本申請(qǐng)要求2014年3月12日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)61/951,650的優(yōu)先權(quán)。以上提及的申請(qǐng)通過引用如同完整重申地被并入本文。本文引用的所有參考文獻(xiàn)(包括但不限于專利和專利申請(qǐng))通過引用以其整體并入。

背景

幾十年來，已經(jīng)運(yùn)用了相當(dāng)大的努力來理解靶組織諸如乳腺和子宮內(nèi)膜中孕酮(progesterone)信號(hào)傳導(dǎo)的分子機(jī)理。孕酮通過其細(xì)胞核受體(PR)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，所述細(xì)胞核受體(PR)與染色質(zhì)上特異性靶位點(diǎn)締合。PR結(jié)合的共有脫氧核糖核酸(DNA)序列(孕酮應(yīng)答元件(PRE))由反向重復(fù)序列：RGNACAnnnTGTNCY中的6個(gè)核酸堿基對(duì)組成[1,2,3]。DNA結(jié)合的PR招募轉(zhuǎn)錄輔激活物(co-activator)和相關(guān)的輔因子(co-factor)，其修飾局部的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)并且有利于轉(zhuǎn)錄活化，導(dǎo)致PR靶基因的活化或阻遏[4,5,6,7]。除了通過蛋白-蛋白相互作用與PR調(diào)節(jié)復(fù)合物締合的輔調(diào)節(jié)物(co-regulator)和輔因子之外，PR招募染色質(zhì)重塑因子，其修飾局部DNA架構(gòu)以增強(qiáng)PR相互作用和轉(zhuǎn)錄活化[8]。已知參與在孕激素(progestin)調(diào)節(jié)位點(diǎn)的染色質(zhì)重塑的因子包括SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物[8,9]和轉(zhuǎn)錄因子NF1，所述轉(zhuǎn)錄因子NF1與PR合作用于MMTV的結(jié)合和活化[10,11]。對(duì)于其他細(xì)胞核受體包括雌激素受體(ER)和雄激素受體(AR)，先鋒因子(pioneer factor)諸如FOXA1(其與凝聚染色質(zhì)相互作用)是轉(zhuǎn)錄靶的細(xì)胞核受體活化必需的[12,13,14,15,16,17]。除了在PRE與DNA直接相互作用之外，已報(bào)道PR經(jīng)由與其他轉(zhuǎn)錄因子，包括AP-1、SP1和Stat3的拴系而與靶基因締合[18,19,20,21,22]。

盡管已經(jīng)描述了體外管理PR的轉(zhuǎn)錄活性的決定因素，對(duì)于體內(nèi)孕酮的多形作用(pleomorphic role)的分子基礎(chǔ)知之甚少。孕酮對(duì)于正常的生殖組織的功能是必需的[23]，并且在子宮中支持分化以及抑制子宮內(nèi)膜的增殖[24]。與之相比，在乳腺中，孕酮與增加的增殖、導(dǎo)管側(cè)分支和小葉肺泡發(fā)育相關(guān)[25]。與孕酮在這兩個(gè)組織中的不同作用一致，在乳腺和子宮內(nèi)膜中存在對(duì)孕酮的不同的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答[23,26,27,28,29,30]。

暴露于激素替代療法中的外源孕激素與增加的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[31,32,33,34,35]。有趣的是，與正常的乳腺相比，在乳腺癌細(xì)胞中孕激素調(diào)節(jié)不同的轉(zhuǎn)錄組[36]，所以似乎合理的是，孕激素對(duì)乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的影響可以通過癌前和/或癌性乳腺組織中孕激素作用的改變的特異性來介導(dǎo)。如果PR的改變的細(xì)胞特異性構(gòu)成孕激素對(duì)乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的不利影響的基礎(chǔ)，那么孕激素作用的細(xì)胞特異性的決定因素則需要闡明。

概述

在一方面，提供了用于鑒定多種組織類型中活化的孕酮受體的系統(tǒng)和方法。在另一方面，腫瘤組織中活化的孕酮受體通過檢測(cè)孕酮受體與基因組(DNA)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合來鑒定。這些示例性系統(tǒng)和方法可被用于鑒定和治療懷疑患有對(duì)通過抗孕激素(例如，奧那司酮、洛那立生、米非司酮、PF-02413873、特拉司酮、利洛司酮、ORG2058、asoprisnil、烏利司他、ZM172406、ZM150271、ZM172405和阿來司酮)的生長(zhǎng)抑制和癌細(xì)胞凋亡敏感的惡性腫瘤的患者。在一方面，懷疑患有對(duì)通過抗孕激素的生長(zhǎng)抑制敏感的惡性腫瘤(癌癥)的患者可以用抗孕激素治療。在另一方面，對(duì)用抗孕激素的治療敏感的癌癥，包括但不限于乳腺、腦、腦膜瘤、前列腺、卵巢、子宮內(nèi)膜、子宮肉瘤、子宮平滑肌瘤和肺。在另一方面，抗孕激素可以以每天從約10mg到約200mg的量向患者施用。任選地，抗腫瘤化合物(例如，依維莫司、曲妥珠單抗、TM1-D、抗HER2藥物、貝伐單抗、紫杉醇、多西他賽、紫杉烷、阿霉素、脂質(zhì)體阿霉素、聚乙二醇化脂質(zhì)體阿霉素、蒽環(huán)類、蒽二酮、卡鉑、順鉑、5-FU、吉西他濱、環(huán)磷酰胺、抗雌激素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、芳香化酶抑制劑和抗雄激素)還可以與用抗孕激素的治療同時(shí)地、在其之前或在其之后向患者施用。

本文描述的方面提供了用于鑒定對(duì)用抗孕激素治療敏感的癌癥和腫瘤的方法和系統(tǒng)。在一方面，如本文描述的與特定基因組DNA區(qū)域結(jié)合的活化的孕酮受體或PR，可被鑒定和定量以鑒定對(duì)用抗孕激素治療敏感的惡性腫瘤。

在另一方面，測(cè)試樣品中特定基因組DNA區(qū)域的定量為例如比測(cè)定中的比較陰性對(duì)照參考樣品中的相同的特定區(qū)域的檢測(cè)大至少約四倍的水平，指示活化的PR的存在。用于此類定量的示例性比較陰性對(duì)照樣品(在一方面，本文統(tǒng)稱為“對(duì)照DNA序列”)包括但不限于(1)來自例如在ChIP-seq測(cè)定(如本文描述的)中的預(yù)清潔的樣品(a pre-cleared sample)的分離的輸入基因組DNA；和(2)在例如在非特異性免疫球蛋白或無一抗的存在下進(jìn)行的并且在其他方面以與測(cè)試樣品的特異性PR染色質(zhì)免疫沉淀相同的方式處理的ChIP-PCR測(cè)定中的測(cè)試樣品的染色質(zhì)免疫沉淀物。

在又另一方面，適合本文使用的抗孕激素包括但不限于：

奧那司酮(例如，(8S,11R,13R,14S,17S)-11-[4-(二甲氨基)苯基]-17-羥基-17-(3-羥丙基)-13-甲基-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-十氫環(huán)戊并[a]菲-3-酮)具有以下的化學(xué)結(jié)構(gòu)：

其他抗孕激素包括：促孕的3-(6,6-亞乙基-17B-羥基-3-氧代-17A-孕甾-4-烯-17A-基)丙酸G-內(nèi)酯、3-(6,6-亞乙基-17.β.-羥基-3-氧代-17.α.-孕甾-4-烯-17.α.-基)丙酸.γ.-內(nèi)酯和以下：

米非司酮

(10S,11S,14S,15S,17R)-17-[4-(二甲氨基)苯基]-14-羥基-15-甲基-14-(丙-1-炔-1-基)四環(huán)[8.7.0.0^{2,7}.0^{11,15}]十七碳-1,6-二烯-5-酮

利洛司酮

(11-β,17-β,17(z))-丙烯基)；雌甾-4,9-二烯-3-酮、11-(4-(二甲氨基)苯基)-17-羥基-17-(3-羥基-1-丙烯基；11β-[4-(二甲氨基)苯基]-17β-羥基-17-[(Z)-3-羥基-1-丙烯基]雌甾-4,9-二烯-3-酮

ORG2058

(8R,9S,10R,13S,14S,16R,17S)-16-乙基-17-(2-羥基乙?；?-13-甲基-2,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16,17-十二氫-1H-環(huán)戊并[a]菲-3-酮

洛那立生

(8S,11R,13S,14S,17S)-11-(4-乙?；交?-17-羥基-13-甲基-17-(1,1,2,2,2-五氟乙基)-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-十氫環(huán)戊并[a]菲-3-酮

Asoprisnil

(8S,11R,13S,14S,17S)-11-[4-[(E)-羥基亞氨基甲基]苯基]-17-甲氧基-17-(甲氧基甲基)-13-甲基-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-十氫環(huán)戊并[a]菲-3-酮

烏利司他

(8S,11R,13S,14S,17R)-17-乙酰基-11-[4-(二甲氨基)苯基]-17-羥基-13-甲基-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-十氫環(huán)戊并[a]菲-3-酮

PF-2413873

4-[3-環(huán)丙基-1-(甲磺?；谆?-5-甲基-1H-吡唑-4-基]氧基,-2,6-二甲基芐腈

阿來司酮(8S,11R,13S,14S,17R)-11-(4-二甲基氨基苯基)-17-羥基-13-甲基-17-[(Z)-丙-1-烯基]-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-十氫環(huán)戊并[a]菲-3-酮：

另外的抗孕激素包括以下：

ZM172406–(R)-N-(3-氯-4-氰基苯基-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺：

ZM172405–(S)-N-(3-氯-4-氰基苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺：

ZM150271–N-(3-氯-4-氰基苯基)-3,3,3,-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺：

卵巢激素孕酮的轉(zhuǎn)錄作用是多效的，并且與細(xì)胞核孕酮受體(PR)(一種配體活化的轉(zhuǎn)錄因子)的DNA結(jié)合，導(dǎo)致多種靶組織中的多種結(jié)果。為了確定促成PR轉(zhuǎn)錄組的細(xì)胞特異性的PR的基因組相互作用的不同模式，我們比較了乳腺癌細(xì)胞和永生化正常乳腺細(xì)胞中PR的基因組結(jié)合位點(diǎn)。在兩個(gè)細(xì)胞系中，PR結(jié)合與轉(zhuǎn)錄結(jié)果相關(guān)，其中60％的孕激素調(diào)節(jié)基因與一個(gè)或更多個(gè)PR結(jié)合區(qū)域相關(guān)。

