專利名稱：：一種濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝的制作方法一種濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝本發(fā)明涉及一種濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝，尤其是一種采用擴(kuò)張柱床離子交換吸附層析技術(shù)濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝。肝素(h印arin)是1916年Mclean研究凝血機(jī)制時(shí)從肝臟組織中發(fā)現(xiàn)的一種酸性粘多糖。1939年，Brinkhous等證明了肝素具有抗凝血活性，從此，肝素作為天然抗凝血物質(zhì)而受到世界各國(guó)的重視。肝素廣泛分布在哺乳動(dòng)物的組織中，如肝、肺、腸粘膜、心、脾、腎、胸腺、胎盤、肌肉和血液等。肝素是一種糖胺聚糖，是由糖醛酸和葡萄糖胺組成的具有不同鏈長(zhǎng)的多糖鏈的混合物，分子量在3000-30000D之間，平均分子量約12000D左右。由于肝素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前肝素主要從天然產(chǎn)物中提取獲得，尚無法進(jìn)行人工合成。自從1933年Charles和Scott建立了堿鹽水提取和胰酶消化的肝素工業(yè)生產(chǎn)的原則以來，肝素生產(chǎn)工藝已有了很大的改進(jìn)。在提取的方法上人們精益求精，并有所創(chuàng)新，如苦味酸法和醋酸鉀酸性沉淀法等。五十至六十年代，各國(guó)的肝素生產(chǎn)專利很多，以美、英、匈、捷、日、西德等國(guó)較為突出。上世紀(jì)七十年代以來，肝素工藝最有意義的新進(jìn)展是應(yīng)用胺類化合物和離子交換技術(shù)純化組織提取物。肝素在溶液中以聚陰離子(有獨(dú)特的臨界鹽濃度和高電荷密度)的形式存在，因此可以利用這一特點(diǎn)或者使肝素同各種陽(yáng)離子(包括胺)結(jié)合而從水溶液中沉淀出來，或者使肝素與陰離子交換劑發(fā)生交換從而達(dá)到分離，而后者更有成本較低、產(chǎn)量較高和操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。而國(guó)外現(xiàn)致力于原料處理方法的改進(jìn)和高效價(jià)肝素的制備。近幾年，我國(guó)廣泛而深入地研究形成了幾種具有本國(guó)特點(diǎn)的比較先進(jìn)的生產(chǎn)工藝。在我國(guó)，肝素的制備過程分兩個(gè)階段，即粗品的生產(chǎn)和精制。粗品的生產(chǎn)主要是采用離子交換樹脂法，有的結(jié)合超濾技術(shù)進(jìn)行除雜質(zhì)和濃縮。將肝素充分提取出來并防止其結(jié)構(gòu)被破壞是提高肝素收率的關(guān)鍵之一，因此離子交換樹脂的性能和工藝是決定收率的關(guān)鍵。肝素的精制過程是去雜質(zhì)和脫色。精制方法分為氧化法和非氧化法。氧化法主要分為高錳酸鉀氧化法和過氧化氫氧化法。目前國(guó)內(nèi)大都采用氧化法對(duì)肝素進(jìn)行脫色，這種精制方法或多或少地對(duì)肝素的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞作用，其中影響最大的是氧化處理過程。目前國(guó)外有的明確提出需要非氧化脫色的產(chǎn)品。目前，非氧化法制備肝素比較常用的方法是離子交換樹脂法。離子交換樹脂的性能和工藝是決定收率的關(guān)鍵，要選擇好樹脂的處理方法和處理時(shí)間，使其最大限度地進(jìn)行肝素的交換吸附。國(guó)內(nèi)離子交換樹脂法普遍采用分批吸附的方法，上柱、除雜、洗脫分開進(jìn)行。這種方法柱效低，對(duì)樹脂損害大，操作步驟多，費(fèi)用高，活性成分提取率低。因此，致力于原料處理方法的改進(jìn)和高效價(jià)肝素的制備是幾十年來各國(guó)肝素研究者孜孜不倦研究的一個(gè)方向，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，不斷有新技術(shù)被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于肝素制5備工藝。