專利名稱：寡核苷酸的溶液相合成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供基于H-膦酸酯偶聯(lián)和現(xiàn)場硫轉(zhuǎn)移、于低溫下進行的在溶液中合成寡核苷酸和硫代磷酸寡核苷酸的方法。本發(fā)明還提供分步合成寡核苷酸和硫代磷酸寡核苷酸的方法(其中一次加入一個核苷殘基)和區(qū)段合成(block synthesis)寡核苷酸和硫代磷酸寡核苷酸的方法(其中一次加入兩個或兩個以上的核苷酸殘基)。
在過去的約15年中，在開發(fā)合成寡脫氧核糖核苷酸(DNA序列)和寡核糖核苷酸(RNA序列)及其類似物方面已經(jīng)取得了許多進展‘Methods in Molecular Biology，第20卷，Protocol for Oligonucleotidesand Analogs’，Agrawal，S.編輯，Humana Press，Totowa，1993。其中許多工作在微摩爾或甚至更小的規(guī)模下進行，已經(jīng)證明涉及單體亞磷酰胺結(jié)構(gòu)單元的自動固相合成(Beaucage，S.L.；Caruthers，M.H.TetrahedronLett.，1981，22，1859-1862)是最便利的方法。事實上，現(xiàn)在可以用市售的合成儀常規(guī)制備高分子量DNA序列和相對高分子量的RNA序列。這些合成的寡核苷酸已經(jīng)滿足了生物學或生物技術(shù)方面的許多決定性的需要。
根據(jù)Zamecnik和Stephenson的開創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)，合成寡核苷酸可以選擇性地抑制勞斯肉瘤病毒中的基因表達(Zamecnik，P.；Stephenson，M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1978，75，280-284)，合成寡核苷酸或其類似物完全有可能于化療中獲得應用的想法在高校實驗室和工業(yè)實驗室中都已經(jīng)引起了廣泛注意。例如，在Gura，T.Science，1995，270，575-577的報道中已經(jīng)強調(diào)了寡核苷酸及其硫代磷酸類似物在化療方面的可能用途。所謂的反義和抗原的化療方法(Oligonucleotides，AntisenseInhibitors of Gene Expression，Cohen，J.S.編輯，Macmillan，Basingstoke1989 Moser，H.E.；Dervan，P.B.Science 1987，238，645-649)已經(jīng)深深地影響了對合成寡核苷酸的需求。對于分子生物學目的一般毫克量已經(jīng)足夠，而對于臨床試驗而言，需要量超過100克以上。作為潛在反義藥物的幾種寡核苷酸類似物現(xiàn)在正在后期的臨床試驗(advancedclinical trials)中。如果(在非常近的將來看來是可能的)比方說這些序列之一被準許用于治療AIDS或一種形式的癌，則會需要公斤或更優(yōu)選數(shù)公斤量的一種或多種特定序列。
在過去數(shù)年中，在擴大比例的寡核苷酸合成方面進行了大量的工作。實際上，所有這項工作均涉及建立越來越大的合成儀和在固相支持體上的相同的亞磷酰胺化學。在于溶液中合成寡核苷酸的磷酸三酯途徑的方法學方面，本申請人不知道有任何最新的改進，于溶液中合成寡核苷酸使得它比固相合成更適于大規(guī)模和甚至中等規(guī)模的合成工作。
固相合成優(yōu)于溶液合成的主要優(yōu)點是(i)快得多，(ii)偶聯(lián)得率一般更高，(iii)易于自動化，和(iv)在序列方面完全靈活。因此，如果比方說組合目的需要相對少量的種類繁多的寡核苷酸序列，則固相合成特別有用。然而，如果已經(jīng)鑒定出特定的中等大小的序列，并作為藥物被批準，則需要公斤量，速度和靈活性變得相對不重要，而在溶液中合成可能是非常有利的。溶液合成也具有優(yōu)于固相合成的優(yōu)點，在于區(qū)段偶聯(lián)(即一次加入兩個或兩個以上的核苷酸殘基)更可行，規(guī)模擴大至任何水平都不大可能出現(xiàn)問題。增大反應容器的大小比制造越來越大的自動合成儀容易得多，并且肯定更便宜。
過去，在溶液中的寡核苷酸合成主要通過在20世紀70年代開發(fā)的常規(guī)的磷酸三酯途徑進行(Reese，C.B.，Tetrahedron 1978，34，3143-3179；Kaplan，B.E.；Itakura，K.‘Synthesis and Applications of DNA andRNA’，Narang，S.A.編輯，Academic Press，Orlando，1987，第9-45頁)。該方法也可以用于固相合成，但使用亞磷酰胺單體時偶聯(lián)反應略快，且偶聯(lián)得率略高。這就是自動固相合成主要基于使用亞磷酰胺結(jié)構(gòu)單元的原因；它也許也是需要相對大量合成寡核苷酸的工作者決定試圖擴大基于亞磷酰胺的固相合成規(guī)模的原因。
已經(jīng)證明，磷酸三酯(Reese，Tetrahedron，1978)、亞磷酰胺(Beaucage，S.L.Methods in Molecular Biology，第20卷，Agrawal，S.編輯，Humana Press，Totowa，1993，第33-61頁)和H-膦酸酯(Froehler，B.C.Methods in Molecular Biology，第20卷，Agrawal，S.編輯，Humana Press，Totowa，1993，第63-80頁)這三種主要方法對于化學合成寡核苷酸是有效的。盡管磷酸三酯法已經(jīng)最廣泛地用于溶液合成，但在固相合成中已經(jīng)幾乎僅使用亞磷酰胺和H-膦酸酯法。
兩種不同的合成策略已經(jīng)應用于溶液中的磷酸三酯法。
也許在溶液中合成寡脫氧核糖核苷酸的最廣泛使用的策略，涉及受保護核苷或寡核苷酸3’-(2-氯苯基)磷酸酯(Chattopadhyaya，J.B.；Reese，C.B.Nucleic Acids Res.，1980，8，2039-2054)和具有游離5’羥基功能的受保護核苷或寡核苷酸之間的偶聯(lián)反應，產(chǎn)生磷酸三酯。需要偶聯(lián)劑，諸如1-(-2-磺?；?-3-硝基-1，2，4-1H-三唑(MSNT)(Reese，C.B.；Titmas，R.C.；Yau，L.Trtrahedron Lett.，1978，2727-2730)。該策略也已經(jīng)用于合成硫代磷酸酯類似物。然后以相同方式，在受保護的核苷或寡核苷酸3’-S-(2-氰基乙基或例如4-硝基芐基)硫代磷酸酯(Liu，X.；Reese，C.B.J.Chem.Soc.，Perkin Trans.l 1995，1685-1695)和具有游離5’-羥基功能的受保護核苷或寡核苷酸之間進行偶聯(lián)。該常規(guī)磷酸三酯法的主要缺點是發(fā)生某些伴隨的第二組分5’-磺化以及偶聯(lián)反應一般進行得相對慢。所述磺化副反應導致得率較低和阻礙所需產(chǎn)物的純化。
在溶液中合成寡脫氧核糖核苷酸的第二種策略，涉及使用由衍生自二氯化磷酸芳基(通常為2-氯苯基)酯的雙官能試劑和兩個分子當量的諸如1-羥基苯并三唑的添加劑(van der Marel等，Tetrahedron Lett.，1981，22，3887-3890)。在硫代磷酸寡核苷酸的制備中同樣已經(jīng)使用了一種衍生自二氯硫代磷酸(phosphorodichloridothioate)2，5-二氯苯基酯的相關(guān)雙官能試劑(流程1b)(Kemal，O等，J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，1983，591-593)。