在兩個(gè)細(xì)胞系的PR順反組(cistrome)之間存在出乎意料地低的重疊并且在轉(zhuǎn)錄靶中存在類似地低的重疊。在來自乳腺癌和正常的乳腺細(xì)胞系二者的PR DNA結(jié)合區(qū)域中鑒定了保守的PR結(jié)合元件(DNA的區(qū)域)，但存在不同模式的已知的輔因子結(jié)合基序的富集，其中FOXA1位點(diǎn)在乳腺癌細(xì)胞結(jié)合區(qū)域中過度代表(over-represented)，且NF1和AP-1基序在永生化正常細(xì)胞系中獨(dú)特地富集。下游分析表明，不同的輔因子可用性可以產(chǎn)生這些不同的PR順反組(例如，基因組DNA上特定的孕酮受體結(jié)合位點(diǎn))，暗示輔因子水平可以調(diào)節(jié)PR對(duì)DNA結(jié)合區(qū)域的特異性。PR結(jié)合的細(xì)胞特異性可以由關(guān)鍵的結(jié)合輔因子的協(xié)調(diào)作用決定。該信息還可被用于鑒定和治療懷疑患有對(duì)通過抗孕激素(例如，奧那司酮、洛那立生、米非司酮、PF-02413873、特拉司酮、利洛司酮、ORG2058、asoprisnil、烏利司他、ZM172406、ZM150271、ZM172405和阿來司酮)的生長(zhǎng)抑制敏感的腫瘤的患者。

附圖

圖1A和1B圖解了T-47D和AB32細(xì)胞中各個(gè)PR結(jié)合區(qū)域距最近的基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)的距離的分布，如圖1A和1B中分別示出的；

圖1C和1D圖解了T-47D(圖1C)和AB32(圖1D)中結(jié)合區(qū)域?qū)γ咳旧w基因數(shù)目的線性回歸分析；

圖1E圖解了結(jié)合到上調(diào)基因的PR的中值距離；

圖1F圖解了相對(duì)于AB32細(xì)胞中上調(diào)和下調(diào)基因的結(jié)合區(qū)域分布；

圖2A-F圖解了在用10nM ORG2058處理后的2小時(shí)、6小時(shí)和24小時(shí)確定的T-47D和AB32細(xì)胞中的基因表達(dá)譜；

圖3A圖解了在T-47D和AB32細(xì)胞之間共有的PR結(jié)合區(qū)域；

圖3B圖解了在用10nM ORG2058(ORG)或媒介物處理持續(xù)2小時(shí)、6小時(shí)和24小時(shí)的T-47D和AB32細(xì)胞中通過全基因組微陣列測(cè)量的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)；

圖3C圖解了在2小時(shí)、6小時(shí)或24小時(shí)在T-47D和AB32細(xì)胞中受到孕激素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本之間的重疊；

圖3D圖解了在單獨(dú)的處理時(shí)間在T-47D和AB32中孕激素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本的數(shù)目；

圖4A圖解了在T-47D和AB32細(xì)胞中的結(jié)合區(qū)域中鑒定的全長(zhǎng)和核心PRE；

圖4B-C圖解了使用MEME-ChIP和Homer分析PR結(jié)合區(qū)域序列的保守的序列基序的統(tǒng)計(jì)富集；

圖4D-E圖解了PRE分類為強(qiáng)的、中等的、或弱的/不存在的；

圖5A圖解了在FOXA1的存在和不存在下，在AB32細(xì)胞中響應(yīng)孕激素的轉(zhuǎn)錄譜的無監(jiān)督聚簇分析；

圖5B圖解了與T-47D細(xì)胞中的內(nèi)源表達(dá)相比，在病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)之前和之后，在AB32細(xì)胞和親本MCF-10A細(xì)胞中的FOXA1蛋白表達(dá)；

圖5C圖解了在FOXA1的存在和不存在下，AB32細(xì)胞中孕激素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本的數(shù)目；

圖5D圖解了在PR、ER和FOXA1結(jié)合位點(diǎn)的FOXA1結(jié)合強(qiáng)度的比較；

圖5E圖解了針對(duì)隨著FOXA1表達(dá)丟失、獲得或保持孕激素調(diào)節(jié)的基因，PR結(jié)合區(qū)域與AB32細(xì)胞中被調(diào)節(jié)的基因的比率；

圖5F圖解了從AB32中PR結(jié)合區(qū)域到隨著FOXA1表達(dá)丟失、獲得或保持孕激素調(diào)節(jié)的基因的距離；

圖6圖解了孕酮受體(PR)結(jié)合與T-47D和AB32細(xì)胞中染色體分布相關(guān)；

圖7圖解了PR結(jié)合和孕激素調(diào)節(jié)的時(shí)間之間的關(guān)系；

圖8圖解了PR結(jié)合區(qū)域的位置；

圖9圖解了T-47D細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的模式；

圖10圖解了AB32細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的模式；

圖11圖解了在T-47D和AB32細(xì)胞中的PR結(jié)合區(qū)域；

圖12圖解了驗(yàn)證在ChIP-seq中鑒定的細(xì)胞類型特異性的PR結(jié)合區(qū)域；

圖13圖解了ORG2058處理的T-47D和AB32細(xì)胞中PR結(jié)合區(qū)域與孕酮(P4)處理之后T-47D細(xì)胞中的結(jié)合的重疊；

圖14圖解了在另外的乳腺細(xì)胞系中基因表達(dá)的孕激素調(diào)節(jié)；

圖15圖解了在T-47D和AB32細(xì)胞中在調(diào)節(jié)相關(guān)的結(jié)合位點(diǎn)中PRE和輔因子基序的富集；

圖16圖解了在T-47D和AB32細(xì)胞中的PR結(jié)合區(qū)域中PRE位置的分布；

圖17是圖解PRE強(qiáng)度不預(yù)測(cè)PR結(jié)合的示例性實(shí)驗(yàn)；

圖18圖解了細(xì)胞系中FOXA1轉(zhuǎn)錄本表達(dá)；

圖19圖解了在具有或不具有預(yù)測(cè)的FOXA1基序的PR結(jié)合區(qū)域處的FOXA1結(jié)合；和

圖20圖解了在T-47D、AB32和AB9細(xì)胞中的PR表達(dá)；

圖21示出了HCC1428乳腺癌細(xì)胞中的T-47D中活化的PR的ChIP驗(yàn)證；

圖22提供了T-47D和HCC1428乳腺癌細(xì)胞中ChIP驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的總結(jié)；

圖23提供了證實(shí)T-47D和HCC1428乳腺癌細(xì)胞中PR活化特征(signature)的PR結(jié)合靶的示例性列表；和

圖24示出了奧那司酮對(duì)T-47D和HCC1428乳腺癌細(xì)胞中通過ORG2058配合的孕酮受體的結(jié)合的影響。

描述

在一方面，PR結(jié)合的應(yīng)答元件的DNA序列、轉(zhuǎn)錄輔因子的可用性和靶細(xì)胞的染色質(zhì)架構(gòu)對(duì)PR轉(zhuǎn)錄組的特異性具有組合的作用。在另一方面，正常乳腺細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中孕酮受體(PR)應(yīng)答元件、轉(zhuǎn)錄輔因子和染色質(zhì)架構(gòu)的貢獻(xiàn)可使用與高通量測(cè)序聯(lián)合的全基因組PR染色質(zhì)免疫沉淀比較示例性乳腺癌細(xì)胞系(T-47D)和永生化正常乳腺細(xì)胞中基因組DNA上的PR相互作用來確定，所述永生化正常乳腺細(xì)胞穩(wěn)定地表達(dá)PR-A和PR-B亞型二者(AB32，MCF-10A的穩(wěn)定的PR表達(dá)克隆)。在又另一方面，鑒定并且表征了示例性PR順反組。這些PR順反組可以被用于例如鑒定患有對(duì)用如本文描述的抗孕激素治療敏感的惡性腫瘤(例如，乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌和子宮肉瘤)的患者。鑒定和治療對(duì)用抗孕激素治療敏感的患者可以影響此類患者中癌癥的發(fā)展、增殖、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

多種正常的和腫瘤發(fā)生的組織中的孕酮受體的活性和狀態(tài)可被預(yù)測(cè)。參見例如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?3/644,872，其通過引用以其整體并入本文。該信息可被用于鑒定和治療懷疑患有對(duì)通過抗孕激素(例如，奧那司酮、洛那立生、米非司酮、PF-02413873、特拉司酮、利洛司酮、ORG2058、asoprisnil、烏利司他、ZM172406、ZM150271、ZM172405和阿來司酮)的生長(zhǎng)抑制敏感的腫瘤的患者。在本文的一方面，我們描述了用于通過以下確定孕酮受體的活性和狀態(tài)的方法和系統(tǒng)：使取自患者的懷疑是腫瘤發(fā)生或癌性的組織樣品中的孕酮受體與基因組DNA靶結(jié)合；檢測(cè)在組織樣品中和在陰性對(duì)照樣品中一個(gè)或更多個(gè)活化的孕酮受體締合的DNA靶的水平或豐度；和如果一個(gè)或更多個(gè)活化的孕酮受體締合的DNA靶的水平或豐度比陰性對(duì)照樣品中的水平大至少約4倍或統(tǒng)計(jì)上顯著地大于陰性對(duì)照樣品中的，則向患者施用抗孕激素。

在一方面，術(shù)語“順反組(cistrome)”指基因組內(nèi)的DNA區(qū)域的集合，所述DNA區(qū)域被特定的順式作用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物(例如，PR)結(jié)合。

如本文使用的，術(shù)語“活化的孕酮受體締合的DNA靶”指基因組DNA的區(qū)域，孕酮受體能夠與所述基因組DNA的區(qū)域結(jié)合，并且與基因組DNA的對(duì)照區(qū)域相比，所述基因組DNA的區(qū)域與孕酮受體順反組的轉(zhuǎn)錄的增加相關(guān)。

術(shù)語“施用”指提供一種藥物或更多種藥物，開一種或更多種藥物的處方，或?qū)⒁环N或更多種藥物放置在處方集(formulary)上。術(shù)語“提供”指通過任何合適的施用途徑(例如，口服、注射、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)和經(jīng)皮等)向患者直接分配藥物，或向患者提供進(jìn)行所述分配的說明。

術(shù)語“孕激素(progestin)”指模擬孕酮(progesterone)的一些或全部作用的天然的或合成的促孕物質(zhì)，還被稱作孕酮受體調(diào)節(jié)劑(PRM)或選擇性孕酮受體調(diào)節(jié)劑(SPRM)。

術(shù)語“抗孕激素”指抑制促孕劑的形成、轉(zhuǎn)運(yùn)或作用或使促孕劑失活的物質(zhì)，包括但不限于奧那司酮、洛那立生、米非司酮、PF-02413873、特拉司酮、利洛司酮、ORG2058、asoprisnil、烏利司他、ZM172406、ZM150271、ZM172405和阿來司酮。PRM或SPRM可以具有一些抗孕激素性質(zhì)，并且取決于使用的環(huán)境可以被認(rèn)為是抗孕激素或孕激素。

術(shù)語“結(jié)合(bind)”或“結(jié)合(binding)”指分子或化學(xué)化合物上的一個(gè)或更多個(gè)部分通過相互作用或化學(xué)鍵(例如，氫鍵、疏水鍵、離子鍵和共價(jià)鍵)的締合?！敖宦?lián)(cross-link)”或“交聯(lián)(cross-linking)”可以是“結(jié)合(bind)”或“結(jié)合(binding)”的一種形式。