擴(kuò)張柱床吸附層析正是適應(yīng)大規(guī)模下游純化的需求而開發(fā)的新的層析技術(shù)。其原理在于吸附介質(zhì)顆粒在向上流動(dòng)的液體的作用下膨脹起來，吸附介質(zhì)顆粒在床體中均勻的懸浮，并按照不同的顆粒尺寸和密度形成梯度而有續(xù)的排列，形成一個(gè)均衡、穩(wěn)定的吸附環(huán)境，液體中的目標(biāo)肝素被吸附于介質(zhì)上，而細(xì)胞、細(xì)胞碎片、雜蛋白、核酸及雜多糖和其他的組織碎片將通過柱子而流出去，洗脫目標(biāo)肝素時(shí)從相反方向?qū)⑽浇橘|(zhì)壓緊，再用洗脫緩沖液將目標(biāo)肝素洗下來。擴(kuò)張柱床色譜技術(shù)兼有流化床和填充床的優(yōu)點(diǎn)，不需預(yù)先除去料液中的顆粒而可以直接從料液中吸附目標(biāo)產(chǎn)物。從而起到有效的吸附分離作用。擴(kuò)張柱床離子交換色譜技術(shù)是將擴(kuò)張柱床技術(shù)用于離子交換色譜的新技術(shù)。用擴(kuò)張柱床離子交換色譜技術(shù)不但可用于從哺乳動(dòng)物的腸粘膜、肝、肺等臟器勻漿液直接提取肝素，還可用于粗品肝素的精制。采用擴(kuò)張柱床離子交換色譜技術(shù)從哺乳動(dòng)物臟器勻漿液直接提取肝素和用粗品肝素精制肝素，大大降低了肝素純化工藝的復(fù)雜性，提高了產(chǎn)率，降低了生產(chǎn)成本。改變以往的國(guó)內(nèi)樹脂法精制肝素的生產(chǎn)中，基本上都是采用分批吸附的方法。分批吸附法理論塔板數(shù)低，柱效損失大，純化效率低，對(duì)目的分子吸附不夠充分，因此損失大。采用擴(kuò)張柱床離子交換色譜技術(shù)提取肝素，可將肝素與雜質(zhì)蛋白、核酸及其余硫酸多糖分離，濃縮，純化一次完成。減少工序，縮短時(shí)間，降低成本，提高效率和質(zhì)量。采用擴(kuò)張柱床離子交換色譜技術(shù)直接從勻漿液中提取肝素，肝素單位效價(jià)達(dá)到120U/mg以上，用粗品精制肝素，效價(jià)達(dá)到160U/mg以上，產(chǎn)品中紫外區(qū)雜質(zhì)(260nm，280nm)均滿足藥典要求。本發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)研究，并通過多次實(shí)驗(yàn)，成功將擴(kuò)張柱床離子交換技術(shù)用于肝素的分離純化工藝，至今為止，還沒有發(fā)現(xiàn)任何與本發(fā)明類似的肝素的提取工藝的報(bào)道。現(xiàn)將這些內(nèi)容扼要介紹如下本發(fā)明專利采用擴(kuò)張柱床離子交換樹脂法對(duì)粗品肝素進(jìn)行濃縮純化及精制。改變以往傳統(tǒng)的采用氧化法精制對(duì)肝素結(jié)構(gòu)的破壞而造成成品生物活性低，產(chǎn)品質(zhì)量差，和采用分批離子交換樹脂法對(duì)目的分子吸附不夠充分，柱效損失大，操作步驟繁瑣，純化效率低的缺點(diǎn)。本發(fā)明在粗品肝素的溶液中，將肝素與雜質(zhì)蛋白、核酸及其余硫酸多糖分離，濃縮，純化一次完成。本發(fā)明減少工序，縮短時(shí)間，降低成本，提高效率和質(zhì)量。在很大程度上降低了生產(chǎn)中有機(jī)溶劑的用量，而且提取率比較穩(wěn)定，粗品肝素溶液采用擴(kuò)張柱床離子交換樹脂法進(jìn)行濃縮純化及精制，不僅消除了氧化法和分批離子交換樹脂法大量生產(chǎn)時(shí)產(chǎn)生的污染液，而且降低成本，大幅縮短生產(chǎn)周期，生產(chǎn)技術(shù)成熟，適用于大生產(chǎn)，投資效率高，成本低，效益顯著。本發(fā)明既可用于豬、牛、羊等哺乳動(dòng)物的小腸粘膜或肝、肺等臟器的組織提取液中提取粗品肝素，又可用于粗品肝素的精制。取一定數(shù)量的豬、牛、羊等哺乳動(dòng)物的小腸粘膜或肝、肺等臟器的組織提取液或粗品肝素先配成一定濃度的鹽堿水溶液，胰蛋白酶酶解，高溫變性，過濾等處理過程后，采用擴(kuò)張柱床離子交換樹脂工藝對(duì)提取液分離、濃縮、純化，乙醇沉淀，丙酮脫水，低溫干燥。本技術(shù)產(chǎn)品為粗品及精品原料肝素，經(jīng)過檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。粗品制備6豬、牛、羊等哺乳動(dòng)物的小腸粘膜或肝、肺等臟器的組織勻漿液50g左右加水至250L，加入NaCI至-8%，攪拌、靜置、過濾。