第二種策略的主要缺點直接由于涉及雙官能試劑所致。因此，存在形成對稱偶聯(lián)產(chǎn)物的可能性和存在少量水分可能導致偶聯(lián)得率的顯著降低。
本發(fā)明某些方面的一個目的是提供用于在溶液中合成寡核苷酸的一種新偶聯(lián)方法，在許多實施方案中，(a)極其有效，并且不產(chǎn)生副反應，(b)進行得相對快，而(c)同樣適于制備寡核苷酸、其硫代磷酸酯類似物和含磷酸二酯和硫代磷酸二酯核苷酸間鍵合的嵌合寡核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明第一方面，提供制備硫代磷酸三酯的方法，包括在偶聯(lián)劑的存在下H-膦酸酯與醇進行溶液相偶聯(lián)，由此形成H-膦酸二酯，并且所述H-膦酸二酯與硫轉(zhuǎn)移劑現(xiàn)場反應，產(chǎn)生硫代磷酸三酯。
用于本發(fā)明方法的H-膦酸酯最好是受保護的核苷或寡核苷酸H-膦酸酯，優(yōu)選包括5’或3’H-膦酸酯官能，特別優(yōu)選3’H-膦酸酯官能。優(yōu)選的核苷為2’-脫氧核糖核苷和核糖核苷；優(yōu)選的寡核苷酸為寡脫氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸。
當H-膦酸酯結(jié)構(gòu)單元為包含3’H-膦酸酯官能的受保護的脫氧核糖核苷、核糖核苷、寡脫氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸衍生物時，5’羥基官能最好被合適的保護基保護。這類合適的保護基的實例包括酸不穩(wěn)定保護基，特別是三苯甲基和取代的三苯甲基，諸如二甲氧基三苯甲基和9-苯基呫噸-9-基；和堿不穩(wěn)定保護基，諸如FMOC。
當H-膦酸酯結(jié)構(gòu)單元為包含5’H-膦酸酯官能的受保護的脫氧核糖核苷、核糖核苷、寡脫氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸衍生物時，3，羥基官能最好被合適的保護基保護。合適的保護基包括以上公開的用于保護3’H-膦酸酯結(jié)構(gòu)單元的5’羥基官能的那些保護基和?；?，諸如乙酰丙?；腿〈囊阴１；?。
當所述H-膦酸酯為受保護的核糖核苷或受保護的寡核糖核苷酸時，所述2’羥基官能最好被合適保護基保護，所述保護基例如為酸不穩(wěn)定縮醛保護基，特別是1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(Fpmp)；和三烷基甲硅烷基，通常為三(C1-4-烷基)甲硅烷基，諸如叔丁基二甲基甲硅烷基。或者，所述核糖核苷或寡核糖核苷酸可以是2’-O-烷基、2，-O-烷氧基烷基或2’-鏈烯基衍生物，通常為C1-4-烷基、C1-4-烷氧基C1-4-烷基或鏈烯基衍生物，在這些情況下，2’-位不需要進一步保護。
可以用于按照本發(fā)明的方法的其它H-膦酸酯衍生自其它多官能醇，尤其是烷基醇，優(yōu)選二醇或三醇。烷基二醇的實例包括乙-1，2-二醇和低分子量聚(乙二醇)，諸如分子量高至400的那些聚(乙二醇)。烷基三醇的實例包括甘油和丁三醇。通常，僅存在單個H-膦酸酯官能，其余的羥基用合適的保護基保護，所述保護基諸如以上公開的用于保護核糖核苷5’或2’位的那些保護基。
用于本發(fā)明方法的醇通常為包含游離羥基的受保護的核苷或寡核苷酸，所述游離羥基優(yōu)選游離的3’或5’羥基，特別優(yōu)選5’羥基。
當所述醇為受保護的核苷或受保護的寡核苷酸時，優(yōu)選的核苷為脫氧核糖核苷和核糖核苷，優(yōu)選的寡核苷酸為寡脫氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸。
當所述醇為包含游離5’羥基的脫氧核糖核苷、核糖核苷、寡脫氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸衍生物時，所述3’羥基官能最好被合適的保護基保護。這類保護基的實例包括?；?，通常包括多達16個碳原子的酰基，諸如衍生自γ酮酸的那些酰基，諸如乙酰丙酰基和取代的乙酰丙?；?。取代的乙酰丙?；唧w包括5-鹵代-乙酰丙?；?，諸如5，5，5-三氟乙酰丙酰基和苯甲酰基丙?；?。其它這類保護基包括脂肪烷酰基，具體包括直鏈或支鏈C6-16-烷?；?，諸如月桂?；槐郊柞；腿〈谋郊柞；?，諸如烷基(通常為C1-4烷基-)和鹵代(通常為氯代或氟代)、取代的苯甲?；?；和甲硅烷基醚，諸如烷基(通常為C1-4烷基-)和芳基(通常為苯基)甲硅烷基醚，特別是叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基。
當所述醇為受保護的包含游離3’-羥基的脫氧核糖核苷、核糖核苷、寡脫氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸時，所述5’羥基官能最好被合適的保護基保護。合適的保護基為以上公開的用于保護脫氧核糖核苷、核糖核苷、寡脫氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸3’H膦酸酯的5’羥基的那些保護基。
當所述醇為核糖核苷或寡核糖核苷酸時，所述2’羥基官能最好被合適的保護基保護，所述保護基諸如縮醛，特別是1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(Fpmp)；和三烷基甲硅烷基，通常為三(C1-4-烷基)甲硅烷基，諸如叔丁基二甲基甲硅烷基?；蛘?，所述核糖核苷或寡核糖核苷酸可以是2’-O-烷基、2’-O-烷氧基烷基或2’-O-鏈烯基衍生物，通常為C1-4-烷基、C1-4-烷氧基C1-4-烷基或鏈烯基衍生物，在這些情況下，2’-位不需要進一步保護。
可以用于按照本發(fā)明的方法的其它醇為非糖多元醇，尤其是烷基多元醇，優(yōu)選二醇或三醇。烷基二醇的實例包括乙-1，2-二醇和低分子量聚(乙二醇)，諸如分子量高至400的那些聚(乙二醇)。烷基三醇的實例包括甘油和丁三醇。通常，僅存在單個游離羥基，其余的羥基用合適的保護基保護，所述保護基諸如以上公開的用于保護核糖核苷5’或2’位的那些保護基。然而，如果需要在一個以上的羥基上進行相同的偶聯(lián)，則可以存在一個以上的游離羥基。
當所述H-膦酸酯和所述醇均為受保護的核苷或寡核苷酸時，本發(fā)明提供基于H-膦酸酯偶聯(lián)反應的、用于在溶液中分步合成和區(qū)段合成寡脫氧核糖核苷酸、寡核糖核苷酸及其類似物的改進方法。按照本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，具有3’末端H-膦酸酯官能的受保護核苷或寡核苷酸和具有5’末端羥基官能的受保護核苷或寡核苷酸在合適的偶聯(lián)劑存在下偶聯(lián)，形成受保護的二核苷或寡核苷酸H-膦酸酯中間體，其中所述中間體在合適的硫轉(zhuǎn)移劑存在下進行現(xiàn)場硫轉(zhuǎn)移。