本文提供了用于確定患者是否對(duì)用抗孕激素治療敏感的方法和系統(tǒng)。在一方面，用抗孕激素治療患者的方法包括：從患者獲得懷疑是腫瘤發(fā)生或癌性的組織樣品；使組織樣品中的孕酮受體與基因組DNA結(jié)合；檢測(cè)組織樣品中與孕酮受體締合的基因組DNA；檢測(cè)組織樣品中和陰性對(duì)照樣品中一個(gè)或更多個(gè)活化的孕酮受體締合的DNA靶的轉(zhuǎn)錄或豐度水平；和如果一個(gè)或更多個(gè)活化的孕酮受體締合的DNA靶的水平比陰性對(duì)照樣品中的水平大至少約4倍或統(tǒng)計(jì)上顯著地大于陰性對(duì)照樣品中的水平，則向患者施用抗孕激素。

組織樣品或活組織檢查物可以從患者獲得，例如由外科醫(yī)生、內(nèi)科醫(yī)生、護(hù)士或醫(yī)務(wù)人員從懷疑患有腫瘤或呈現(xiàn)癌癥或其他異常細(xì)胞生長(zhǎng)的癥狀的患者獲得。

組織樣品可以通過例如，機(jī)械破壞和通過暴露于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的1％的甲醛交聯(lián)樣品被處理或制備用于分析。樣品可以重懸在裂解緩沖液中，并且可以通過聲處理使基因組DNA片段化。

通過與抗PR一抗一起孵育，孕酮受體(PR)結(jié)合的基因組DNA可被免疫沉淀，所述抗PR一抗與二抗-磁珠綴合物絡(luò)合。在一方面，可以使用至少一式兩份測(cè)定(determinations)和含有樣品而不使用一抗的匹配的陰性對(duì)照孵育物進(jìn)行測(cè)定。磁珠復(fù)合物可以用緩沖液洗滌以減少非特異性信號(hào)。

基因組DNA可以通過以下從磁珠洗脫：例如，將珠與洗脫緩沖液(1％SDS、0.1M NaHCO₃)在室溫孵育兩次，持續(xù)15min，以及收集含有分離的基因組DNA的洗脫液。交聯(lián)可以通過在高鹽存在下加熱到例如65℃持續(xù)至少四小時(shí)被逆轉(zhuǎn)。基因組DNA片段可以使用PCR純化試劑，例如由Qiagen提供的QIAquick PCR純化試劑盒純化。

活化的PR締合的DNA靶可以使用與活化的PR締合的DNA靶互補(bǔ)的寡核苷酸引物，通過定量實(shí)時(shí)PCR來檢測(cè)。在一方面，樣品以一式三份被擴(kuò)增。在另一方面，至少四個(gè)活化的PR締合的DNA靶被選擇。

測(cè)試樣品中活化的PR締合的DNA靶的豐度可相對(duì)于在特異性一抗不存在下孵育的陰性對(duì)照/參考樣品被確定。在一方面，倍數(shù)差異＝2^-(平均Ct^測(cè)試-平均Ct^參考)。倍數(shù)差異的統(tǒng)計(jì)顯著性可例如，通過不成對(duì)的重復(fù)計(jì)數(shù)測(cè)定(unpaired replicate count determination)的學(xué)生t檢驗(yàn)被確定。在一方面，約四倍或更大的倍數(shù)差異和小于0.05的p值指示活化的PR的存在。

在另一方面，如果檢測(cè)到活化的PR，則可以向患者施用抗孕激素。

在又另一方面，組織樣品選自由以下組成的組：乳腺、腦、腦膜瘤、前列腺、卵巢、子宮內(nèi)膜、子宮肉瘤、子宮平滑肌瘤和肺部組織。

在一方面，抗孕酮選自由以下組成的組：奧那司酮、洛那立生、米非司酮、PF-02413873、特拉司酮、利洛司酮、ORG2058、asoprisnil、烏利司他、ZM172406、ZM150271、ZM172405和阿來司酮。

在另一方面，抗孕激素以每天從約10mg到約200mg的量向患者施用。

在又另一方面，除了抗孕激素之外，抗腫瘤化合物(例如，依維莫司、曲妥珠單抗、TM1-D、抗HER2藥物、貝伐單抗、紫杉醇、多西他賽、紫杉烷、阿霉素、脂質(zhì)體阿霉素、聚乙二醇化脂質(zhì)體阿霉素、蒽環(huán)類、蒽二酮、卡鉑、順鉑、5-FU、吉西他濱、環(huán)磷酰胺、抗雌激素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、芳香化酶抑制劑和抗雄激素)可以被施用或共施用至患者。

在一方面，活化的孕酮受體締合的DNA靶包括靠近ACSL1和PACSIN1的PR結(jié)合區(qū)域。

在另一方面，可以使用單克隆抗PR抗體，例如hPRa6和hPRa7進(jìn)行免疫沉淀。

其他方面提供了用于確定組織樣品中孕酮受體的活化狀態(tài)的系統(tǒng)。系統(tǒng)可以包括例如，抗PR一抗和針對(duì)一個(gè)或更多個(gè)活化的孕酮受體締合的DNA靶的一個(gè)或更多個(gè)寡核苷酸引物對(duì)。

在另一方面，寡核苷酸引物可以選自由以下組成的引物組：用于檢測(cè)靠近ACSL1和PACSIN1的結(jié)合區(qū)域的寡核苷酸引物。

其他方面提供了用于通過以下抑制對(duì)通過抗孕激素的生長(zhǎng)抑制敏感的腫瘤的生長(zhǎng)的方法：從患者的腫瘤獲得懷疑是腫瘤發(fā)生或癌性的組織樣品；使組織樣品中的孕酮受體與基因組DNA結(jié)合(例如，交聯(lián))；檢測(cè)組織樣品中與孕酮受體締合的基因組DNA；檢測(cè)組織樣品中和陰性對(duì)照樣品中一個(gè)或更多個(gè)活化的孕酮受體締合的DNA靶的水平；和如果一個(gè)或更多個(gè)活化的孕酮受體締合的DNA靶的水平比陰性對(duì)照樣品中的水平大至少約4倍或統(tǒng)計(jì)上顯著地大于陰性對(duì)照樣品中的水平，則向患者施用抗孕激素。

另外的方面提供了通過以下用抗孕激素治療患者的方法：從患者獲得懷疑是腫瘤發(fā)生或癌性的組織樣品；檢測(cè)組織樣品中與孕酮受體締合的基因組DNA；檢測(cè)一個(gè)或更多個(gè)活化的孕酮受體締合的DNA靶的豐度的水平，所述一個(gè)或更多個(gè)活化的孕酮受體締合的DNA靶選自由以下組成的組：T47D2822、T47D299、T47D3514、T47D4414、T47D4818、T47D5045和T47D5516(下表)；以及檢測(cè)組織樣品中的陰性對(duì)照測(cè)定中的相同DNA區(qū)域。如果一個(gè)或更多個(gè)活化的孕酮受體締合的DNA靶的轉(zhuǎn)錄水平比陰性對(duì)照中的相同DNA區(qū)域的水平大至少約4倍和/或統(tǒng)計(jì)上顯著地大于陰性對(duì)照中的，則可以向患者施用抗孕激素，所述一個(gè)或更多個(gè)活化的孕酮受體締合的DNA靶選自由以下組成的組：T47D2822、T47D299、T47D3514、T47D4414、T47D4818、T47D5045和T47D5516。

另外的方面提供了用抗孕激素治療患者的方法，所述方法包括：從患者獲得懷疑是腫瘤發(fā)生或癌性的組織樣品；檢測(cè)組織樣品中與孕酮受體締合的基因組DNA；檢測(cè)組織樣品中的一個(gè)或更多個(gè)活化的孕酮受體締合的DNA靶的第一轉(zhuǎn)錄水平，其中DNA靶選自由以下組成的組：T47D2822、T47D299、T47D3514、T47D4414、T47D4818、T47D5045和T47D5516；檢測(cè)陰性對(duì)照組織樣品中一個(gè)或更多個(gè)活化的孕酮受體締合的DNA靶的第二轉(zhuǎn)錄水平，其中DNA靶選自由以下組成的組：T47D2822、T47D299、T47D3514、T47D4414、T47D4818、T47D5045和T47D5516；比較第一轉(zhuǎn)錄水平和第二轉(zhuǎn)錄水平；和如果一個(gè)或更多個(gè)活化的孕酮受體締合的DNA靶的轉(zhuǎn)錄水平比陰性對(duì)照樣品中的水平大至少約4倍，則向患者施用抗孕激素。

在一方面，組織樣品選自由以下組成的組：乳腺、腦、腦膜瘤、前列腺、卵巢、子宮內(nèi)膜、子宮肉瘤、子宮平滑肌瘤和肺組織。

在另一方面，抗孕激素選自由以下組成的組：奧那司酮、洛那立生、米非司酮、PF-02413873、特拉司酮、利洛司酮、ORG2058、asoprisnil、烏利司他、ZM172406、ZM150271、ZM172405和阿來司酮。

在又另一方面，抗孕激素以每天從約10mg到約200mg的量向患者施用。

另外的方面提供了施用抗腫瘤化合物(例如，依維莫司、曲妥珠單抗、TM1-D、抗HER2藥物、貝伐單抗、紫杉醇、多西他賽、紫杉烷、阿霉素、脂質(zhì)體阿霉素、聚乙二醇化脂質(zhì)體阿霉素、蒽環(huán)類、蒽二酮、卡鉑、順鉑、5-FU、吉西他濱、環(huán)磷酰胺、抗雌激素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、芳香化酶抑制劑和抗雄激素)。

在一方面，檢測(cè)了輔因子結(jié)合基序(例如FOXA1)的存在。在另一方面，基因組DNA通過免疫沉淀檢測(cè)。免疫沉淀可以使用單克隆抗體(例如，hPRa6和hPRa7)進(jìn)行。在又另一方面，與基因組DNA締合的孕酮受體通過使用抗PR一抗的免疫沉淀檢測(cè)。

另外的方面提供了基本上分離的核酸，所述基本上分離的核酸包含選自由以下組成的組的核酸：T47D2822、T47D299、T47D3514、T47D4414、T47D4818、T47D5045和T47D5516。核酸可以是例如DNA或RNA。核酸可以與選自由以下組成的組的核酸互補(bǔ)：T47D2822、T47D299、T47D3514、T47D4414、T47D4818、T47D5045和T47D5516。

另外的方面提供了用于檢測(cè)核酸的轉(zhuǎn)錄水平的試劑盒，所述核酸選自由以下組成的組：T47D2822、T47D299、T47D3514、T47D4414、T47D4818、T47D5045和T47D5516。在一方面，試劑盒包含選自由以下組成的組的核酸：T47D2822、T47D299、T47D3514、T47D4414、T47D4818、T47D5045和T47D5516；和用于檢測(cè)基因組DNA靶的存在的單克隆抗體(例如，hPRa6和hPRa7)。

在描述本文描述的若干示例性方面之前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于以下描述中陳述的結(jié)構(gòu)或方法步驟的細(xì)節(jié)。本文描述的方面能夠以多種方式被實(shí)踐或?qū)嵤?/p>