腸粘膜濾液加入0.1-0.5%胰蛋白酶(肝臟肺臟的組織勻漿液加入0.1-0.5%木瓜蛋白酶)，在pH7.5-10.5，35-45°C下酶解數(shù)小時(shí)，NaOH調(diào)pH至8.0-10.0，升溫至50_55°C，保溫2_4h，不斷攪拌，然后快速升溫到92-95°C,保持10-15min，趁熱用80目濾網(wǎng)過濾，濾液(I)備用。擴(kuò)張床柱Streamline50(5cm內(nèi)徑)、(購(gòu)自AmershamPharmaciaBiotech(瑞典))裝入已處理好的強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂?？刂茰囟?0-60°C，用蠕動(dòng)泵將pH為7.5-10.5，適量MTris_HCl緩沖液自柱床底部泵入，使樹脂擴(kuò)張并保持平衡。保持PH值不變，將適量濾液(I)加MTris-HCl緩沖液配制成NaCI為2-6%，pH為7.5-10.5的溶液，用蠕動(dòng)泵通進(jìn)擴(kuò)張交換柱中先平衡樹脂，然后反復(fù)進(jìn)行離子交換，流速約為每小時(shí)2倍柱床體積，直至流出液檢驗(yàn)無肝素，全部吸附在樹脂上為止。然后配制適量的的2-6%氯化鈉溶液，MTris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)pH3_5，以23個(gè)沉積床體積的緩沖液平衡/擴(kuò)張柱床后，以5-6倍沉積床體積的緩沖液除雜，整個(gè)過程控制溫度15-25°C，流速約為每小時(shí)2.5柱床體積。關(guān)掉蠕動(dòng)泵，使D254樹脂重新沉積，調(diào)節(jié)活塞至剛好在沉積床的表面，然后以向下的液流和沉積床的狀態(tài)進(jìn)行洗脫。樹脂先用約4倍柱床體積的3-8%的氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。再用約2倍柱床體積的2-7%氯化鈉溶液(用量先多后少)同法洗脫2次。合并全部洗脫液，調(diào)節(jié)pH為6。按洗脫液體積加入1.0倍量的預(yù)冷乙醇，沉淀過夜。次日吸除乙醇。沉淀物用2%氯化鈉溶液溶解，調(diào)pH至6.0。按溶液體積加0.7倍乙醇，沉淀過夜，次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用無水乙醇、丙酮洗滌脫水。真空干燥后得肝素，效價(jià)為120U/mg以上。精品制備將效價(jià)為60-100U/mg左右的肝素粗品以110的比例溶于3%的氯化鈉溶液中，然后再用2%的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至8-11，于室溫靜置數(shù)小時(shí)，真空抽濾，去沉淀物，濾液待用。在上述清液中加入0.01-0.胰蛋白酶，在pH7-10，35-45°C酶解數(shù)小時(shí)，升溫98-100°C，10-15min，趁熱真空抽濾，濾液備用。擴(kuò)張床柱Streamline50(5cm內(nèi)徑)、(購(gòu)自AmershamPharmaciaBiotech(瑞典))裝入已處理好的強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂，用蠕動(dòng)泵將PH7-10，適量MTris-HCl緩沖液自柱床底部泵入，使樹脂擴(kuò)張并保持平衡?？刂茰囟?0-60°C，將適量濾液加MTris-HCl緩沖液配制pH為7.5-10.5的溶液，用蠕動(dòng)泵通進(jìn)擴(kuò)張交換柱中反復(fù)進(jìn)行離子交換，交換過程中保持PH值與溫度恒定，流速約為每小時(shí)2倍柱床體積，直至流出液檢驗(yàn)無肝素，全部吸附在樹脂上為止。，然后配制適量的預(yù)冷的2-6%氯化鈉溶液，MTris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)pHl-3，以23個(gè)沉積床體積的緩沖液平衡/擴(kuò)張柱床后，以5-6倍沉積床體積的緩沖液除雜，整個(gè)過程控制溫度2-5°C，流速約為每小時(shí)2.5柱床體積。關(guān)掉蠕動(dòng)泵，使樹脂重新沉積，調(diào)節(jié)活塞至剛好在沉積床的表面，然后以向下的液流和沉積床的狀態(tài)進(jìn)行洗脫。