除存在羥基保護基外，用于本發(fā)明的核苷/核苷酸中存在的堿基必要時也最好被合適的保護基保護。所用的保護基是本領(lǐng)域已知用于保護這類堿基的保護基。例如A和/或C可以用以下基團保護苯甲?；霰郊柞；ㄈ〈谋郊柞；缤榛?或烷氧基-(通常為C1-4-烷基或C1-4-烷氧基)苯甲?；恍挛祯；?；和脒，特別是二烷基氨基亞甲基，優(yōu)選二(C1-4-烷基)氨基亞甲基，諸如二甲基或二丁基氨基亞甲基。G可以用苯基保護，所述苯基包括取代的苯基，例如2，5-二氯苯基，也可以用異丁?；Ｗo。T和U一般不需要保護，但在某些實施方案中可能最好例如用苯基包括取代的苯基(例如2，4-二甲基苯基)于04保護，或用新戊酰氧基甲基、苯甲酰基、烷基或烷氧基取代的苯甲酰基(諸如C1-4-烷基或C1-4-烷氧基苯甲?；?于N3保護。
當所述醇和/或H-膦酸酯為具有受保護羥基的受保護核苷或寡核苷酸時，這些保護基之一可以在實施第一發(fā)明方法之后去除。通常，被去除的保護基為3’-羥基官能上的保護基。在所述保護基被去除后，可以將由此形成的寡核苷酸轉(zhuǎn)化為H-膦酸酯，然后通過在所需寡核苷酸序列的合成中進一步分步或區(qū)段偶聯(lián)和按照本發(fā)明方法的硫轉(zhuǎn)移而進行。然后所述方法可以分步進行，以從所述核苷酸間鍵合、所述3’和5’羥基和所述堿基上去除所述保護基。可以應用相似的方法，以偶聯(lián)5’H-膦酸酯，其中所去除的保護基為5’羥基官能上的保護基。
在一個具體的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種方法，包括在合適的偶聯(lián)劑存在下，將5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧核糖核苷3’-H-膦酸酯或受保護的寡脫氧核糖核苷酸3’-H-膦酸酯與具有游離5’羥基官能的一種組分偶聯(lián)，隨后在合適的硫轉(zhuǎn)移劑存在下現(xiàn)場轉(zhuǎn)移硫。
在本發(fā)明的方法中，可以使用現(xiàn)有技術(shù)可得到的任何合適的偶聯(lián)劑和硫轉(zhuǎn)移劑。
合適的偶聯(lián)劑的實例包括烷基和芳基?；取㈡溚楹头纪榛酋Ｂ?、氯甲酸烷基和芳基酯、氯亞硫酸烷基和芳基酯以及氯化磷酸烷基和芳基酯。
可以使用的合適的烷基酰基氯的實例包括C2-C7烷?；?，特別是新戊?；取？梢允褂玫姆蓟；鹊膶嵗ㄈ〈臀慈〈谋郊柞；龋T如C1-4烷氧基、鹵代(特別是氟代、氯代和溴代)和C1-4烷基取代的苯甲酰基氯。當被取代時，通常存在1-3個取代基，特別是在烷基和鹵代取代基的情況下。
可以使用的合適的鏈烷磺酰氯的實例包括C2-C7烷磺酰氯?？梢允褂玫姆蓟酋Ｂ鹊膶嵗ㄈ〈臀慈〈谋交酋Ｂ?，諸如C1-4烷氧基、鹵代(特別是氟代、氯代和溴代)和C1-4烷基取代的苯磺?；取．敱蝗〈鷷r，通常存在1-3個取代基，特別是在烷基和鹵代取代基的情況下。
可以使用的合適的氯甲酸烷基酯的實例包括氯甲酸C2-C7烷基酯?？梢允褂玫穆燃姿岱蓟サ膶嵗ㄈ〈臀慈〈谋交燃姿狨?，諸如C1-4烷氧基、鹵代(特別是氟代、氯代和溴代)和C1-4烷基取代的苯基氯甲酸酯。當被取代時，通常存在1-3個取代基，特別是在烷基和鹵代取代基的情況下。
可以使用的合適的氯亞硫酸烷基酯的實例包括氯亞硫酸C2-C7烷基酯?？梢允褂玫穆葋喠蛩岱蓟サ膶嵗ㄈ〈臀慈〈谋交葋喠蛩狨ィT如C1-4烷氧基、鹵代(特別是氟代、氯代和溴代)和C1-4烷基取代的苯基氯亞硫酸酯。當被取代時，通常存在1-3個取代基，特別是在烷基和鹵代取代基的情況下。
可以使用的合適的氯化磷酸烷基酯的實例包括氯化磷酸二(C1-C6烷基)酯?？梢允褂玫穆然姿岱蓟サ膶嵗ㄈ〈臀慈〈亩交然姿狨?，諸如C1-4烷氧基、鹵代(特別是氟代、氯代和溴代)和C1-4烷基取代的二苯基氯化磷酸酯。當被取代時，通常存在1-3個取代基，特別是在烷基和鹵代取代基的情況下。
可以使用的其它偶聯(lián)劑為Wada等在J.A.C.S.1997，119，第12710-12721頁(該文獻通過引用結(jié)合到本文中)中公開的氯代、溴代和(苯并三唑-1-基氧基)-鏻和碳鎓化合物。
優(yōu)選的偶聯(lián)劑為氯化磷酸二芳基酯，特別是具有式(ArO)2POCl的那些偶聯(lián)劑，其中Ar最好為苯基、2-氯苯基、2，4，6-三氯苯基或2，4，6-三溴苯基。
所述硫轉(zhuǎn)移劑的性質(zhì)取決于需要寡核苷酸、硫代磷酸酯類似物還是需要混合寡核苷酸/硫代磷酸寡核苷酸。用于本發(fā)明方法的硫轉(zhuǎn)移劑通常具有以下化學通式L-------S-------A其中L代表離去基團，而A代表芳基、甲基或取代的烷基或鏈烯基。通常，選擇所述離去基團，以便包含一個氮-硫鍵。合適的離去基團的實例包括嗎啉，諸如嗎啉-3，5-二酮；二酰亞胺，諸如苯鄰二甲酰亞胺、琥珀酰亞胺和馬來酰亞胺；吲唑，特別是具有吸電子取代基的吲唑，諸如4-硝基吲唑；和三唑。
當在終產(chǎn)物所述硫轉(zhuǎn)移劑中需要標準的磷酸二酯鍵時，部分A代表芳基，諸如苯基或萘基。合適芳基的實例包括取代的和未取代的苯基，特別是鹵代苯基和烷基苯基，尤其是4-鹵代苯基和4-烷基苯基，通常為4-(C1-4烷基)苯基，最優(yōu)選為4-氯苯基和對甲苯基。一類合適的標準磷酸二酯定向硫轉(zhuǎn)移劑的實例為N-(芳基硫烷基)苯鄰二甲酰亞胺(也可以使用琥珀酰亞胺或其它二酰亞胺)。
當在終產(chǎn)物中需要硫代磷酸二酯鍵時，部分A代表甲基、取代的烷基或鏈烯基。合適的取代烷基的實例包括取代的甲基，特別是芐基和取代的芐基，諸如烷基-(通常為C1-4烷基-)和鹵代-(通常為氯代-)取代的芐基；和取代的乙基，尤其是于2位用吸電子取代基(諸如2-(4-硝基苯基)乙基和2-氰基乙基)取代的乙基。合適的鏈烯基的實例為烯丙基和巴豆基。一類合適的硫代磷酸酯定向硫轉(zhuǎn)移劑的實例為例如(2-氰基乙基)硫烷基衍生物，諸如4-[(2-氰基乙基)-硫烷基]嗎啉-3，5-二酮或相應的試劑，諸如3-(鄰苯二甲酰亞氨基硫烷基)丙腈。
進行偶聯(lián)反應和硫轉(zhuǎn)移的合適溫度范圍為約-55℃至室溫(范圍通常為10-30℃，例如約20℃)，最好為-40℃至0℃。
可以用于本發(fā)明方法的有機溶劑包括鹵代鏈烷(特別是二氯甲烷)、酯(特別是烷基酯，諸如乙酸乙酯以及丙酸甲酯或乙酯)和堿性親核溶劑(諸如吡啶)。用于偶聯(lián)和硫轉(zhuǎn)移步驟的優(yōu)選溶劑為吡啶、二氯甲烷和它們的混合物。
本發(fā)明方法中H-膦酸酯與醇的摩爾比通常選擇在約0.9∶1至3∶1的范圍內(nèi)，通常為約1∶1至約2∶1，最好為約1.1∶1至約1.5∶1，諸如約1.2∶1。然而，當同時在一個以上游離羥基上發(fā)生偶聯(lián)時，所述摩爾比按比例增加。偶聯(lián)劑與醇的摩爾比通常選擇在約1∶1至約10∶1的范圍內(nèi)，通常為約1.5∶1至約5∶1，最好為約2∶1至約3∶1。硫轉(zhuǎn)移劑與醇的摩爾比通常選擇在約1∶1至約10∶1的范圍內(nèi)，通常為約1.5∶1至約5∶1，最好為約2∶1至約3∶1。
在本發(fā)明方法中，所述H-膦酸酯和所述醇可以在溶液中預混合，然后將偶聯(lián)劑加入該混合物中?；蛘撸梢詫-膦酸酯和偶聯(lián)劑通常在溶液中預混合，然后加入所述醇溶液中，或通常在溶液中將所述醇和偶聯(lián)劑混合，然后加入H-膦酸酯溶液中。在某些實施方案中，可以將可任選地為溶液形式的H-膦酸酯加至包含所述醇和偶聯(lián)劑的混合物的溶液中。在偶聯(lián)反應基本完成后，則將硫轉(zhuǎn)移劑加至在偶聯(lián)反應中產(chǎn)生的H-膦酸二酯溶液中。試劑的加入通常在加入期間內(nèi)連續(xù)或遞增進行。
在本發(fā)明的方法中，特別是當該方法以分步方式進行時，通過選擇合適的硫轉(zhuǎn)移劑，制備在同一分子中含磷酸二酯和硫代磷酸二酯核苷酸間鍵合的寡核苷酸是可能的。