實(shí)施例

實(shí)施例1-全基因組PR相互作用譜的產(chǎn)生

在一方面，繪制T-47D乳腺癌細(xì)胞和AB32細(xì)胞系中的PR基因組相互作用的圖譜，所述AB32細(xì)胞系是MCF-10A永生化正常乳腺細(xì)胞系的穩(wěn)定的PR表達(dá)克隆。用孕激素ORG2058(10nM，45分鐘)處理細(xì)胞，隨后為PR染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)和Illumina測(cè)序。將序列與人類基因組比對(duì)，并且使用Bowtie[37]和ERANGE[38]軟件工具鑒定比對(duì)中富集的基因組區(qū)域(錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率0.27％)。

在T-47D細(xì)胞中，鑒定出6312個(gè)PR結(jié)合峰，且在AB32細(xì)胞中檢測(cè)到8117個(gè)結(jié)合區(qū)域(表1)。大多數(shù)PR結(jié)合區(qū)域(T-47D中的88％和AB32中的73％)在最靠近的基因的100kb以內(nèi)，其中T-47D中57％的結(jié)合區(qū)域和AB32中54％的結(jié)合區(qū)域在50kb以內(nèi)。然而，少許結(jié)合區(qū)域(T-47D中的21％和AB32中的20％)落在基因TSS的10kb以內(nèi)(表1)。T-47D和AB32細(xì)胞中各個(gè)PR結(jié)合區(qū)域距最靠近的基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)的距離的分布分別顯示在圖1A和1B中。

檢測(cè)了全部染色體上的PR結(jié)合區(qū)域，并且盡管觀察到一些可變性，每條染色體的結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目反映了染色體尺寸和該特定染色體上的基因的數(shù)目。T-47D(圖1C)和AB32(圖1D)細(xì)胞中每條染色體的結(jié)合區(qū)域?qū)驍?shù)目的線性回歸分析揭示了AB32細(xì)胞中與基因數(shù)目的較強(qiáng)的相關(guān)性(AB32中R2＝0.76，相比于T-47D中R2＝0.58)?？傮w說來，在兩個(gè)細(xì)胞系之間的每條染色體的結(jié)合區(qū)域的數(shù)目之間存在相關(guān)性(R2＝0.66，補(bǔ)充圖1)，然而注意到一些例外。相比于AB32，T-47D數(shù)據(jù)集中染色體2和8上的結(jié)合區(qū)域代表不足(under-represented)，而染色體11上的區(qū)域則過度代表。相比于AB32細(xì)胞，T-47D細(xì)胞的核型[39]顯示顯著的重排和重復(fù)，并且這可以部分地解釋觀察到的結(jié)合差異，因?yàn)門-47D細(xì)胞含有染色體11的4個(gè)拷貝而不是2個(gè)拷貝。然而，T-47D細(xì)胞中染色體2是正常的，然而與該染色體上的區(qū)域的結(jié)合是在AB32細(xì)胞中檢測(cè)到的頻率的一半。AB32中被PR結(jié)合的染色體2上的被調(diào)節(jié)的基因的功能注釋揭示了參與代謝的基因的富集(補(bǔ)充表1)，表明癌細(xì)胞系中對(duì)孕激素的改變的或減弱的代謝應(yīng)答。

實(shí)施例2-PR基因組相互作用和轉(zhuǎn)錄應(yīng)答之間的關(guān)系

在另一方面，與ChIP-seq平行進(jìn)行的基因表達(dá)譜分析揭示了PR結(jié)合區(qū)域集中在被調(diào)節(jié)的基因周圍。每個(gè)基因的PR結(jié)合區(qū)域的密度，例如，對(duì)于被調(diào)節(jié)的基因而言(每個(gè)被調(diào)節(jié)的基因的結(jié)合區(qū)域的密度：T-47D細(xì)胞中為2.23，AB32細(xì)胞中為2.19；表1)高于整體PR結(jié)合區(qū)域的密度(T-47D細(xì)胞中對(duì)于所有基因?yàn)槊炕?.73，AB32細(xì)胞中為0.74；表1)。另外，相比于所有基因的50kb以內(nèi)的PR結(jié)合區(qū)域的比例(T-47D細(xì)胞中57％的PR結(jié)合區(qū)域在TSS的50kb以內(nèi)，AB32細(xì)胞中為54％，表1)，PR結(jié)合峰更可能在被調(diào)節(jié)的基因中的基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的50kb以內(nèi)(T-47D和AB32細(xì)胞中被調(diào)節(jié)的基因的74％和69％)。

與靠近下調(diào)基因的區(qū)域相比，T-47D細(xì)胞中的PR結(jié)合區(qū)域平均更接近上調(diào)基因TSS。在T-47D細(xì)胞中，PR結(jié)合與上調(diào)基因的中值距離是44kb，而與下調(diào)基因的中值距離是75kb(圖1E)。這在該細(xì)胞系中距上調(diào)和下調(diào)基因的結(jié)合區(qū)域距離的累積頻率分布中的統(tǒng)計(jì)顯著整體差異中得到反映(圖1E，p＝0.001，柯爾莫哥洛夫-斯米爾諾夫(Kolmogorov-Smirnov)雙樣本檢驗(yàn))。相比之下，關(guān)于AB32細(xì)胞中的上調(diào)和下調(diào)基因，未觀察到結(jié)合區(qū)域分布中的顯著的差異(圖1F，p＝0.305)。

除了更接近上調(diào)基因的PR結(jié)合區(qū)域之外，存在靠近上調(diào)基因的更多的PR結(jié)合區(qū)域，例如，相比于1.5個(gè)結(jié)合區(qū)域每下調(diào)基因，T-47D細(xì)胞中為平均2.3個(gè)結(jié)合區(qū)域每上調(diào)基因；且AB32細(xì)胞中分別為2.4和1.9個(gè)平均區(qū)域每上調(diào)基因和每下調(diào)基因(表1)。此外，與下調(diào)基因相比(T-47D中50/98-51％的下調(diào)基因和AB32中325/621-52％的下調(diào)基因，表1)，更高比例的上調(diào)基因(T-47D中509/786-65％的上調(diào)基因和AB32中439/546-80％的上調(diào)基因)與PR結(jié)合區(qū)域締合。

實(shí)施例3-PR結(jié)合與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)

在另一方面，兩個(gè)細(xì)胞系中的大多數(shù)被調(diào)節(jié)的基因(T-47D中559/950(59％)和AB32中749/1249(60％)，圖2A和B，表1)在100kb以內(nèi)具有一個(gè)或更多個(gè)PR結(jié)合區(qū)域。在ORG2058處理之后的較早時(shí)間點(diǎn)，在PR結(jié)合和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性，表明受PR直接地調(diào)節(jié)的基因比為間接靶的那些基因更可能在轉(zhuǎn)錄水平上被及早檢測(cè)到(補(bǔ)充圖2)。這一關(guān)系在T-47D細(xì)胞中最強(qiáng)，且在AB32細(xì)胞中，這一關(guān)系僅對(duì)于相對(duì)靠近被調(diào)節(jié)的基因的TSS的結(jié)合區(qū)域是如此，如由兩個(gè)細(xì)胞系中在較早的時(shí)間的啟動(dòng)子近端PR結(jié)合區(qū)域(5’UTR并多達(dá)上游10kb)的較高代表性顯示的(圖2C和D)。

在另一個(gè)方面，關(guān)于基因內(nèi)和基因間區(qū)域的PR結(jié)合區(qū)域的整體分布在兩個(gè)細(xì)胞系中是類似的(補(bǔ)充圖3)：在被調(diào)節(jié)的基因的上游和5’UTR中觀察到最大比例的PR結(jié)合區(qū)域，代表與被調(diào)節(jié)的基因相關(guān)的區(qū)域的43％-45％。

T-47D細(xì)胞中與PR結(jié)合區(qū)域相關(guān)的孕激素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本的自組裝映射(SOM)聚簇分析(圖2E)和相應(yīng)的結(jié)合區(qū)域的分析顯示，與下調(diào)基因或在隨后的時(shí)間點(diǎn)被調(diào)節(jié)的基因的TSS相比，PR結(jié)合區(qū)域顯著地更接近快速上調(diào)的基因的TSS(克魯斯卡爾-沃利斯單因素方差分析，p值<0.001，圖2F-比較聚簇0-5和6-8)。所有孕激素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本的自組裝映射聚簇分析揭示了整體類似于通過與PR結(jié)合相關(guān)的基因的子集觀察到的調(diào)節(jié)模式的調(diào)節(jié)模式(圖9)。然而，在較大的數(shù)據(jù)集中檢測(cè)到26個(gè)轉(zhuǎn)錄本的聚簇，所述較大的數(shù)據(jù)集代表通過ORG2058在所有時(shí)間點(diǎn)減少，但在24h時(shí)開始回到基線水平的轉(zhuǎn)錄本。盡管該聚簇中的12個(gè)轉(zhuǎn)錄本還出現(xiàn)在與PR結(jié)合相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本的集中，14個(gè)僅在完全的孕激素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)，且代表被早期調(diào)節(jié)但到24h時(shí)大部分恢復(fù)的轉(zhuǎn)錄本，表明由直接的PR結(jié)合介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默可以比間接調(diào)節(jié)更持續(xù)。

在AB32細(xì)胞中，與通過ORG2058增加的轉(zhuǎn)錄本相比，更多的轉(zhuǎn)錄本通過ORG2058減少(圖10)，并且在調(diào)節(jié)聚簇之間未觀察到平均的結(jié)合區(qū)域到TSS的距離中的顯著差異(克魯斯卡爾-沃利斯p值＝0.209，未顯示)。

實(shí)施例4-細(xì)胞系之間PR結(jié)合的不同模式反映了相異的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答

在T-47D中被PR結(jié)合的6312個(gè)區(qū)域和AB32中被PR結(jié)合的8117個(gè)區(qū)域中，僅1824個(gè)結(jié)合區(qū)域(組合總數(shù)的14％)是兩個(gè)細(xì)胞系共有的，代表了T-47D中結(jié)合區(qū)域的29％和AB32結(jié)合區(qū)域的22％(圖3)。兩個(gè)細(xì)胞系共有的結(jié)合區(qū)域更不可能與被調(diào)節(jié)的基因相關(guān)：在AB32和T-47D二者中發(fā)現(xiàn)的1824個(gè)結(jié)合區(qū)域中，AB32中的431個(gè)(24％)與孕激素調(diào)節(jié)相關(guān)且T-47D中為345個(gè)(19％)-與表1中示出的所有結(jié)合區(qū)域與被調(diào)節(jié)的基因的相關(guān)性類似。157個(gè)(9％)結(jié)合區(qū)域與兩個(gè)細(xì)胞系中被調(diào)節(jié)的基因相關(guān)(數(shù)據(jù)未顯示)。圖11中示出了在一個(gè)細(xì)胞系中專有地檢測(cè)到的或兩個(gè)細(xì)胞系共有的結(jié)合峰的實(shí)例。定向的ChIP證實(shí)與AB32、T-47D或兩個(gè)細(xì)胞系中被調(diào)節(jié)的基因結(jié)合的PR的不同模式(圖12)。此外，T-47D和AB32細(xì)胞中PR結(jié)合與T-47D細(xì)胞中的另一個(gè)PR順反組[40]之間的重疊的直接檢查揭示，與對(duì)于AB32PR數(shù)據(jù)集的相比，在兩個(gè)T-47D數(shù)據(jù)集之間的結(jié)合區(qū)域中的較高的重疊(圖13)。