樹脂先用用約4倍柱床體積的2-6%氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。再用約2倍柱床體積的2-6%氯化鈉溶液(用量先多后少)同法洗脫2次。合并全部洗脫液，調(diào)節(jié)pH為6。按洗脫液體積加入1.0倍量的預(yù)冷乙醇，沉淀過夜。次日吸除乙醇。沉淀物用2%氯化鈉溶液溶解，調(diào)pH至6.0。按溶液體積加0.7倍乙醇，沉淀過夜，次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用無水乙醇、丙酮洗滌脫水。真空干燥后得精品肝素，效價(jià)為150U/mg以上。擴(kuò)張柱床離子交換樹脂和普通鹽解_離子交換樹脂特點(diǎn)比較工藝特點(diǎn)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>質(zhì)控指標(biāo)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從以上比較可以看出，擴(kuò)張柱床法要比鹽解-離子交換法無論工藝還是質(zhì)控指標(biāo)都有利于肝素的生產(chǎn)，采用擴(kuò)張柱床離子交換樹脂法生產(chǎn)的肝素更有市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。"豬牛羊等哺乳動(dòng)物的腸粘膜？|3%氯化鈉溶液胰蛋白酶肝、肺等臟器的勻漿液及-溶解液-酶解液、粗品肝素鈉」PH10.5低溫靜置PH7-940°C95-100°C,10分鐘擴(kuò)張柱床離子交換樹脂95%乙醇，0-4°C沉淀12h-濾液-洗脫液-冷卻55°C過濾3%氯化鈉PH9.5-10.5PH6.5丙酮脫水真空干燥沉淀物-脫水物-成品55°C—60°C上述是擴(kuò)張柱床離子交換樹脂生產(chǎn)工藝流程。[實(shí)施例1]a)豬、牛、羊等哺乳動(dòng)物的小腸粘膜的組織勻漿液50g左右加水至250L，加入NaCI至3%，攪拌、靜置、過濾。b)濾液加入0.25%胰蛋白酶，在pH8.5，40°C下酶解數(shù)小時(shí)，NaOH調(diào)pH至9.0，升溫至50°C，保溫2h，不斷攪拌，然后快速升溫到92-95°C，保持10-15min，趁熱用80目濾網(wǎng)過濾，濾液(I)備用。c)取適量強(qiáng)堿性D254干樹脂，在蒸餾水中充分浸泡，溶脹后濾干，加等體積乙醇或丙酮攪拌1小時(shí)，用蒸餾水洗凈濾干，加4倍量的2mol/l的鹽酸溶液攪拌2小時(shí)，用蒸餾水洗至中性，濾干；加2倍量2mol/l的氫氧化鈉溶液攪拌2小時(shí)，蒸餾水洗至中性，濾干；最后用2倍量2mol/l的鹽酸溶液攪拌2小時(shí)，水洗至中性。d)取100g已處理好的強(qiáng)堿性D254樹脂加入擴(kuò)張床柱Streamline50(5cm內(nèi)徑)、用蠕動(dòng)泵以每小時(shí)2倍柱床體積的流速將pH為8.0的適量MTris-HCl緩沖液(II)自柱床底部泵入，使樹脂擴(kuò)張并保持平衡?？刂茰囟?0°C(平衡)。e)將適量濾液(I)加緩沖液(II)，配置成料液(III)。調(diào)整料液(III)NaCI濃度達(dá)到3%左右，NaOH調(diào)pH至8.0。用蠕動(dòng)泵將料液(III)通進(jìn)擴(kuò)張交換柱中反復(fù)進(jìn)行離子交換，交換過程中保持恒定的PH值，溫度為18°C。流速約為每小時(shí)2.5倍柱床體積，直至流出液檢驗(yàn)無肝素，全部吸附在樹脂上為止(上樣)。，f)配制10個(gè)柱床體積的6%氯化鈉溶液，MTris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)pH3_5，以23個(gè)沉積床體積的緩沖液平衡/擴(kuò)張柱床后，以5-6倍沉積床體積的緩沖液除雜，整個(gè)過程控制溫度15-25°C，流速約為每小時(shí)2.5柱床體積。(向上沖洗，除雜)。g)關(guān)掉蠕動(dòng)泵，使D254樹脂重新沉積，調(diào)節(jié)活塞至剛好在沉積床的表面，然后以向下的液流和沉積床的狀態(tài)進(jìn)行洗脫。樹脂先用用約4倍柱床體積的4%氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。再用約2倍柱床體積的3%氯化鈉溶液(用量先多后少)同法洗脫2次。合并全部洗脫液，調(diào)節(jié)PH為6(洗脫)。