如前所述，本發(fā)明方法可以用于合成RNA、2’-O-烷基-RNA、2’-O-烷氧基烷基-RNA和2’-O-鏈烯基-RNA序列。例如由相應的核苷結(jié)構(gòu)單元H-膦酸對甲酚酯銨和新戊?；龋梢灾苽?’-O-(Fpmp)-5’-O-(4，4-二甲氧基三苯甲基)-核糖核苷3’-H-膦酸酯1和2’-O-(烷基、烷氧基烷基或鏈烯基)-5’-O-(4，4-二甲氧基三苯甲基)-核糖核苷3’-H-膦酸酯2a-c。
相同的方案可用于合成DNA和DNA硫代磷酸酯序列(流程2-4)。按照所述標準的去封閉方法(流程2，步驟v和vi)，F(xiàn)pmp保護基在酸解的溫和條件下去除，導致無可檢測的所述核苷酸間鍵合的切割或遷移(Capaldi，D.C.；Reese，C.B.Nucleic Acids Res.1994，22，2209-2216)。對于化療有用的核酶序列，在溶液中相對大規(guī)模的RNA合成是一件值得考慮實際重要性的事情。2’-O-烷基、2’-O-取代的烷基和2’-O-鏈烯基[尤其是2’-O-甲基、2’-O-烯丙基和2’-O-(2-甲氧基乙基)]-核糖核苷(Sproat，B.S.‘Methods in Molecular Biology，第20卷，Protocols for Oligonucleotides and Analogs’，Agrawal，S.編輯，HumanaPress，Totowa，1993)摻入寡核苷酸中，目前是更重要的一件事情，因為這些修飾賦予所得寡聚物對核酸酶消化的抗性和良好的雜交特性。
在H-膦酸酯偶聯(lián)產(chǎn)物中現(xiàn)場進行硫轉(zhuǎn)移步驟，即不進行分離和純化通過偶聯(lián)反應產(chǎn)生的中間體。最好是，將硫轉(zhuǎn)移劑加至由偶聯(lián)反應產(chǎn)生的攪拌混合物中。
除在均相溶液中進行的事實外，本發(fā)明的偶聯(lián)方法在至少兩個其它重要方面不同于按照固相合成的H-膦酸酯途徑的偶聯(lián)方法(Froehler等，Methods in Molecular Biology，1993)。首先，它可以在非常低的溫度下進行。由此甚至當不用新戊酰基氯(Froehler，B.C.；Matteucci，M.D.Tetrahedron Lett.，1986，27，469-472)而用二氯化磷酸二-(2-氯苯基)酯作為偶聯(lián)試劑時，仍可以避免可能伴隨H-膦酸酯偶聯(lián)的副反應(Kuyl-Yeheskiely等，Rec.Trav.Chim.，1986，105，505-506)。其次，不是僅在裝配完整的寡聚物序列后進行一次硫轉(zhuǎn)移，而是在每個偶聯(lián)步驟后均進行硫轉(zhuǎn)移。
可以用本領(lǐng)域已知用于特定保護基和官能的方法，去除保護基。例如，通過用肼(例如緩沖的肼)處理，諸如在van Boom，J.H.；Burgers，P.M.J.Tetrahedron Lett.，1976，4875-4878中公開的非常溫和的條件下用肼處理，可以去除瞬時保護基，特別是γ酮酸(諸如乙酰丙?；捅Ｗo基)。然后，所得的部分保護的具有游離3’羥基官能的寡核苷酸，可以轉(zhuǎn)化為相應的H-膦酸酯，它們?yōu)榭梢杂糜趨^(qū)段合成寡核苷酸及其硫代磷酸酯類似物的中間體。
當一旦將已經(jīng)產(chǎn)生的所需產(chǎn)物去保護時，通常首先去除在產(chǎn)生硫代磷酸三酯鍵的磷上的保護基。例如，通過用強堿性胺(諸如DABCO、1，5-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)或三乙胺處理，可以去除氰基乙基。
通過肟鹽處理，例如用醛肟的共軛堿優(yōu)選E-2-硝基苯甲醛肟或吡啶-2-甲醛肟的共軛堿處理，可以去除硫代磷酸酯核苷酸間鍵合上和堿基殘基上的苯基和取代苯基(Reese等，Nucleic Acids Res.1981)。Kamimura，T.等，J.Am.Chem.Soc.，1984，106，4552-4557和Sekine，M.等，Tetrahedron，1985，41，5279-5288在基于硫代磷酸S-苯酯中間體的通過在溶液中的磷酸三酯途徑合成寡核苷酸方法方面；和van Boom及其同事在基于硫代磷酸S-(4-甲基苯基)酯中間體的寡核苷酸合成方法(Wreesman，C.T.J.等在Tetrahedron Lett.，1985，26，933-936)方面，都已經(jīng)全部證明了，用肟鹽離子處理將S-苯基硫代磷酸酯去封閉(采用Reese等，1978；Reese，C.B.；Zard，L.Nucleic Acids Res.，1981，9，4611-4626的方法)產(chǎn)生天然的磷酸二酯核苷酸間鍵合。在本發(fā)明中，用E-2-硝基苯甲醛肟的共軛堿將S-(4-氯苯基)保護的硫代磷酸酯去封閉可進行得很順利，沒有可檢測的核苷酸間切割。
用濃氨水處理，可以去除其它的堿基保護基，例如苯甲?；⑿挛祯；碗呋?。
通過用酸處理，可以去除存在的三苯甲基。對于寡脫氧核糖核苷酸合成的總的去封閉策略，本發(fā)明的另一重要考慮是三苯甲基(通常為5’-末端DMTr)保護基的去除(“脫三苯甲基”)應該不伴隨脫嘌呤，尤其是任何6-N-?；?2’-脫氧腺苷殘基的脫嘌呤。按照本發(fā)明的一個實施方案，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這種脫嘌呤在固相合成中也許是難以完全避免，但通過于低溫下用氯化氫稀溶液(具體為約0.45M鹽酸的二惡烷-二氯甲烷(1∶8 v/v)溶液，于-50℃)進行“脫三苯甲基”，可以完全抑制這種脫嘌呤。在這些反應條件下，“脫三苯甲基”可以快速完成，在某些情況下在5分鐘或更短的時間后完成。例如，當在這種條件下用氯化氫的二惡烷-二氯甲烷溶液處理6-N-苯甲酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧腺苷時，2分鐘后完成“脫三苯甲基”，但甚至在4小時后也未檢測到脫嘌呤。
通過例如用氟化四烷基銨鹽(諸如氟化四丁基銨)溶液進行氟化物處理，可以去除甲硅烷基保護基。
通過在溫和條件下進行酸水解，可以去除Fpmp保護基。
這種在溶液中合成寡核苷酸的新方法適用于制備以下序列(a)僅有磷酸二酯核苷酸間鍵合的序列，(b)僅有硫代磷酸二酯核苷酸間鍵合的序列，和(c)具有磷酸二酯和硫代磷酸二酯核苷酸間鍵合組合的序列。
本發(fā)明也涉及區(qū)段偶聯(lián)(如流程4b中的實施例所描述的)的開發(fā)。在該方面，所述實施例提供由四聚物區(qū)段合成一種七硫代磷酸八脫氧核糖核苷d[Tp(s)Tp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s)Tp(s)T]的描述(ISIS 5320Ravikuma，V.T.；Cherovallath，Z.S.Nucleosides & Nucleosides 1996，15，1149-1155)。這種寡核苷酸類似物具有作為抗HIV藥劑的特性。提出的其它區(qū)段合成靶包括具有治療效應的序列，例如人凝血酶的抑制劑和一種抗HIV藥劑。此外，本發(fā)明的方法可以用于合成較大的序列。