在兩個(gè)細(xì)胞系之間的結(jié)合位點(diǎn)中的重疊的缺乏在孕激素處理的2h、6h和24h的轉(zhuǎn)錄譜中的類似地低的重疊中得到反映(圖3C-E)。兩個(gè)細(xì)胞系中孕激素靶中小的重疊在檢查的所有時(shí)間點(diǎn)是類似的(圖3E)。該重疊的缺乏在兩個(gè)另外的細(xì)胞系，ZR-75-1乳腺癌細(xì)胞和另外的PR表達(dá)細(xì)胞系MCF-10A克隆AB9中被證實(shí)，這揭示了當(dāng)彼此直接比較時(shí)(圖14)或與T-47D或AB32細(xì)胞比較時(shí)，孕激素應(yīng)答的類似地低的重疊。

實(shí)施例5-在T-47D和AB32細(xì)胞中的PR結(jié)合區(qū)域中鑒定的保守PRE

與被調(diào)節(jié)的基因相關(guān)的PR結(jié)合區(qū)域的從頭基序富集分析鑒定了與之前預(yù)測(cè)的孕酮應(yīng)答元件(PRE)一致的保守PR結(jié)合基序(圖4A)的高度顯著富集。MEME-ChIP(軟件分析程序)和Homer基序分析(軟件分析程序)工具二者鑒定了由被三個(gè)非特定的堿基分開的六個(gè)堿基對(duì)的反向重復(fù)序列RGNACA組成的共有PR結(jié)合基序，與PR結(jié)合元件的經(jīng)典生化研究一致[2,3]，并且與近期簡(jiǎn)要描述的元件類似[40]。另外，Homer中的從頭分析鑒定了高度富集的較短的元件，代表反向重復(fù)序列的中心核心(圖4A)，表明PRE的該更為強(qiáng)烈的保守的部分是對(duì)于PR結(jié)合最關(guān)鍵的。在T-47D細(xì)胞中，與被調(diào)節(jié)的基因相關(guān)的782/1239PR結(jié)合區(qū)域(63％)含有一個(gè)或更多個(gè)全長(zhǎng)或核心PRE基序(圖15A)，并且在33％的結(jié)合區(qū)域中，這包括至少一個(gè)高度保守的全長(zhǎng)PRE。在AB32細(xì)胞中，62％的調(diào)節(jié)相關(guān)的PR結(jié)合區(qū)域含有PRE(圖15B)。相當(dāng)比例的PR結(jié)合可能由與這些基序的直接的基因組相互作用介導(dǎo)，因?yàn)樵赥-47D和AB32細(xì)胞二者中存在PRE關(guān)于結(jié)合區(qū)域的中心的正態(tài)分布(圖16，和單樣本柯爾莫哥洛夫-斯米爾諾夫檢驗(yàn))。兩個(gè)細(xì)胞系中的若干結(jié)合區(qū)域含有多于一個(gè)PRE，盡管PRE的數(shù)目與峰高不相關(guān)(皮爾遜(Pearson)回歸R平方＝0.0048)，表明PRE數(shù)目與結(jié)合強(qiáng)度不相關(guān)。

針對(duì)通過在兩個(gè)細(xì)胞系中的從頭繪制基序圖譜(de novo motif mapping)定義的全長(zhǎng)PRE的位置特異性概率矩陣被用于將所有PR結(jié)合區(qū)域中的PRE強(qiáng)度分類。PRE強(qiáng)度不預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄結(jié)果，因?yàn)橄嗤壤恼{(diào)節(jié)相關(guān)的和不相關(guān)的PR結(jié)合區(qū)域含有強(qiáng)的PRE(數(shù)據(jù)未顯示)。基于PRE p值，將調(diào)節(jié)相關(guān)的PR結(jié)合區(qū)域分組(圖4B-C，強(qiáng)(+++)-p<1x10^-5，中等(++)-p＝1x10^-5-1x10^-3，弱/不存在(+)-p>1x10^-3)。通過這些標(biāo)準(zhǔn)，T-47D細(xì)胞中77％的調(diào)節(jié)相關(guān)的結(jié)合區(qū)域和AB32中76％的調(diào)節(jié)相關(guān)的結(jié)合區(qū)域含有一個(gè)或更多個(gè)中等或強(qiáng)PRE(p<0.001)。大多數(shù)的PR結(jié)合區(qū)域不含有強(qiáng)PRE，表明PR結(jié)合位點(diǎn)選擇方面的廣泛的靈活性，并且還意味著PR結(jié)合強(qiáng)度不僅由DNA核酸序列決定，并且可能受二級(jí)DNA結(jié)構(gòu)和其他DNA結(jié)合PR輔因子影響。PR結(jié)合峰高與轉(zhuǎn)錄結(jié)果正相關(guān)，表明其是結(jié)合強(qiáng)度的量度。在T-47D和AB32細(xì)胞二者中，在上調(diào)基因的50kb以內(nèi)的結(jié)合區(qū)域的平均峰高顯著地大于遠(yuǎn)離任何被調(diào)節(jié)的基因的那些結(jié)合區(qū)域的平均峰高(圖4D-E，非配對(duì)t檢驗(yàn)，T-47D p＝2.89x10^-8，AB32 p＝3.8x10^-6)。當(dāng)將PRE強(qiáng)度與峰高直接地比較時(shí)，未觀察到相關(guān)性，說明單獨(dú)的PRE品質(zhì)不決定PR結(jié)合強(qiáng)度(圖17)。該發(fā)現(xiàn)結(jié)果得到T-47D和AB32細(xì)胞中依據(jù)峰高的上部(top)PR結(jié)合區(qū)域的定向的ChIP驗(yàn)證的支持。這些區(qū)域的分析揭示了T-47D細(xì)胞中的僅兩個(gè)區(qū)域含有強(qiáng)PRE且AB32細(xì)胞為三個(gè)區(qū)域。前十位中的大多數(shù)區(qū)域含有中等強(qiáng)度PRE，并且在每個(gè)細(xì)胞系中在除了一個(gè)結(jié)合區(qū)域以外的所有結(jié)合區(qū)域中證實(shí)了PR結(jié)合(表S2)。

實(shí)施例6-T-47D和AB32中的結(jié)合區(qū)域具有不同的基序富集

我們分析了距每個(gè)結(jié)合峰多達(dá)400bp的序列的其他富集的基序的存在。T-47D細(xì)胞中的結(jié)合區(qū)域顯著地富集有先鋒因子FOXA1的基序(圖4F)，而來自AB32細(xì)胞的PR結(jié)合區(qū)域中不存在該因子的顯著富集。在T-47D細(xì)胞中的548/1239(44％)的調(diào)節(jié)相關(guān)的PR結(jié)合區(qū)域中鑒定了FOXA1結(jié)合基序(圖15A)。在AB32細(xì)胞中的結(jié)合區(qū)域中，存在用于AP-1復(fù)合物和用于DNA結(jié)合PR輔因子NF1的結(jié)合位點(diǎn)的強(qiáng)的富集。AP-1結(jié)合基序存在于AB32細(xì)胞中的454/1639(28％)的調(diào)節(jié)相關(guān)的PR結(jié)合區(qū)域中，且在AB32細(xì)胞中的380/1639(23％)的調(diào)節(jié)相關(guān)的PR結(jié)合區(qū)域中鑒定出NF1位點(diǎn)。這些細(xì)胞中相對(duì)少的結(jié)合區(qū)域(74/1639，4.5％)含有用于兩種因子的結(jié)合基序。任何轉(zhuǎn)錄因子基序在靠近被ORG2058上調(diào)或下調(diào)的基因的結(jié)合區(qū)域中的發(fā)生率中不存在差異(t檢驗(yàn)，p>0.05)。此外，上調(diào)相關(guān)的結(jié)合區(qū)域的單獨(dú)的基序分析和與下調(diào)相關(guān)的那些結(jié)合區(qū)域的單獨(dú)的基序分析未揭示不同的轉(zhuǎn)錄因子基序的富集(未顯示)。

實(shí)施例7-先鋒因子FOXA1改變PR轉(zhuǎn)錄應(yīng)答

FOXA1轉(zhuǎn)錄本相對(duì)于AB32和AB9細(xì)胞在T-47D和ZR-75-1細(xì)胞中豐富地表達(dá)(圖18)，表明FOXA1的內(nèi)源水平在調(diào)節(jié)PR轉(zhuǎn)錄應(yīng)答中可以發(fā)揮作用。因此，用慢病毒遞送的FOXA1感染缺乏內(nèi)源水平的FOXA1的AB32細(xì)胞(圖5)。這導(dǎo)致在6h和24h的孕激素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄組中的極大的改變(圖5A)。FOXA1轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致在僅用對(duì)照pCDH病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中未被調(diào)節(jié)的303個(gè)轉(zhuǎn)錄本的孕激素調(diào)節(jié)(圖5C)。這些靶中的幾乎一半(146/303，48％)被檢測(cè)為聚簇在一起的基因的不同的盒(圖5A，紅色條)。功能分析揭示，F(xiàn)OXA1表達(dá)后獲得孕激素調(diào)節(jié)的基因參與了血管形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的調(diào)節(jié)(表S3且數(shù)據(jù)未顯示)。這些類別包括諸如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3、CD44和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的基因，表明較廣泛的發(fā)育功能。出人意外地，當(dāng)FOXA1不存在時(shí)被調(diào)節(jié)的大比例的轉(zhuǎn)錄本(不存在FOXA1時(shí)，在6h、24h或二者被調(diào)節(jié)的1333個(gè)轉(zhuǎn)錄本，圖5C)在先鋒因子的表達(dá)后失去了調(diào)節(jié)，并且在多個(gè)聚簇中是明顯的(圖5A，藍(lán)色條)。功能分析揭示了FOXA1表達(dá)對(duì)參與細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)節(jié)的基因的主要影響：不存在FOXA1時(shí)這些基因被孕激素增加，但當(dāng)FOXA1表達(dá)時(shí)失去了孕激素應(yīng)答(表S3且數(shù)據(jù)未顯示)。被孕激素減少的該類別中的基因不被FOXA1表達(dá)改變，表明FOXA1的凈作用是促進(jìn)響應(yīng)孕激素的細(xì)胞凋亡。FOXA1表達(dá)對(duì)孕激素調(diào)節(jié)的削弱性作用表明，先鋒因子在PR作用中可以發(fā)揮雙重作用，與其在雄激素受體信號(hào)傳導(dǎo)中的作用類似，其中先鋒因子作為對(duì)一個(gè)子集的雄激素靶的活化物并且對(duì)其他雄激素靶的輔阻遏物起作用[41]。僅168個(gè)轉(zhuǎn)錄本的孕激素調(diào)節(jié)不受改變的FOXA1水平的影響(圖5C)。這些基因的功能分析揭示了孕激素介導(dǎo)的參與細(xì)胞周期進(jìn)程的基因的增強(qiáng)，表明孕激素的增殖作用可能不需要FOXA1。