h)按洗脫液體積加入1.0倍量的預(yù)冷乙醇，沉淀過夜。次日吸除乙醇。沉淀物用2%氯化鈉溶液溶解，調(diào)pH至6.0。按溶液體積加0.7倍乙醇，沉淀過夜。i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用無水乙醇、丙酮洗滌脫水。真空干燥后得肝素成品。9[實(shí)施例2]a)將10g肝素粗品溶于3%的100ml氯化鈉溶液中，然后再用2%的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至9，于18°C靜置6小時(shí)，真空抽濾，濾液待用。b)在上述清液中加入0.03%胰蛋白酶，在pH8.5，40°C下酶解4小時(shí)，升溫98-100°C，10min，趁熱真空抽濾，濾液(I)備用。c)取適量強(qiáng)堿性D254干樹脂，在蒸餾水中充分浸泡，溶脹后濾干，加等體積乙醇或丙酮攪拌1小時(shí)，用蒸餾水洗凈濾干，加4倍量的2mol/l的鹽酸溶液攪拌2小時(shí)，用蒸餾水洗至中性，濾干；加2倍量2mol/l的氫氧化鈉溶液攪拌2小時(shí)，蒸餾水洗至中性，濾干；最后用2倍量2mol/l的鹽酸溶液攪拌2小時(shí)，水洗至中性。d)取30g已處理好的強(qiáng)堿性D254樹脂加入擴(kuò)張床柱Streamline50(5cm內(nèi)徑)、用蠕動(dòng)泵以每小時(shí)2倍柱床體積的流蘇將pH為8.0的適量MTris-HCl緩沖液(II)自柱床底部泵入，使樹脂擴(kuò)張并保持平衡(平衡)。e)調(diào)整pH值9不變，將適量濾液(I)加緩沖液(II)，使粗品氯化鈉濃度達(dá)到3%左右(III)。用蠕動(dòng)泵將料液(III)通進(jìn)擴(kuò)張交換柱中反復(fù)進(jìn)行離子交換，交換過程中保持恒定的PH值，保持溫度20°C。流速約為每小時(shí)2倍柱床體積，直至流出液檢驗(yàn)無肝素，全部吸附在樹脂上為止(上樣)。f)配制約10個(gè)柱床體積的預(yù)冷的6%氯化鈉溶液，用MTris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)PH1.2，緩沖液平衡/擴(kuò)張柱床后，以5-6倍沉積床體積的緩沖液除雜，整個(gè)過程控制溫度5°C度以下，流速約為每小時(shí)2.5柱床體積。(向上沖洗)。g)關(guān)掉蠕動(dòng)泵，使D254樹脂重新沉積，調(diào)節(jié)活塞至剛好在沉積床的表面，然后以向下的液流和沉積床的狀態(tài)進(jìn)行洗脫。樹脂先用用約4倍柱床體積的pH為8的4%氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。再用約2倍柱床體積的3%氯化鈉溶液(用量先多后少)同法洗脫2次。合并全部洗脫液，調(diào)節(jié)pH為6(洗脫)。h)按洗脫液體積加入1.0倍量的預(yù)冷乙醇，沉淀過夜。次日吸除乙醇。沉淀物用2%氯化鈉溶液溶解，調(diào)pH至6.0。按溶液體積加0.7倍乙醇，沉淀過夜。i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用無水乙醇、丙酮洗滌脫水。真空干燥后得精品肝素。[實(shí)施例3]a)豬、牛、羊等哺乳動(dòng)物的肝、肺等臟器的組織勻漿液30g左右加水至250L，加入NaCI至5%，攪拌、靜置、過濾。b)在上述清液中加入0.4%木瓜蛋白酶，在pH8.5，40°C下酶解4小時(shí)，升溫98-100°C，10分鐘，趁熱真空抽濾，濾液(I)備用。c)取適量強(qiáng)堿性D254干樹脂，在蒸餾水中充分浸泡，溶脹后濾干，加等體積乙醇或丙酮攪拌1小時(shí)，用蒸餾水洗凈濾干，加4倍量的2mol/l的鹽酸溶液攪拌2小時(shí)，用蒸餾水洗至中性，濾干；加2倍量2mol/l的氫氧化鈉溶液攪拌2小時(shí)，蒸餾水洗至中性，濾干；最后用2倍量2mol/l的鹽酸溶液攪拌2小時(shí)，水洗至中性。d)取100g已處理好的強(qiáng)堿性D254樹脂加入擴(kuò)張床柱Streamline50(5cm內(nèi)徑)、用蠕動(dòng)泵以每小時(shí)2倍柱床體積的流速將pH為8.0的適量MTris-HCl緩沖液(II)自柱床底部泵入，使樹脂擴(kuò)張并保持平衡?？刂茰囟?0°C(平衡)。e)將適量濾液(I)加緩沖液(II)，配置成料液(III)。