顯然，當本發(fā)明方法用于區(qū)段合成時，得到所需產(chǎn)物的途徑方面可利用許多替代的策略。這些將取決于所需產(chǎn)物的性質(zhì)。例如，通過制備二聚物，偶聯(lián)產(chǎn)生四聚物，然后將其偶聯(lián)產(chǎn)生所需的八聚物，可以制備八聚物。或者，可以將二聚物和三聚物偶聯(lián)，產(chǎn)生五聚物，可以將五聚物與三聚物進一步偶聯(lián)產(chǎn)生所需的八聚物。由用戶進行策略的選擇。然而，這種區(qū)段偶聯(lián)的共同特征是包含兩個或兩個以上單位的H-膦酸寡聚物與也包含兩個或兩個以上單位的寡聚物醇偶聯(lián)。使最常用的3’-H-膦酸寡核苷酸與具有游離5’羥基官能的寡核苷酸偶聯(lián)。
本發(fā)明的方法也可以用來制備環(huán)狀寡核苷酸，尤其是環(huán)狀寡脫氧核糖核苷酸和環(huán)狀核糖核苷酸。在環(huán)狀寡核苷酸的制備中，制備包含一個H-膦酸酯官能(通常為3’或5’H-膦酸酯)的寡核苷酸，并通過合適的去保護引入游離羥基官能。通常選擇所述游離羥基官能的位置對應于所述H-膦酸酯，例如5’羥基官能應該與3’H-膦酸酯偶聯(lián)，而3’羥基官能應該與5’H-膦酸酯偶聯(lián)。然后，在偶聯(lián)劑的存在下，所述羥基和所述H-膦酸酯官能可以在溶液中進行分子內(nèi)偶聯(lián)，通過現(xiàn)場硫轉(zhuǎn)移進行該反應。
按照本發(fā)明的再一方面，提供具有以下化學通式的新的H-膦酸寡聚物
其中每個B獨立地為選自A、G、T、C或U的堿基；每個Q獨立地為H或OR’，其中R’為烷基、取代的烷基、鏈烯基或保護基；
每個R獨立地為芳基、甲基、取代的烷基或鏈烯基；W為H、保護基或下式的H-膦酸酯基團
其中M+為單價陽離子；每個X獨立地代表O或S；每個Y獨立地代表O或S；Z為H、保護基或下式的H-膦酸酯基團
其中M+為單價陽離子；而n為正整數(shù)；前提為當W為H或保護基時，Z為H-膦酸酯基團，而當Z為H或保護基時，W為H-膦酸酯基團。
最好是，僅W或Z之一為H-膦酸酯基團，通常僅Z為H-膦酸酯基團。
當W或Z代表保護基時，所述保護基可以是以上公開的分別用于保護3’位或5’位的那些保護基。當W為保護基時，所述保護基為三苯甲基，特別是二甲氧基三苯甲基。當Z為保護基時，所述保護基為三苯甲基，特別是二甲氧基三甲基或?；?，最好是乙酰丙?；?br> 最好保護由B代表的堿基A、G和C，可以保護堿基T和U。合適的保護基包括上文公開的在按照本發(fā)明第一方面的方法中用于保護堿基的那些保護基。
當Q代表基團OR’，而R’為鏈烯基時，所述鏈烯基通常為C1-4鏈烯基，尤其是烯丙基或巴豆基。當R’代表烷基時，所述烷基最好為C1-4烷基。當R’代表取代的烷基時，所述取代的烷基包括烷氧基烷基，尤其是C1-4烷氧基C1-4烷基，諸如甲氧基乙基。當R’代表保護基時，所述保護基通常為酸不穩(wěn)定縮醛保護基，特別是1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(Fpmp)或三烷基甲硅烷基，通常為三(C1-4-烷基)甲硅烷基，諸如叔丁基二甲基甲硅烷基。
最好是，X代表O。
在許多實施方案中，Y代表S，而每個R代表由本發(fā)明方法中所用的硫轉(zhuǎn)移劑中保留的甲基、取代的烷基、鏈烯基或芳基。最好，每個R獨立地代表甲基；取代的甲基，特別是芐基或取代的芐基，諸如烷基-(通常為C1-4烷基-)或鹵代-(通常為氯代-)取代的芐基；取代的乙基，尤其是于2位用吸電子取代基取代的乙基，諸如2-(4-硝基苯基)乙基或2-氰基乙基；C1-4鏈烯基，最好是烯丙基和巴豆基；或取代或未取代的苯基，特別是鹵代苯基或烷基苯基，尤其是4-鹵代苯基或4-烷基苯基，通常為4-(C1-4烷基)苯基，最優(yōu)選為4-氯苯基或?qū)妆交?br> M+最好代表三烷基銨離子，諸如三(C1-4-烷基銨)離子，優(yōu)選三乙銨離子。
根據(jù)計劃合成的寡核苷酸，n可以是1至任何數(shù)目，特別是1-約20。n最好是1-16，尤其是1-9。當希望加入小區(qū)段的核苷酸時，可以使用其中n代表1、2或3的H-膦酸酯，而如果需要偶聯(lián)較大區(qū)段的寡核苷酸，則可以使用相對較大的n值，例如5、6或7或更大。
按照本發(fā)明的H-膦酸酯通常為溶液形式，最好是在本發(fā)明第一方面方法中所用的那些溶液形式。
這些H-膦酸酯在區(qū)段合成寡核苷酸和硫代磷酸寡核苷酸中也是有用的中間體。如上所述，區(qū)段偶聯(lián)在溶液相中比在固相合成中更加可行。
采用本領(lǐng)域已知的用于合成H-膦酸核苷的通用方法，可以制備所述H-膦酸寡核苷酸。因此，在本發(fā)明的再一方面，提供用于產(chǎn)生一種H-膦酸寡核苷酸的方法，其中在活化劑的存在下，使包含一個游離羥基官能(最好是3’或5’羥基官能)的寡核苷酸與H-膦酸烷基酯鹽或芳基酯鹽反應。
最好是，所述寡核苷酸是受保護的寡核苷酸，最優(yōu)選為受保護的寡脫氧核苷酸或受保護的寡核糖核苷酸。所述H-膦酸酯鹽通常為銨鹽，包括烷基、芳基和混合烷基和芳基銨鹽。所述銨鹽最好是(NH4)+或三(C1-4烷基)銨鹽?？梢栽谒鯤-膦酸酯中存在的烷基的實例為C1-4烷基，尤其是用強吸電子基團(特別是鹵代基團，優(yōu)選氟代基團)取代的C2-4烷基，諸如2，2，2-三氟乙基和1，1，1，3，3，3-六氟丙-2-基?？梢源嬖诘姆蓟膶嵗ū交腿〈谋交貏e是烷基苯基(通常為C1-4烷基苯基)和鹵代苯基(通常為氯苯基)。取代的苯基最好是4-取代的苯基。特別優(yōu)選的H-膦酸酯是H-膦酸對甲酚酯銨和H-膦酸對甲酚酯三乙銨?？梢允褂玫幕罨瘎┌ū疚墓_的用作偶聯(lián)劑的那些化合物，特別是氯化磷酸二芳基酯以及烷基和環(huán)烷基酰基氯，諸如1-金剛烷甲酰基氯，最好是新戊?；?。H-膦酸酯的產(chǎn)生最好在溶劑存在下進行，所述溶劑通常為公開用于本發(fā)明第一方面方法的那些溶劑，最好是吡啶、二氯甲烷和它們的混合物。
本發(fā)明在合成僅硫代磷酸二酯方面的一個優(yōu)點是只要在去封閉步驟[特別是在與氨水一起加熱期間(例如流程3的步驟viii(a))]小心避免脫硫，則硫代磷酸寡核苷酸的合成應該不產(chǎn)生標準磷酸二酯核苷酸間鍵合伴隨的產(chǎn)物。在固相硫代磷酸寡核苷酸合成中，在每個合成循環(huán)中的不完全硫轉(zhuǎn)移通常導致殘留的磷酸二酯污染(Zon，G.；Stec，W.J.‘Oligonucleotides and Analogs，A Practical Approach’，Eckstein，F(xiàn).，編輯，IRL Press，Oxford，1991，第87-108頁)。
本發(fā)明提出的溶液合成優(yōu)于固相合成的另一巨大的優(yōu)點是通過于低溫或甚至非常低的溫度下進行處理，存在控制反應選擇性的可能性。這一優(yōu)點擴展至脫三苯甲基步驟(流程3的步驟i)，該步驟在0℃以下快速定量地進行，且無可檢測的脫嘌呤。在脫三苯甲基步驟后，通過先前作為“過濾”方法描述的方法(Chaudhuri，B.；Reese，C.B.；Weclawek，K.Tetrahedron Lett.1984，25，4037-4040)，可以進行相對快且有效的純化。這取決于這樣一個事實用THF-吡啶混合物從硅膠短柱非?？斓叵疵撓铝姿崛?和硫代磷酸三酯)中間體，而不是任何殘留的脫三苯甲基帶電單體。
現(xiàn)在參照以下實施例描述按照本發(fā)明的方法，所述實施例不是限制性的。
在所述實施例中，應該注意到，當核苷殘基和核苷酸間鍵合為斜體時，表示它們以某種方式被保護。在本文中，A、C、G和T代表于N-6用苯甲?；Ｗo的2’-脫氧腺苷、于N-4用苯甲酰基保護的2’-脫氧胞苷、于N-2和O-6用異丁酰基和2，5-二氯苯基保護的的2’-脫氧鳥苷和未保護的胸腺嘧啶。例如，如流程3所示，p(s)和p(s’)分別代表S-(2-氰基乙基)和S-(4-氯苯基)硫代磷酸酯，而p(H)為未保護的，因此不是斜體，如果將其置于序列末端或連接至單體，則代表H-膦酸單酯，而在其它情況下它代表H-膦酸二酯。實施例制備磷酸二核苷的反應流程具體關(guān)于磷酸二核苷的制備，流程2更詳細地描述了用于制備寡脫氧核糖核苷酸及其硫代磷酸酯類似物的本發(fā)明方法。