由于FOXA1表現(xiàn)出具有對(duì)PR轉(zhuǎn)錄的與對(duì)ER觀察到的不同的作用，我們將T-47D細(xì)胞中PR結(jié)合區(qū)域周圍的FOXA1 ChIP-seq相互作用的密度[42]與在FOXA1或ER結(jié)合區(qū)域觀察到的那些密度進(jìn)行比較(圖5D)。不受限于理論，ER結(jié)合區(qū)域周圍的FOXA1的結(jié)合非常高，指示雌激素信號(hào)傳導(dǎo)中對(duì)該因子的需求。相比之下，盡管在PR結(jié)合區(qū)域附近觀察到FOXA1相互作用的峰，序列富集顯著地較低(圖5D)，表明雖然FOXA1可以在一些區(qū)域參與PR結(jié)合，其代表了結(jié)合事件的一個(gè)子集。

該結(jié)論得到以下發(fā)現(xiàn)結(jié)果支持：FOXA1結(jié)合在其中已預(yù)測(cè)了FOXA1基序的PR結(jié)合區(qū)域比在未發(fā)現(xiàn)基序的區(qū)域中強(qiáng)得多，并且與在ER結(jié)合區(qū)域中整體觀察到的結(jié)合密度類似(圖19)。為了測(cè)試靠近在FOXA1表達(dá)后獲得孕激素調(diào)節(jié)的基因的PR結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目是否不同，我們比較了FOXA1陰性AB32細(xì)胞中靠近當(dāng)FOXA1表達(dá)時(shí)丟失、獲得或保持孕激素調(diào)節(jié)的基因的PR結(jié)合峰的數(shù)目。盡管靠近獲得調(diào)節(jié)的基因存在稍微較少的PR結(jié)合區(qū)域(圖5E)，差異不顯著。這表明FOXA1影響PR結(jié)合和靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的能力可能與PR結(jié)合位點(diǎn)密度不相關(guān)；PR可以形成靠近“獲得”基因子集的弱的締合，但對(duì)于相互作用變的富有成效，則需要FOXA1。我們還檢查了與當(dāng)FOXA1表達(dá)時(shí)丟失、獲得或保留孕激素調(diào)節(jié)的基因相關(guān)的PR結(jié)合區(qū)域中用于NF1和AP-1的基序的富集水平，并且發(fā)現(xiàn)在組之間無差異(未顯示)。

FOXA1經(jīng)由其DNA彎曲活性(bending activity)影響轉(zhuǎn)錄因子活性[43,44,45]。我們推測(cè)，需要FOXA1來影響轉(zhuǎn)錄的PR結(jié)合區(qū)域可能比不需要FOXA1來影響轉(zhuǎn)錄的那些PR結(jié)合區(qū)域更加遠(yuǎn)離靶基因，并且靠近那些區(qū)域的FOXA1的結(jié)合導(dǎo)致DNA彎曲，這使得PR轉(zhuǎn)錄復(fù)合物更接近靶基因。從PR結(jié)合區(qū)域到通過FOXA1獲得調(diào)節(jié)的基因的距離的檢查揭示了情況就是這樣，并且該區(qū)域的子集比靠近在FOXA1不存在時(shí)被調(diào)節(jié)的基因的結(jié)合區(qū)域顯著地遠(yuǎn)離被調(diào)節(jié)的基因(圖5F，p＝0.003，非配對(duì)t檢驗(yàn))。

總之，兩個(gè)不同的示例性細(xì)胞系(例如，T-47D和AB32)中的ChIP-seq譜分析已揭示PR結(jié)合的預(yù)料不到地不同的模式。這些不同的順反組在對(duì)孕激素的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的顯著差異中得到反映。在兩個(gè)細(xì)胞系中的PR結(jié)合由高度類似的PRE介導(dǎo)，說明DNA相互作用的類似的模式，但輔因子特別是FOXA1結(jié)合位點(diǎn)富集的關(guān)鍵差異表明，這些輔因子的表達(dá)水平影響PR的細(xì)胞特異性結(jié)合和配體應(yīng)答。

PR基因組相互作用的全基因組調(diào)查的這一首次詳細(xì)描述已在永生化的正常和惡性乳腺細(xì)胞中鑒定了非重疊的PR結(jié)合位點(diǎn)；顯示，PR相互作用發(fā)生在近端啟動(dòng)子的遠(yuǎn)端，支持以下觀點(diǎn)：PR的作用跨越比之前預(yù)期的用于直接順式作用轉(zhuǎn)錄因子更長(zhǎng)的距離被介導(dǎo)；并且說明了轉(zhuǎn)錄輔因子是對(duì)細(xì)胞特異性PR活性的重要的貢獻(xiàn)者。

實(shí)施例8-PR結(jié)合區(qū)域遠(yuǎn)離TSS

大多數(shù)PR結(jié)合區(qū)域位于距離被調(diào)節(jié)的基因的TSS超過10kb，其中在兩個(gè)細(xì)胞系中少于35％的被調(diào)節(jié)的基因具有在TSS的10kb以內(nèi)的PR結(jié)合區(qū)域，并且少于4％的被調(diào)節(jié)的基因具有在TSS的1kb以內(nèi)的結(jié)合區(qū)域。在兩個(gè)乳腺細(xì)胞類型中，結(jié)合與基因調(diào)節(jié)相關(guān)，其中大多數(shù)孕激素調(diào)節(jié)的基因具有在50kb以內(nèi)的一個(gè)或更多個(gè)PR結(jié)合區(qū)域，并且通過孕激素增加的基因比被減少的基因更可能與PR結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)結(jié)果與在可比較的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中通過其他細(xì)胞核受體觀察到的結(jié)果一致。Reddy等在地塞米松處理的A549細(xì)胞中通過ChIP-seq鑒定了4392個(gè)GR結(jié)合位點(diǎn)(2％FDR)[46]。Welboren等在MCF-7細(xì)胞中鑒定了7713和10205個(gè)之間的雌激素依賴的ER結(jié)合位點(diǎn)，取決于使用的峰調(diào)用算法[47]。ER和GR二者表明在結(jié)合和基因調(diào)節(jié)之間的相關(guān)性，并且與該研究的發(fā)現(xiàn)結(jié)果一致，相對(duì)低比例的啟動(dòng)子近端結(jié)合被報(bào)道[14,46,47]。針對(duì)ER[14]和GR[46]，還已描述了結(jié)合與轉(zhuǎn)錄上調(diào)之間比結(jié)合與轉(zhuǎn)錄下調(diào)之間的更強(qiáng)的相關(guān)性。

在一方面，發(fā)現(xiàn)的PR結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目超過孕激素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄靶的數(shù)目，并且許多PR結(jié)合位點(diǎn)與活性轉(zhuǎn)錄不相關(guān)(例如，20％的PR結(jié)合區(qū)域與每個(gè)細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān))。在一方面，這被認(rèn)為代表PR結(jié)合位點(diǎn)與基因的相關(guān)的“接近”。該發(fā)現(xiàn)結(jié)果與其他細(xì)胞核受體的結(jié)果一致[14,17,46,47]。提出了若干可能的解釋[48]。一些結(jié)合事件可以以低于全基因組表達(dá)譜分析的檢測(cè)閾值的水平調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。此外，一個(gè)子集的結(jié)合位點(diǎn)可以代表僅在一個(gè)子集的細(xì)胞中發(fā)生的較弱的締合或結(jié)合，以使得轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)不以顯著的水平發(fā)生。我們的數(shù)據(jù)支持該可能性，因?yàn)橄啾扔诜钦{(diào)節(jié)相關(guān)的結(jié)合區(qū)域，靠近被調(diào)節(jié)的基因的PR結(jié)合峰信號(hào)強(qiáng)度顯著地更高。還表明與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)不相關(guān)的結(jié)合事件可以是在細(xì)胞類型特異性位點(diǎn)，其需要僅在一個(gè)子集的環(huán)境可得的結(jié)合輔因子的合作[48,49,50]。還必須假定，一定比例的結(jié)合區(qū)域代表非特異性相互作用，盡管PRE在調(diào)節(jié)相關(guān)的和非相關(guān)的結(jié)合區(qū)域中是類似地普遍的發(fā)現(xiàn)結(jié)果將爭(zhēng)辯非特異性相互作用解釋整體結(jié)合的小部分。

實(shí)施例9-PR結(jié)合區(qū)域中的PRE

針對(duì)具有與之前描述的孕酮應(yīng)答元件一致的序列的結(jié)合元件，PR結(jié)合區(qū)域被顯著地富集[2,3]。在15個(gè)堿基對(duì)的回文結(jié)構(gòu)的應(yīng)答元件中在特定堿基位置的相對(duì)保守性是可變的并且與對(duì)于GR[46,50]和AR[51]觀察到的保守性的模式一致。還檢測(cè)了代表核心的高度保守的元件的較短的基序(CA/t nnn TGTnC，圖4A)，表明PR結(jié)合元件中的這些位置的特別的重要性。存在PRE序列的高度的可變性，如通過共有序列指示的，允許在若干位置的顯著的變化，并且許多結(jié)合區(qū)域含有與理想的分歧相當(dāng)大的弱序列。此外，一定比例的PR結(jié)合區(qū)域完全缺少共有PRE，提出了這些PR結(jié)合區(qū)域是否直接結(jié)合PR的問題。為了解決該問題，我們尋找僅在那些區(qū)域中的基序富集，并且確實(shí)以比較低的顯著性水平鑒定了PRE樣基序(未顯示)。這表明缺乏共有PRE的許多結(jié)合區(qū)域確實(shí)含有與PRE一致的序列。報(bào)道了關(guān)于GR的類似的發(fā)現(xiàn)結(jié)果[46]。

盡管在PR結(jié)合區(qū)域中鑒定的PRE的存在和強(qiáng)度中存在可變性，這不是特定的區(qū)域是否與轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的決定因素，因?yàn)镻RE強(qiáng)度既不與PR結(jié)合峰強(qiáng)度相關(guān)也不與轉(zhuǎn)錄結(jié)果相關(guān)。這表明PRE強(qiáng)度不是PR是否將與特定的結(jié)合區(qū)域相互作用并且調(diào)節(jié)基因表達(dá)的唯一的決定因素，并且其他序列特征以及DNA結(jié)合輔因子的影響可能是重要的決定因素。這得到了FOXA1、AP-1和NF1在檢查的兩個(gè)細(xì)胞系中被鑒定作為PR的潛在的細(xì)胞類型特異性結(jié)合輔因子的支持。