調(diào)整料液(III)NaCI濃度達(dá)到3%左右，NaOH調(diào)pH至8.0。用蠕動(dòng)泵將料液(III)通進(jìn)擴(kuò)張交換柱中反復(fù)進(jìn)行離子交換，交換過程中保持恒定的PH值，溫度為18°C。流速約為每小時(shí)2.5倍柱床體積，直至流出液檢驗(yàn)無肝素，全部吸附在樹脂上為止(上樣)。f)配制10個(gè)柱床體積的6%氯化鈉溶液，MTris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)pH3_5，以23個(gè)沉積床體積的緩沖液平衡/擴(kuò)張柱床后，以5-6倍沉積床體積的緩沖液除雜，整個(gè)過程控制溫度15-25°C，流速約為每小時(shí)2.5柱床體積。(向上沖洗，除雜)。g)關(guān)掉蠕動(dòng)泵，使D254樹脂重新沉積，調(diào)節(jié)活塞至剛好在沉積床的表面，然后以向下的液流和沉積床的狀態(tài)進(jìn)行洗脫。樹脂先用用約4倍柱床體積的4%氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。再用約2倍柱床體積的3%氯化鈉溶液(用量先多后少)同法洗脫2次。合并全部洗脫液，調(diào)節(jié)PH為6(洗脫)。h)按洗脫液體積加入1.0倍量的預(yù)冷乙醇，沉淀過夜。次日吸除乙醇。沉淀物用2%氯化鈉溶液溶解，調(diào)pH至6.0。按溶液體積加0.7倍乙醇，沉淀過夜。i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用無水乙醇、丙酮洗滌脫水。真空干燥后得肝素成品。權(quán)利要求一種濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝，其特點(diǎn)在于，采用擴(kuò)張柱床離子交換樹脂法可將豬、牛、羊等哺乳動(dòng)物的小腸粘膜、肝、肺臟等臟器的組織勻漿的提取液不經(jīng)過預(yù)處理直接采用色譜技術(shù)分離、濃縮、純化肝素的生產(chǎn)技術(shù)，還可用于粗品肝素的精制，改變了使用傳統(tǒng)的離子交換固定柱床吸附技術(shù)原料液中不能含有不溶性顆粒的限制。其原理在于吸附介質(zhì)顆粒在向上流動(dòng)的液體的作用下膨脹起來，吸附介質(zhì)顆粒在床體中均勻的懸浮，并按照不同的顆粒尺寸和密度形成梯度而有續(xù)的排列，形成一個(gè)均衡、穩(wěn)定的吸附環(huán)境，液體中的目標(biāo)肝素被吸附于介質(zhì)上，而細(xì)胞、細(xì)胞碎片、雜蛋白、核酸及雜多糖和其他的組織碎片將通過柱子而流出去，洗脫目標(biāo)肝素時(shí)從相反方向?qū)⑽浇橘|(zhì)壓緊，再用洗脫緩沖液將目標(biāo)肝素洗下來。擴(kuò)張柱床色譜技術(shù)兼有流化床和填充床的優(yōu)點(diǎn)，不需預(yù)先除去料液中的顆粒而可以直接從料液中吸附目標(biāo)產(chǎn)物。從而起到有效的吸附分離作用。擴(kuò)張柱床離子交換色譜技術(shù)不但可用于從哺乳動(dòng)物臟器勻漿液直接提取肝素，還可用于粗品肝素的精制。采用擴(kuò)張柱床離子交換色譜技術(shù)從哺乳動(dòng)物臟器勻漿液直接提取肝素和用粗品肝素精制肝素，大大降低了肝素純化工藝的復(fù)雜性，提高了產(chǎn)率，降低了生產(chǎn)成本。改變以往的國(guó)內(nèi)樹脂法精制肝素的生產(chǎn)中，基本上都是采用分批吸附的方法。分批吸附法理論塔板數(shù)低，柱效損失大，純化效率低，對(duì)目的分子吸附不夠充分，因此損失大。采用擴(kuò)張柱床離子交換色譜技術(shù)提取肝素，可將肝素與雜質(zhì)蛋白、核酸及其余硫酸多糖分離，濃縮，純化一次完成。減少工序，縮短時(shí)間，降低成本，提高效率和質(zhì)量。采用擴(kuò)張柱床離子交換色譜技術(shù)直接從勻漿液中提取肝素，肝素單位效價(jià)達(dá)到120U/mg以上，用粗品精制肝素，效價(jià)達(dá)到160U/mg以上，產(chǎn)品中紫外區(qū)雜質(zhì)(260nm，280nm)均滿足藥典要求；技術(shù)內(nèi)容(1)哺乳動(dòng)物小腸粘膜的勻漿液經(jīng)堿鹽水解、胰蛋白酶酶解(豬牛羊等哺乳動(dòng)物的肝臟肺臟的組織勻漿液加入0.1-0.5％木瓜蛋白酶)、高溫變性和過濾處理，經(jīng)過在一定離子濃度和PH條件下進(jìn)行擴(kuò)張柱床吸附層析法吸附、濃縮、純化肝素，乙醇沉淀，丙酮脫水，低溫干燥。