流程2試劑和條件(i) 18，C5H5N，CH2Cl2，-40℃，5-10min；(ii) 19，C5H5N，CH2Cl2，-40℃，15min，b，C5H5N-H2O(1∶1 v/v)，-40℃至室溫(iii) 4M HCl/二惡烷，CH2Cl2，-50℃，5min；(iv) Ac2O，C5H5N，室溫，15h；(v) 20，TMG，MeCN，室溫，12h；(vi) a，濃氨水(d 0.88)，50℃，15h，b，Amberlite IR-120(plus)，Na+形式，H2O；(vii) a，21，C5H5N，CH2Cl2，-40℃，5-10min，b，C5H5N-H2O(1∶1 v/v)，-40℃至室溫；(viii)DBU，Me3SiCl，CH2Cl2，室溫，30min；(ix) 20，DBU，MeCN，室溫，12h。
從流程2，通過中間體8、9、10和11進行寡核苷酸的合成，而通過中間體8、9、12和13進行硫代磷酸酯類似物的制備。堿基14、15和16對應于受保護的腺嘌呤、受保護的胞嘧啶和受保護的鳥嘌呤。堿基17對應于不需要保護的胸腺嘧啶。可以使用任何常規(guī)使用的保護基。在RNA的合成中，胸腺嘧啶將被尿嘧啶取代。化合物18為合適的偶聯(lián)劑，而化合物19和21為合適的硫轉(zhuǎn)移劑。下文更全面地涉及這些化合物。
在流程2中描述的按照本發(fā)明的偶聯(lián)方法中需要的單體結(jié)構(gòu)單元是5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧核糖核苷3’-H-膦酸酯三乙銨8(堿基B和B’＝14-17)，它們可以用最近報道的方法(Ozola，V.，Reese，C.B.，Song Q.Tetrahedron Lett.，1996，37，8621-8624)以幾乎定量的產(chǎn)量由相應的受保護核苷衍生物容易地制備。作為說明，如下制備5’-O-(二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧核糖核苷3’-H-膦酸酯三乙銨8將H-膦酸4-甲基苯酯銨30(2.84g，15.0mmol)、5’-O-(二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧核糖核苷衍生物(5.0mmol)、三乙胺(4.2ml，30mmol)和無水吡啶(20ml)一起減壓蒸發(fā)。將殘余物與無水吡啶(20ml)再次共蒸發(fā)。將殘余物溶于無水吡啶(40ml)中，將溶液冷卻至-35℃(工業(yè)甲醇變性酒精/干冰浴)。將新戊?；?1.85ml，15.0mmol)在1min內(nèi)滴加至攪拌的溶液中，將反應物于-35℃保持。30min后，加入水(5ml)，讓攪拌的混合物溫至室溫。將磷酸鉀緩沖液(1.0mol dm-3，ph7.0，250ml)加入產(chǎn)物中，將所得的混合物減壓濃縮，直至去除所有的吡啶。將殘留的混合物分配于二氯甲烷(250ml)和水(200ml)之間。有機層用磷酸三乙銨緩沖液(0.5mol dm-3，pH7.0，3×50ml)洗滌，干燥(MgSO4)，然后減壓蒸發(fā)。殘余物經(jīng)硅膠(25g)短柱層析分級分離。用二氯甲烷-甲醇(95∶5至90∶10v/v)洗脫合適的流分后，蒸發(fā)得到(5’-O-(二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧核糖核苷3’-H-膦酸酯8。
當讓6-N-苯甲?；?5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧腺苷3’-H-膦酸酯三乙銨(DMTr-Ap(H))(Ozola等，Tetrahedron，1996)、8(B-14)、4-N-苯甲酰基-3’-O-乙酰丙?；?2’-脫氧胞嘧啶(HO-C-Lev)9(B’＝15)和氯化磷酸二(2-氯苯基)酯18一起在吡啶-二氯甲烷溶液中于-40℃反應時，在5-10分鐘內(nèi)顯然獲得大量的相應的全保護H-膦酸二核苷(DMTr-Ap(H)C-Lev)。用于該具體實施例中的方案是在5分鐘內(nèi)，將氯化磷酸二(2-氯苯基)酯(2.03g，6.0mmol)的二氯甲烷(4ml)溶液滴加至攪拌的DMTr-Ap(H)8(B＝14)三乙銨鹽(3.95g，約4.8mmol)和4-N-苯甲酰基-3’-O-乙酰丙酰基-2’-脫氧胞嘧啶9(B’＝15)(1.72g，4.0mmol)的吡啶(36ml)無水溶液中，于-40℃(工業(yè)甲醇變性酒精+干冰浴)保持。再過5分鐘后，推定為DMTr-Ap(H)C-Lev的唯一的一種核苷酸產(chǎn)物和某些殘留的H-膦酸酯單體8(B＝14)可以通過反向HPLC檢測。然而，應該注意到，這些反應條件可以適當變化。
特別注意到，僅約20％過量的H-膦酸酯單體可達到這種高偶聯(lián)效率。沒有嘗試分離中間體H-膦酸二核苷(DMTr-Ap(H)C-Lev)。
將N-[(4-氯苯基)硫烷基]苯鄰二甲酰亞胺19(2.32g，8.0mmol)(Behforouz，M.；Kerwood，J.E.J.Org.Chem，1969，34，51-55)加入攪拌的反應物中，將其于-40℃保持。15分鐘后，處理產(chǎn)物，進行硅膠層析，得到相應的硫代磷酸S-(4-氯苯基)二核苷DMTr-Ap(s’)C-Lev 10(B＝14，B’＝15)，分離得率約99％。因此，于-40℃下，偶聯(lián)步驟和硫轉(zhuǎn)移步驟均進行得相對快，且實際上定量進行。
DMTr-Ap(s’)C-Lev 10(B＝14，B’＝15)去封閉的四步驟方法最好包括“脫三苯甲基”、5’-末端羥基官能的乙酰化、肟鹽處理和最后的用濃氨水處理，以從所述堿基殘基和從所述3’-和5’-末端羥基官能去除?；Ｗo基。以該方法，獲得極純的d[ApC]11(B＝腺嘌呤-9-基，B’＝胞嘧啶-1-基)，而不用進一步純化，將其作為其鈉鹽分離。使單體結(jié)構(gòu)單元8(B＝17)和9(B’＝16)以相同方式和相同規(guī)模偶聯(lián)在一起。用N-[(4-氯苯基)硫烷基]苯鄰二甲酰亞胺19進行硫轉(zhuǎn)移后，分離出全保護的硫代磷酸二核苷DMTr-Tp(s’)G-Lev 10(B＝17，B’＝16)，得率約98％。此外，當用上述方法(流程2，步驟iii-vi)將該物質(zhì)去封閉時，獲得非常純的d[TpG]11(B＝胸腺嘧啶-1-基，B’＝鳥嘌呤-9-基)。