實(shí)施例10-T-47D和AB32細(xì)胞中的PR順反組是非重疊的

T-47D和AB32細(xì)胞中的PR結(jié)合區(qū)域中存在相對(duì)地小的重疊。這與以下觀察結(jié)果一致：對(duì)孕激素的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答在兩個(gè)細(xì)胞系之間也是非重疊的。此外，兩個(gè)細(xì)胞系共有的結(jié)合區(qū)域更不可能與轉(zhuǎn)錄結(jié)果相關(guān)。另外兩個(gè)細(xì)胞系(ZR-75-1乳腺癌細(xì)胞和獨(dú)立的PR陽性MCF-10A克隆(AB9))中的表達(dá)譜分析揭示了通過孕激素的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的類似地低的重疊。MCF-7乳腺癌細(xì)胞與表達(dá)ER的U2OS骨肉瘤細(xì)胞中的ER結(jié)合模式的比較揭示了結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄組中的類似地低的重疊[49]。在那個(gè)研究中，提出了不同的啟動(dòng)子甲基化作為該差異的基礎(chǔ)。然而，AB32細(xì)胞中DNA甲基化的整體抑制，盡管增強(qiáng)存在的轉(zhuǎn)錄靶，未顯著地改變?cè)屑に貞?yīng)答的轉(zhuǎn)錄組(數(shù)據(jù)未顯示)。

在我們的發(fā)現(xiàn)結(jié)果的支持方面，Yin和同事近期報(bào)道了當(dāng)暴露于拮抗劑RU486時(shí)T-47D細(xì)胞和子宮平滑肌瘤細(xì)胞中的PR基因組相互作用中的類似地低的重疊[52]。將本文描述的示例性T-47D和AB32PR順反組與公開可得的數(shù)據(jù)集比較揭示了兩個(gè)T-47D數(shù)據(jù)集之間(51％報(bào)道的T-47D PR結(jié)合位點(diǎn)在我們的研究中同樣在T-47D中被發(fā)現(xiàn))比與AB32細(xì)胞中的結(jié)合(28％)的更大的重疊，支持了不同結(jié)合模式的觀察結(jié)果的正確性。

在發(fā)表的研究中，用孕酮處理T-47D細(xì)胞，所述孕酮具有與ORG2058類似的藥物代謝動(dòng)力學(xué)譜，但比合成的類似物更快地從PR解離。此外，已經(jīng)示出了PR在基因組DNA的移動(dòng)性是配體特異性的[53]，并且與孕酮相比，當(dāng)結(jié)合ORG2058時(shí)可以不同。第二，通過不同的方法檢測(cè)了PR結(jié)合：在該研究中使用了ChIP-seq，而發(fā)表的數(shù)據(jù)源自ChIP-chip。ChIP-seq以無偏性全基因組方式調(diào)查結(jié)合。ChIP-chip依賴于存在于使用的陣列上的序列，并且可受到雜交偏差影響。在MCF-7細(xì)胞中通過ChIP-seq和ChIP-chip檢測(cè)的ER結(jié)合位點(diǎn)中觀察到類似的重疊[47]。最后，用于產(chǎn)生發(fā)表的數(shù)據(jù)的分析方法不同于我們的研究中使用的。

實(shí)施例11-染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和先鋒因子FOXA1的作用

先鋒因子諸如FOXA1能夠與緊密包裝的異染色質(zhì)結(jié)合，打開DNA結(jié)構(gòu)以允許被細(xì)胞核受體包括ER、GR和AR結(jié)合和調(diào)節(jié)[12,14,15,17,41,54]。對(duì)FOXA1需要的水平和FOXA1在受體信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮的作用在受體間不同。FOXA1的表達(dá)對(duì)于通過ER的轉(zhuǎn)錄活化是關(guān)鍵的，盡管特定的基因靶在細(xì)胞系之間可以不同。在最近的研究中，Hurtado和同事在三種乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、T-47D和ZR-75-1中繪制了ER和FOXA1結(jié)合的圖譜，并且確定了沉默因子CTCF的定位在三個(gè)細(xì)胞系之間不同，并且定義了哪些ER靶通過FOXA1結(jié)合在轉(zhuǎn)錄上被增強(qiáng)。在這些細(xì)胞系中，F(xiàn)OXA1對(duì)于ER的作用是關(guān)鍵的[15]。

相比之下，F(xiàn)OXA1表現(xiàn)為在雄激素信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮雙重作用，其中FOXA1促進(jìn)一些AR靶的雄激素應(yīng)答而充當(dāng)其他的AR靶的阻遏物。這得到在LNCaP前列腺癌細(xì)胞中的近期研究的支持，其中FOXA1的耗竭引起AR結(jié)合模式的顯著重塑以及雄激素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本的顯著的增加[41]。在該環(huán)境中，F(xiàn)OXA1是結(jié)合位點(diǎn)選擇的決定因素，并且取決于靶位點(diǎn)而充當(dāng)AR結(jié)合的促進(jìn)物和阻遏物二者。

我們的數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)OXA1可能在PR信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮與AR類似的作用，因?yàn)镕OXA1不是孕激素應(yīng)答絕對(duì)需要的，并且在缺乏內(nèi)源的FOXA1的AB32細(xì)胞中，F(xiàn)OXA1的過量表達(dá)引起那些細(xì)胞中的孕激素調(diào)節(jié)的基因的數(shù)目的顯著的減少。在FOXA1豐富表達(dá)的T-47D細(xì)胞中，用于先鋒因子的結(jié)合基序在PR結(jié)合區(qū)域中統(tǒng)計(jì)地富集。FOXA1在PR信號(hào)傳導(dǎo)中通過含有FOXA1基序的區(qū)域的作用得到以下發(fā)現(xiàn)結(jié)果的支持：T-47D細(xì)胞中在這些位點(diǎn)的FOXA1結(jié)合水平大于在不含有預(yù)測(cè)的FOXA1基序的PR結(jié)合區(qū)域的相互作用。然而，T-47D細(xì)胞中所有PR結(jié)合區(qū)域周圍的平均FOXA1結(jié)合與在ER相互作用位點(diǎn)的平均FOXA1結(jié)合的比較，揭示了與ER相比，靠近PR的FOXA1結(jié)合的顯著較低的整體富集，表明了FOXA1不是所有PR相互作用必需的?？傊?，我們的數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)OXA1可以充當(dāng)T-47D中鑒定的許多靶的PR轉(zhuǎn)錄活化的增強(qiáng)劑，而在AB32細(xì)胞中，F(xiàn)OXA1表達(dá)的缺乏允許通?？梢员籉OXA1阻遏的PR靶的結(jié)合。

在T-47D和FOXA1轉(zhuǎn)導(dǎo)的AB32細(xì)胞中的孕激素調(diào)節(jié)之間的重疊是低的，表明FOXA1表達(dá)未引起AB32細(xì)胞在其孕激素應(yīng)答方面變得更像T-47D細(xì)胞。這與以下我們的觀察結(jié)果一致：FOXA1可以不是T-47D細(xì)胞中的所有PR結(jié)合事件絕對(duì)需要的。還表明，盡管FOXA1可以影響PR結(jié)合，其他細(xì)胞特異性因子或特征在決定PR結(jié)合中是重要的，所述其他細(xì)胞特異性因子或特征可能是通過ChIP不可鑒定的。已經(jīng)顯示ER和AR二者以細(xì)胞類型和啟動(dòng)子特異性的方式與組蛋白修飾因子締合[55,56]，其被招募到增強(qiáng)子作為大的輔調(diào)節(jié)復(fù)合物的一部分，并且通過基序分析將是不可鑒定的。已經(jīng)顯示GR順反組的性質(zhì)高度地取決于染色質(zhì)的可及性[57]，這也是細(xì)胞類型特異性的?？赡艿氖?，相同的因子以細(xì)胞類型特異性的方式影響PR結(jié)合。

實(shí)施例12-AP-1和NF-1

已經(jīng)顯示，細(xì)胞核受體包括PR通過與AP-1的拴系，獨(dú)立于激素應(yīng)答元件地與DNA締合[18,19,20]。在ER的情況中，該機(jī)制被報(bào)道為通過雌激素介導(dǎo)靶轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄阻遏[14]。這些發(fā)現(xiàn)結(jié)果表明，AP-1結(jié)合位點(diǎn)在缺乏PRE的結(jié)合區(qū)域中可能更常見，并且可與下調(diào)的基因相關(guān)。在AB32結(jié)合區(qū)域中，AP-1位點(diǎn)存在于27％的含有PRE的區(qū)域中和29％的缺乏PRE的區(qū)域中。該比例整體上比在未觀察到AP-1位點(diǎn)富集的T-47D細(xì)胞中的高(在T-47D中，12％的具有PRE的區(qū)域和10.7％的缺乏PRE的區(qū)域含有AP-1位點(diǎn))，然而，其在兩個(gè)結(jié)合區(qū)域子集之間并無差異。不存在AP1位點(diǎn)在下調(diào)的基因中比在上調(diào)的基因中更普遍的證據(jù)(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)表明，盡管在AB32細(xì)胞中的一個(gè)子集的結(jié)合位點(diǎn)上AP-1可以與PR合作，AP-1在孕酮信號(hào)傳導(dǎo)中的作用可能比用于雌激素的更次要。

轉(zhuǎn)錄輔因子NF1與DNA的結(jié)合需要通過PR的共締合，并且NF1和PR對(duì)基因表達(dá)具有協(xié)同作用[11]，表明這些轉(zhuǎn)錄因子的共表達(dá)的潛能導(dǎo)致增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄結(jié)果。在乳腺中，NF1同種型的協(xié)調(diào)的表達(dá)參與了控制泌乳和退化(involution)[58]。NF1在乳腺中的作用是環(huán)境特異性的，并且當(dāng)乳腺上皮細(xì)胞保持與富含層粘連蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)接觸時(shí)被誘導(dǎo)[59]。NF1在乳腺中的發(fā)育特異性和環(huán)境特異性的作用表明，NF1與PR的相互影響可能受到NF1和PR二者的水平調(diào)節(jié)，并且這些可能對(duì)在包括癌發(fā)生的生理環(huán)境下的調(diào)節(jié)敏感。NF1結(jié)合基序在AB32細(xì)胞中但不在乳腺癌細(xì)胞中的PR結(jié)合區(qū)域中的富集，支持該觀點(diǎn)，并且表明NF1是細(xì)胞類型限制性的PR輔因子。

染色質(zhì)重塑輔因子的組合對(duì)于乳腺中的孕酮應(yīng)答是重要的，并且這些輔因子的相對(duì)表達(dá)和協(xié)調(diào)的作用決定PR順反組。孕酮在正常和惡性靶組織中具有不同范圍的作用，并且該研究的結(jié)果表明，針對(duì)孕酮調(diào)節(jié)的順反組的在關(guān)鍵輔因子和PR之間的相互影響有助于孕酮作用的環(huán)境特異性，并且在乳腺癌中的異常的孕激素作用中發(fā)揮核心作用。

實(shí)施例13-細(xì)胞培養(yǎng)