(2)粗品肝素經(jīng)堿鹽水和胰蛋白酶處理、高溫變性和過濾處理，后經(jīng)過在一定離子濃度和PH條件下進(jìn)行擴(kuò)張柱床吸附層析法吸附、濃縮、純化肝素，乙醇沉淀，丙酮脫水，低溫干燥。工藝流程粗品制備a)豬、牛、羊等哺乳動(dòng)物的小腸粘膜或肝、肺等臟器的組織勻漿液50g左右加水至250L，加入NaCI至1％-8％，攪拌、靜置、過濾。腸粘膜濾液加入0.1-0.5％胰蛋白酶(肝臟肺臟的組織勻漿液加入0.1-0.5％木瓜蛋白酶)。b)在pH7.5-10.5，35-45℃下酶解數(shù)小時(shí)，NaOH調(diào)pH至8.0-10.0，升溫至50-55℃，保溫2-4h，不斷攪拌，然后快速升溫到92-95℃，保持10-15min，趁熱用80目濾網(wǎng)過濾，濾液(I)備用。c)擴(kuò)張床柱Streamline50(5cm內(nèi)徑)、(購(gòu)自AmershamPharmaciaBiotech(瑞典))裝入已處理好的強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂?？刂茰囟?0-60℃，用蠕動(dòng)泵將pH為7.5-10.5，適量MTris-HCl緩沖液自柱床底部泵入，使樹脂擴(kuò)張并保持平衡。保持pH值不變，將適量濾液(I)加MTris-HCl緩沖液配制成NaCI為2-6％，pH為7.5-10.5的溶液，用蠕動(dòng)泵通進(jìn)擴(kuò)張交換柱中先平衡樹脂，然后反復(fù)進(jìn)行離子交換，流速約為每小時(shí)2倍柱床體積，直至流出液檢驗(yàn)無肝素，全部吸附在樹脂上為止。d)然后配制適量的的2-6％氯化鈉溶液，MTris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)pH3-5，以2～3個(gè)沉積床體積的緩沖液平衡/擴(kuò)張柱床后，以5-6倍沉積床體積的緩沖液除雜，整個(gè)過程控制溫度15-25℃，流速約為每小時(shí)2.5柱床體積。e)關(guān)掉蠕動(dòng)泵，使D254樹脂重新沉積，調(diào)節(jié)活塞至剛好在沉積床的表面，然后以向下的液流和沉積床的狀態(tài)進(jìn)行洗脫。樹脂先用約4倍柱床體積的3-8％的氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。再用約2倍柱床體積的2-7％氯化鈉溶液(用量先多后少)同法洗脫2次。合并全部洗脫液，調(diào)節(jié)pH為6。f)按洗脫液體積加入1.0倍量的預(yù)冷乙醇，沉淀過夜。g)次日吸除乙醇。沉淀物用2％氯化鈉溶液溶解，調(diào)pH至6.0。按溶液體積加0.7倍乙醇，沉淀過夜。h)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用無水乙醇、丙酮洗滌脫水。真空干燥后得肝素，效價(jià)為120U/mg以上。精品制備a)將效價(jià)為60-100U/mg左右的肝素粗品以1∶10的比例溶于3％的氯化鈉溶液中，然后再用2％的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至8-11，于室溫靜置數(shù)小時(shí)，真空抽濾，去沉淀物，濾液待用。b)在上述清液中加入0.01-0.1％胰蛋白酶，在pH7-10，35-45℃酶解數(shù)小時(shí)，升溫98-100℃，10-15min，趁熱真空抽濾，濾液備用。c)擴(kuò)張床柱Streamline50(5cm內(nèi)徑)、(購(gòu)自AmershamPharmaciaBiotech(瑞典))裝入已處理好的強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂，用蠕動(dòng)泵將pH7-10，適量MTris-HCl緩沖液自柱床底部泵入，使樹脂擴(kuò)張并保持平衡。d)控制溫度40-60℃，將適量濾液加MTris-HCl緩沖液配制pH為7.5-10.5的溶液，用蠕動(dòng)泵通進(jìn)擴(kuò)張交換柱中反復(fù)進(jìn)行離子交換，交換過程中保持pH值與溫度恒定，流速約為每小時(shí)2倍柱床體積，直至流出液檢驗(yàn)無肝素，全部吸附在樹脂上為止。