用于制備全保護的硫代磷酸寡核苷酸的方案與用于寡核苷酸合成的方案的不同之處，僅在于用4-[(2-氰基乙基)硫烷基]嗎啉-3，5-二酮21或3-(苯二酰亞氨基硫烷基)丙腈實施硫轉(zhuǎn)移。然而，4-[(2-氰基乙基)硫烷基]嗎啉-3，5-二酮的優(yōu)點在于，在硫轉(zhuǎn)移過程中產(chǎn)生的嗎啉-3，5-二酮比苯鄰二甲酰亞胺的水溶性更強。讓6-O-(2，5-二氯苯基)-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-N-異丁?；?2’-脫氧鳥苷3’-H-膦酸酯三乙銨(DMTr-Gp(H))8(B＝16)[約4.8mmol]、6-N-苯甲?；?3’-O-乙酰丙?；?2’-脫氧腺苷(HO-A-Lev)9(B＝14)[4.0mmol]和氯化膦酸二-(2-氯苯基)酯18[6.0mmol]于-40℃在吡啶-二氯甲烷溶液中一起反應5-10分鐘。然后加入4-[(2-氰基乙基)硫烷基]嗎啉-3，5-二酮21[8.0mmol](流程2，步驟vii)，同時將反應物于-40℃保持。15分鐘后，處理產(chǎn)物并經(jīng)硅膠層析分級分離，得到全保護的硫代磷酸二核苷(DMTr-Gp(s)A-Lev)12(B＝14，B’＝16)，分離得率為99％。通過一個5步驟方法(流程2，步驟iii、iv、viii、ix和vi)將該物質(zhì)去封閉。在“脫三苯甲基”和乙酰化步驟后，在嚴格無水條件下用1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)處理產(chǎn)物，以去除S-(2-氰基乙基)保護基。然后，通過肟鹽處理，從所述鳥嘌呤殘基中去除6-O-(2，5-二氯苯基)保護基，最后通過氨解作用去除所有的?；Ｗo基。如果所述硫代磷酸寡核苷酸不含任何2’-脫氧鳥苷殘基，則可以省略肟鹽處理步驟。不用進一步純化，則可獲得極純的d[Gp(s)A]13(B＝鳥嘌呤-9-基，B’＝腺嘌呤-9-基)，將其作為其鈉鹽分離。4-[(2-氰基乙基)硫烷基]嗎啉-3，5-二酮的制備如下制備氯化S-(2-氰基乙基)異硫脲鎓。在加熱下將硫脲(304g)溶于濃鹽酸(500ml)中。將所得溶液減壓蒸發(fā)，將殘留的無色固體溶于沸騰的無水乙醇(1300ml)中。將溶液冷卻至室溫，在攪拌下分次加入丙烯腈(400cm3)。將反應物回流下加熱2小時。將冷卻的產(chǎn)物過濾，用冷乙醇洗滌殘余物，然后經(jīng)氯化鈣真空干燥。
然后如下制備二-(2-氰基乙基)二硫醚。于0℃(冰-水浴)將二氯甲烷(400ml)加入攪拌的氯化S-(2-氰基乙基)異硫脲鎓(83.0g)的水(500ml)溶液中。加入過硼酸鈉四水合物(44.1g)，然后滴加氫氧化鈉(30.0g)的水(250ml)溶液。將反應物保持在0℃(冰-水浴)。5小時后，分離產(chǎn)物，并用二氯甲烷(3×50ml)萃取水層。將合并的有機層干燥(MgSO4)并減壓蒸發(fā)，將得到的固體從甲醇(30ml)中再結(jié)晶，得到無色晶體。
將二-(2-氰基乙基)二硫醚(4.51g)和嗎啉-2.6-二酮(5.75g)懸浮于乙腈(10ml)、二氯甲烷(20ml)和2，6-二甲基吡啶17.4ml)中，并冷卻至0℃(冰-水浴)。在30分鐘內(nèi)加入溴(4.28g)的二氯甲烷(20ml)溶液。將反應混合物于0℃下攪拌1.5小時。然后，通過在30分鐘內(nèi)加入冰冷的甲醇(50ml)沉淀產(chǎn)物，將其過濾，得到標題化合物(8.23g，82％)。從乙酸乙酯中再結(jié)晶，得到4-[(2-氰基乙基)硫烷基]嗎啉-3，5-二酮無色針狀物，m.p.121-122℃。制備嵌合寡核苷酸的反應流程通過流程3中的實施例概括描述了具有一個硫代磷酸二酯和兩個磷酸二酯核苷酸間鍵合的d[TpGp(s)ApC]25的分步合成。

流程3試劑和條件(i)4M HCl/二惡烷，CH2Cl2，-50℃，5min；(ii) 18，C5H5N，CH2Cl2，-40℃，5-10min；(iii) a，21，C5H5N，CH2Cl2，-40℃，15min，b，C5H5N-H2O(1∶1 v/v)，
-40℃至室溫；(iv) a，19，C5H5N，CH2Cl2，-40℃，15min，b，C5H5N-H2O(1∶1 v/v)，-40℃至室溫；(v) Ac2O，C5H5N，室溫，15h；(vi) DBU，Me3SiCl，CH2Cl2，室溫，30min；(vii) 20，DBU，MeCN，室溫，12h；(viii)a，濃氨水(d 0.88)，50℃，15h，b，Amberlite IR-120(plus)，Na+形式，H2O。
預期沒有規(guī)模的限制。流程3中所示的反應不是限制性的，本發(fā)明的方法同樣適用于RNA、2’-O-烷基-RNA和其它寡核苷酸序列的合成。
使用以上在或者d[ApC]11(B＝腺嘌呤-9-基，B’＝胞嘧啶-1-基)或者d[Gp(s)A]13(B＝鳥嘌呤-9-基，B’＝腺嘌呤-9-基)(流程2)的制備中涉及的所有反應。
首先，在四個步驟中將全保護的硫代磷酸二核苷DMTr-Ap(s’)C-Lev 10(B＝14，B’＝15)[約0.75mmol]轉(zhuǎn)化為部分保護的三聚物23，總的分離得率約96％(流程3a)。在每個偶聯(lián)步驟中，使用過量約20％的H-膦酸酯單體8，但偶聯(lián)劑18的過量取決于反應規(guī)模。此外，在該實施例中使用過量2倍的硫轉(zhuǎn)移劑19或21。在每個“脫三苯甲基”步驟后，將產(chǎn)物進行硅膠層析分離。
然后，將該物質(zhì)與DMTr-Tp(H)8(B＝17)偶聯(lián)，在三個步驟中將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為全保護的四聚物24，總得率約93％(流程3b)。將后一物質(zhì)去封閉，得到d[TpGp(s)ApC]25，將其作為相對純(HPLC檢測為約96.5％)的鈉鹽分離，不用進一步純化。
也通過以非常相同的方式進行分步合成，制備三磷酸四核苷d[TpGpApC]和三硫代磷酸四核苷d[Cp(s)Tp(s)Gp(s)A]。所按照的方案與流程3所概述方案的不同之處，僅在于以非常相同的方式進行分步合成。所按照的方案與流程3所概述方案不同，僅在于在d[TpGpApC]的制備中只使用硫轉(zhuǎn)移劑19，而在d[Cp(s)Tp(s)Gp(s)A]的制備中只使用硫轉(zhuǎn)移劑21。區(qū)段偶聯(lián)的反應流程作為說明，下文給出的流程4描述了為本發(fā)明一部分的區(qū)段偶聯(lián)的實施例。

流程4試劑和條件(i) N2H4·H2O，C5H5N-AcOH(3∶1 v/v)，0℃，20min；(ii) a，30，Me3C-COCl，C5H5N，-35℃，30min，b，Et3N，H2O；(iii)18，C5H5N，CH2Cl2，-35℃；(iv) a，21，C5H5N，CH2Cl2，-35℃，10min，b，C5H5N-H2O(1∶1 v/v)，-35℃至室溫。
以91％的分離得率獲得的全保護七硫代磷酸八脫氧核苷29為d[Tp(s)Tp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s)Tp(s)T]的前體。如上所述，區(qū)段偶聯(lián)在溶液中比在固相合成中適宜得多。
當然，該方法決不限于四聚物偶聯(lián)。實際上，預期該H-膦酸酯法適用于將相當大的寡核苷酸區(qū)段(例如10+10)偶聯(lián)在一起。用于制備區(qū)段H-膦酸酯的反應流程例如，如流程5所示，可以將部分保護的寡核苷酸33a和可以通過允許在溶液中進行的常規(guī)磷酸三酯(Chattopadhyaya，J.B.；Reese，C.B.Nucleic Acids Res.，1980，8，2039-2054；Kemal，O.，Reese，C.B.；Serafinowska，H.T.J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，1983，591-593)制備相應的硫代磷酸酯33b，同樣地轉(zhuǎn)化為其3’H-膦酸酯(分別為34a和34b)。
