苷酸。
24．一種制備寡核苷酸的方法，該方法包括使具有一個(gè)被保護(hù)的5’羥基和一個(gè)3’位下式基團(tuán)的核苷與一種具有一個(gè)游離5’羥基的天然或合成的核苷或寡核苷酸進(jìn)行核苷偶合反應(yīng)
其中R3、R4和R5如權(quán)利要求1所定義，反應(yīng)生成一種具有一個(gè)下式核苷間鍵的寡核苷酸前體
其中R3如權(quán)利要求1所定義，再使該前體轉(zhuǎn)化為一種具有一個(gè)下式核苷間鍵的寡核苷酸
其中R3如前文定義，X為氧或硫，該轉(zhuǎn)化作用是通過氧化該前體得到具有式Ⅺ核苷間鍵、其中X為氧的寡核苷酸或硫化該前體得到具有式Ⅺ核苷間鍵、其中X為硫的寡核苷酸而實(shí)現(xiàn)的。
25．根據(jù)權(quán)利要求1的化合物在寡核苷酸合成中的用途。
26．根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其基本上如任一個(gè)實(shí)施例所述。
27．根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其基本上如實(shí)施例1、2或4-8中任一個(gè)所述。
28．根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其基本上如實(shí)施例1、2、4、5、6或8中任一個(gè)所述。
29．一種根據(jù)權(quán)利要求22、23或24的方法，其基本上如實(shí)施例3與9-15中任一個(gè)所述。
全文摘要
一種式Ⅰ化合物,其中B
文檔編號(hào)C07H19/16GK1221423SQ9719545
公開日1999年6月30日 申請(qǐng)日期1997年6月3日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月13日
發(fā)明者S·P·科林格伍德, H·E·莫瑟, K-H·阿爾特曼, M·E·道格拉斯 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司