e)然后配制適量的預(yù)冷的2-6％氯化鈉溶液，MTris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)pH1-3，以2～3個(gè)沉積床體積的緩沖液平衡/擴(kuò)張柱床后，以5-6倍沉積床體積的緩沖液除雜，整個(gè)過程控制溫度2-5℃，流速約為每小時(shí)2.5柱床體積。f)關(guān)掉蠕動(dòng)泵，使樹脂重新沉積，調(diào)節(jié)活塞至剛好在沉積床的表面，然后以向下的液流和沉積床的狀態(tài)進(jìn)行洗脫。樹脂先用用約4倍柱床體積的2-6％氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。再用約2倍柱床體積的2-6％氯化鈉溶液(用量先多后少)同法洗脫2次。合并全部洗脫液，調(diào)節(jié)pH為6。g)按洗脫液體積加入1.0倍量的預(yù)冷乙醇，沉淀過夜。h)次日吸除乙醇。沉淀物用2％氯化鈉溶液溶解，調(diào)pH至6.0。按溶液體積加0.7倍乙醇，沉淀過夜，i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用無水乙醇、丙酮洗滌脫水。真空干燥后得精品肝素，效價(jià)為150U/mg以上；如權(quán)利要求1所述擴(kuò)張柱床離子交換色譜技術(shù)的原料為豬、牛、羊等哺乳動(dòng)物的小腸粘膜、肝、肺臟等臟器和粗品肝素；2.如權(quán)利要求1所述的濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝，其特征在于擴(kuò)張柱床離子交換色譜技術(shù)用于粗品的加工和精品的制備過程。3.如權(quán)利要求1所述的濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝，其特征在于擴(kuò)張柱床離子交換色譜技術(shù)使用強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂作為吸附介質(zhì)。4.如權(quán)利要求1所述的濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝，其特征在于擴(kuò)張柱床離子交換色譜技術(shù)處理的肝素，可以是鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋰鹽等任何肝素的鹽類。5.如權(quán)利要求1所述的濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝，其特征在于此技術(shù)肝素的處理采用擴(kuò)張柱床色譜技術(shù)。6.如權(quán)利要求1所述的濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝，其特征在于此技術(shù)肝素的處理采用擴(kuò)張柱床和離子交換樹脂技術(shù)。7.如權(quán)利要求1所述的濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝，其特征在于此技術(shù)在肝素的進(jìn)一步處理過程中使用胰蛋白酶進(jìn)一步酶解雜蛋白。8.如權(quán)利要求1所述的濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝，其特征在于此技術(shù)采用不同濃度的NaCl和Mtris-HCI緩沖液配合使用達(dá)到上樣、除雜、洗脫在一個(gè)工序中完成。全文摘要本發(fā)明公開了一種濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝，利用擴(kuò)張柱床技術(shù)在粗品肝素的溶液中，將肝素與雜質(zhì)蛋白、核酸及其余硫酸多糖分離，濃縮，純化一次完成。改變傳統(tǒng)的鹽解-離子交換樹脂法多步驟完成的工藝。采用擴(kuò)張柱床離子交換樹脂工藝分離濃縮純化精品肝素，采用乙醇沉淀、丙酮脫水，肝素效價(jià)＞180IU/mg。采用擴(kuò)張柱床離子交換樹脂工藝減少工序，縮短時(shí)間，降低成本，提高效率和質(zhì)量。文檔編號(hào)C08B37/10GK101831009SQ20101016804公開日2010年9月15日申請(qǐng)日期2010年5月11日優(yōu)先權(quán)日2010年5月11日發(fā)明者嚴(yán)歡,盧耀勤,來海中,趙文軍申請(qǐng)人:新疆立實(shí)生物科技有限公司