a，X＝O，Ar＝2-ClC6H4；b，X＝S，Ar＝2，5-Cl2C6H3-流程5試劑和條件(i)a，30，Me3C.COCl，C5H5N，-35℃，b，Et3N，H2O。實施例1Ac-Tp(s)Tp(s)Gp(s)G-OH將HO-Tp(s)Tp(s)Gp(s)G-Lev(5.82g，3mmol)與無水吡啶(2×20ml)一起共蒸發(fā)，再溶于無水吡啶(30ml)中。加入乙酸酐(1.42ml，15mmol)，將反應溶液于室溫下攪拌12h。加入水(1.5ml)以猝滅反應。10分鐘后，將混合物冷卻至0℃(冰水浴)，加入水合肼(1.50g，30mmol)的吡啶(15ml)溶液和冰醋酸(15ml)。將混合物于0℃攪拌20分鐘，然后將其分配于水(100ml)和二氯甲烷(100ml)之間。分離兩層，有機層用水(3×50ml)洗滌。將有機層干燥(MgSO4)并蒸發(fā)。殘余物經(jīng)硅膠層析純化。用甲醇-二氯甲烷(4∶96 v/v)洗脫雜質(zhì)，用丙酮洗脫主產(chǎn)物。蒸發(fā)合適的流分，得到部分保護的三硫代磷酸四脫氧核苷無色固體(5.30g，93％)。實施例2Ac-Tp(s)Tp(s)Gp(s)Gp(H)將H-膦酸4-甲基苯酯的銨鹽(1.42g，7.5mmol)溶于甲醇(15ml)和三乙胺(2.1ml，15mmol)的混合物中。將混合物蒸發(fā)并與吡啶(2×10ml)在減壓下共蒸發(fā)。加入Ac-Tp(s)Tp(s)Gp(s)G-OH(4.71g，2.5mmol)，與干燥的吡啶(20ml)一起共蒸發(fā)。將殘余物溶于干燥吡啶(20ml)中，于-35℃在1分鐘內(nèi)加入新戊?；?1.23ml，10mmol)。于相同溫度下30分鐘后，加入水(5m)，讓混合物溫至室溫，并攪拌1小時。將溶液分配于水(100ml)和二氯甲烷(100ml)之間。分離有機層，用磷酸三乙銨緩沖液(pH7.0，0.5M，3×50ml)洗滌，干燥(MgSO4)，然后過濾并上硅膠柱(約25g)。將用甲醇-二氯甲烷(20∶80，v/v)洗脫的合適流分蒸發(fā)，得到Ac-Tp(s)Tp(s)Gp(s)Gp(H)，為無色固體(4.85g，94％)。實施例3Ac-Tp(s)Tp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s)Tp(s)T-Bz將Ac-Tp(s)Tp(s)Gp(s)Gp(H)(1.229g，0.6mmol)和HO-Gp(s)Gp(s)Tp(s)T-Bz(0.973g，0.5mmol)與無水吡啶(2×10ml)一起共蒸發(fā)，將殘余物溶于無水吡啶(10ml)中。將溶液冷卻至-35℃(工業(yè)甲醇變性酒精-干冰浴)，在10分鐘內(nèi)加入氯化磷酸二-(2-氯苯基)酯(0.84g，2.5mmol)的干燥二氯甲烷(1ml)溶液。加入4-[(2-氰基乙基)硫烷基]嗎啉-3，5-二酮(0.20g，1.0mmol)，將混合物于相同溫度下攪拌10分鐘。然后加入水-吡啶(0.2ml，1∶1 v/v)，將混合物再攪拌5分鐘。然后減壓蒸發(fā)反應混合物。將殘余物溶于二氯甲烷(100ml)中，溶液用飽和碳酸氫鈉水溶液(3×50ml)洗滌。將有機層干燥(MgSO4)并減壓濃縮。殘余物經(jīng)硅膠層析純化。首先，用甲醇-二氯甲烷(4∶96 v/v)去除親脂雜質(zhì)，然后用丙酮洗脫主產(chǎn)物。將合適的流分蒸發(fā)，得到全保護的七硫代磷酸八脫氧核苷無色固體(1.81g，91％)。以91％的分離得率獲得的全保護的七硫代磷酸八脫氧核苷為d[Tp(s)Tp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s)Tp(s)T]的前體。
權(quán)利要求
1.制備硫代磷酸三酯的方法，所述方法包括在偶聯(lián)劑存在下，使H-膦酸酯與醇進行溶液相偶聯(lián)，由此形成H-膦酸二酯，并且使所述H-膦酸二酯與硫轉(zhuǎn)移劑現(xiàn)場反應，產(chǎn)生硫代磷酸三酯。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述H-膦酸酯為包含3’-H-膦酸酯官能的受保護的核苷或寡核苷酸。
3.按照或者權(quán)利要求1或者權(quán)利要求2的方法，其中所述醇為包含游離5’-羥基官能的受保護的核苷或寡核苷酸。
4.按照任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述偶聯(lián)劑為式(ArO)2POCl的氯化磷酸二芳基酯，其中Ar代表苯基、2-氯苯基、2，4，6-三氯苯基或2，4，6-三溴苯基。
5.按照任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述硫轉(zhuǎn)移劑具有以下化學通式L-------S-------A其中L代表離去基團，而A代表芳基、甲基或取代的烷基或鏈烯基。
6.按照權(quán)利要求5的方法，其中所述離去基團為嗎啉-3，5-二酮、苯鄰二甲酰亞胺、琥珀酰亞胺、馬來酰亞胺或吲唑，而A代表4-鹵代苯基、4-烷基苯基、甲基、芐基、烷基芐基、鹵代芐基、烯丙基、巴豆基、2-氰基乙基或2-(4-硝基苯基)乙基。
7.按照任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述H-膦酸酯和所述醇為核糖核苷、2-O’-(烷基、烷氧基烷基或鏈烯基)-核糖核苷、寡核苷酸或2-O’-(烷基、烷氧基烷基或鏈烯基)-寡核苷酸。
8.具有以下化學通式的H-膦酸酯
其中每個B獨立地為選自A、G、T、C或U的堿基；每個Q獨立地為H或OR’，其中R’為烷基、取代的烷基、鏈烯基或保護基；每個R獨立地為芳基、甲基、取代的烷基或鏈烯基；W為H、保護基或下式的H-膦酸酯基團
其中M+為單價陽離子；每個X獨立地代表O或S；每個Y獨立地代表O或S；Z為H、保護基或下式的H-膦酸酯基團
其中M+為單價陽離子；而n為正整數(shù)；前提為當W為H或保護基時，Z為H-膦酸酯基團，而當Z為H或保護基時，W為H-膦酸酯基團。
9.按照權(quán)利要求8的H-膦酸酯，其中W代表保護基，每個X代表O，每個Y代表S，而每個R代表甲基、芐基、2-氰基乙基、未取代的苯基或4-鹵代苯基，M+代表三(C1-4-烷基銨)離子，而n為1-16。
10.生產(chǎn)H-膦酸寡核苷酸的方法，其中在活化劑的存在下，使包含一個游離羥基官能(最好是3’或5’羥基官能)的寡核苷酸與H-膦酸烷基酯鹽或芳基酯鹽反應。
11.按照權(quán)利要求10的方法，其中所述寡核苷酸為受保護的寡脫氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸。
12.按照權(quán)利要求10或11的方法，其中所述H-膦酸酯鹽為H-膦酸苯酯、烷基苯酯或鹵代苯酯的銨鹽。
13.按照權(quán)利要求10-12中任一項的方法，其中所述活化劑為氯化磷酸芳基酯或烷基?；?，最好為新戊?；取?br> 全文摘要
提供在溶液相中合成硫代磷酸三酯的方法。所述方法包括:在偶聯(lián)劑存在下,使H－膦酸酯與醇進行溶液相偶聯(lián),形成H－膦酸二酯。用硫轉(zhuǎn)移劑現(xiàn)場氧化所述H－膦酸二酯,產(chǎn)生硫代磷酸三酯。所述H－膦酸酯和醇最好是受保護的核苷或寡核苷酸。也提供可以用于形成硫代磷酸三酯的H－膦酸寡核苷酸。
文檔編號C07H19/10GK1274361SQ9880993
公開日2000年11月22日 申請日期1998年8月10日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月13日
發(fā)明者C·B·雷瑟, Q·宋 申請人:艾夫西亞有限公司