T-47D和ZR-75-1乳腺癌細(xì)胞系從E.G.and G.Mason Research Institute(Worcester,MA)獲得。MCF-10A永生化正常乳腺細(xì)胞和HEK293T腎細(xì)胞從美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection)(atcc.org,Manassas,VA)獲得。將T-47D和ZR-75-1細(xì)胞維持在含有10％胎牛血清和0.25單位/ml胰島素的RPMI1640培養(yǎng)基中。將HEK293T維持在補(bǔ)充有10％胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)中。通過將PRA和PRB從病毒載體共引入MCF-10A細(xì)胞系和使用嘌呤霉素的克隆篩選，產(chǎn)生AB32和AB9細(xì)胞系。通過雙重免疫熒光分析并且通過蛋白質(zhì)印跡法表征了克隆的PRA和PRB的表達(dá)。圖20中示出了將AB32和AB9中的PR表達(dá)與T-47D細(xì)胞中的PR水平進(jìn)行比較的蛋白質(zhì)印跡。將細(xì)胞維持在補(bǔ)充有霍亂毒素(0.1μg/ml)、胰島素(0.28iu/ml)、氫化可的松(0.5μg/ml)、表皮生長(zhǎng)因子(0.02μg/μl)和5％馬血清的1∶1DMEM:Hams-F12培養(yǎng)基中。合成的孕激素ORG2058從Amersham Biosciences(GE Healthcare,Rydalmere,Australia)獲得。TSA和5AdC從Sigma-Aldrich(Castle Hill,Australia)獲得。

實(shí)施例14-染色質(zhì)免疫沉淀

將細(xì)胞在15cm組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)到80％匯合，然后用10nM ORG2058或媒介物處理持續(xù)45分鐘。隨后，通過向培養(yǎng)基中添加甲醛到1％的終濃度并且在37℃孵育持續(xù)10分鐘，使染色質(zhì)交聯(lián)。立即去除培養(yǎng)基，并且用冷的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌細(xì)胞，并且通過刮擦收獲細(xì)胞。通過離心收集細(xì)胞，并且將沉淀物在4℃的SDS緩沖液(1％SDS；10mM EDTA；50mM Tris-HCl，pH 8)中裂解10分鐘。使用7次以40％振幅和60％負(fù)荷(duty)的一分鐘脈沖(burst)(每次被至少一分鐘的靜止隔開)，使用Branson 450超聲波破碎器在4℃將裂解物進(jìn)行聲處理。將裂解物在4℃以13,000x g離心15分鐘以去除碎片。從裂解物的等分部分分離基因組DNA，并且通過凝膠電泳檢驗(yàn)以證實(shí)聲處理已產(chǎn)生具有200bp到400bp平均尺寸的片段化的DNA。用IP緩沖液(0.5％NP-40；50mM Tris，pH 8；120mM NaCl；0.5mM PMSF；全蛋白酶抑制劑混合物，Roche,Ryde,Australia)以1:10稀釋上清液，并且通過與Dynabeads M-280綿羊抗小鼠IgG磁珠(Invitrogen,Mulgrave,Australia)一起孵育，伴隨在4℃溫和旋轉(zhuǎn)持續(xù)至少2h以減少與二抗珠的非特異性結(jié)合，進(jìn)行預(yù)清潔。通過在4℃與內(nèi)部的hPRa6和hPRa7小鼠單克隆抗PR抗體[60]和新配制的綿羊抗小鼠IgG磁珠(40ul每1.4ml稀釋的裂解物)旋轉(zhuǎn)過夜，分離結(jié)合PR的基因組DNA片段。將珠用IP緩沖液、高鹽洗滌緩沖液(0.5％NP-40，50mM Tris，pH 8，500mM NaCl，0.5mM PMSF)、鋰洗滌緩沖液(250mM LiCl，0.5％NP-40，1％脫氧膽酸鈉，1mM EDTA，pH 8，10mM Tris-HCl，pH 8)和TE(10mM Tris，pH 8，1mM EDTA)順序地洗滌。使用洗脫緩沖液(1％SDS,0.1M NaHCO₃)在室溫將分離的DNA片段洗脫兩次，持續(xù)15分鐘。通過添加0.25M NaCl并且加熱到65℃持續(xù)至少6h使交聯(lián)逆轉(zhuǎn)。使用Qiagen PCR純化柱(Qiagen,Doncaster,Australia)純化DNA片段。將通過PR染色質(zhì)免疫沉淀從ORG2058處理的細(xì)胞分離的DNA片段在基因功能分析Ramaciotti中心(the Ramaciotti Centre for Gene Function Analysis)(University of New South Wales,Australia)和GeneWorks(Hindmarsh,Australia)的Illumina GA-IIx測(cè)序儀上測(cè)序。將從預(yù)清潔的ORG2058處理的樣品中分離的輸入DNA測(cè)序作為基線對(duì)照。從ORG2058處理的、預(yù)清潔的樣品中分離的DNA的等分部分充當(dāng)新一代測(cè)序中的輸入DNA對(duì)照樣品。

實(shí)施例15-分析

使用Bowtie 0.12.0.1[37]，將序列與重復(fù)序列屏蔽的人類基因組hg18(NCBI版本(build)36)比對(duì)。在比對(duì)的序列中，允許多達(dá)2個(gè)錯(cuò)配。多重比對(duì)允許多達(dá)10的多重性，但僅報(bào)告最佳排序的比對(duì)。該策略導(dǎo)致42％到48％的讀段的比對(duì)。T-47D中的結(jié)果代表三個(gè)獨(dú)立的生物重復(fù)和兩個(gè)重復(fù)輸入對(duì)照的組合的結(jié)果。AB32的結(jié)果來自兩次獨(dú)立的ChIP和每次的輸入對(duì)照樣品。除了來自T-47D細(xì)胞的一個(gè)ChIP和一個(gè)匹配的輸入對(duì)照樣品之外，所有序列是36bp讀段長(zhǎng)度。這些樣品被處理成具有64個(gè)堿基對(duì)的讀段長(zhǎng)度，但在數(shù)據(jù)處理期間被修剪到36個(gè)堿基對(duì)，以避免在下游分析中的偏差。使用ERANGE開源軟件工具[38]確定了富集的PR結(jié)合的區(qū)域。使用ERANGE findall.py(分析軟件程序)中的位移學(xué)習(xí)函數(shù)確定了峰位移為70bp。將峰閾值設(shè)為如從對(duì)照輸入DNA序列確定的背景的四倍。將區(qū)域以內(nèi)的讀段的最小數(shù)目(RPM)設(shè)為10。多個(gè)讀段以1/多重性的值加權(quán)。以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率0.27％調(diào)用峰。使用CisGenome v1.1[61]和Homer[62]，相對(duì)于鄰近的基因注釋PR結(jié)合的區(qū)域。使用Homer和基序分析工具的MEME程序組版本4[63,64]，鑒定了已知的和從頭富集的結(jié)合基序。使用Fisher Exact Test確定了MEME中發(fā)現(xiàn)的結(jié)合基序的富集的顯著性。富集的E值代表p值乘以測(cè)試的序列的數(shù)目。使用將結(jié)合區(qū)域序列與匹配的基因組背景比較的積累的超幾何分布分析[62]，在Homer中對(duì)基序富集評(píng)分。使用通過MEME發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)細(xì)胞系中的位置特異性概率矩陣，將MEME中的FIMO程序用于分類AB32和T-47D細(xì)胞中PR結(jié)合區(qū)域中的全長(zhǎng)PRE的發(fā)生。報(bào)道了對(duì)于與共有PRE的相似性具有p值<0.01的序列，并且p值范圍從0.01到1x10^-10。較低的p值表示相比于共有PRE的較大的序列保守，并且為了比較的目的，p值<1x10^-5被認(rèn)為代表強(qiáng)的PRE。為了將T-47D細(xì)胞中的PR基因組相互作用與發(fā)表的ER和FOXA1相互作用物組(interactome)[42]比較，在Homer中從所有三個(gè)數(shù)據(jù)集產(chǎn)生了序列標(biāo)簽文庫，并且對(duì)每個(gè)數(shù)據(jù)集使用相同的參數(shù)鑒定了結(jié)合峰。然后，使用Homer中的峰注釋功能，確定了在PR、ER和FOXA1峰的平均FOXA1標(biāo)簽密度。通過ChIP-seq和基因表達(dá)譜分析產(chǎn)生的所有原始數(shù)據(jù)已被放置在Gene Expression Omnibus(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)上，并且通過GEO登錄號(hào)GSE31130可訪問?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)符合MIAME指導(dǎo)方針。

實(shí)施例16-實(shí)時(shí)PCR

使用與關(guān)于ChIP-seq描述的相同的方案進(jìn)行定向的ChIP。在RotorGene 6000實(shí)時(shí)PCR儀上使用Platinum Sybr Green試劑(Invitrogen)將靶模板定量。如以上描述的進(jìn)行定向的ChIP，并且在通過實(shí)時(shí)qPCR定量之前，將純化的gDNA片段稀釋2到5倍。用于特定的靶驗(yàn)證的引物序列是：ACSL1-fwd 5'-TGC AAA GAG CAA GAC AGA AAA G-3'、rev-5'-GCG GTC ATA GAG ACA CAA TTC C-3'，DHRS9-fwd 5'-GGC TGT CTG AGT GAA TCT GTA GTG-3'、rev-5'-AGT TAC ATT TGC CCT TGA TTC C-3'，F(xiàn)LRT3-fwd 5'-GGA GAA ACA GAC TTT ACC TGA CC-3'、rev-5'-TGT TGC AGT CAA GGA GAC AGA G-3'，NOTCH 2-fwd 5'-GCC TGT TCC TAT TAA GTG TCC TG-3'、rev-5'-GGC TGT AAA GTT ATT TGC TAG ATT G-3'，PACSIN1-fwd 5'-AAC GTC CTC TTC CTG CTC TTG-3'、rev-5'-GAG CTT TGA TGT AGA CGG AAT-3'G，PDK4-fwd 5'-CG AGC AGC AAT AAC TTT CC-3'、rev-5'-ACG CAA GAA CAC AGT GAG TAG C-3'。

實(shí)施例17-慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)

從PlasmID Dana Faber/Harvard Cancer Center DNA Resource Core(Boston,MA)獲得FOXA1cDNA。通過高保真PCR擴(kuò)增開放閱讀框，并且轉(zhuǎn)移到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的多克隆位點(diǎn)。通過測(cè)序證實(shí)插入物的完整性。通過將pCDH-FOXA1-GFP載體和慢病毒包裝構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK293T細(xì)胞，并且允許病毒在培養(yǎng)基中積累持續(xù)48h，產(chǎn)生慢病毒顆粒。使用Facs Calibur流式細(xì)胞儀來評(píng)價(jià)GFP陽性，AB32細(xì)胞中經(jīng)過稀釋系列的病毒滴度被評(píng)價(jià)。以預(yù)測(cè)產(chǎn)生70％感染率的水平感染AB32細(xì)胞，并且在37℃孵育持續(xù)24h以允許FOXA1的表達(dá)，隨后用10nM ORG2058處理持續(xù)0h、6h和24h。用親本pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP病毒感染的匹配的對(duì)照樣品被包括在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)。

實(shí)施例18-基因表達(dá)微陣列

使用RNAqueous純化柱(Invitrogen)分離總RNA。使用Illumina TotalPrep試劑(Invitrogen)擴(kuò)增總RNA(500ng)，并且用生物素標(biāo)記。使用推薦的Illumina試劑并且遵循制造商的方案，將擴(kuò)增的樣品(750ng)與人類全基因組HT-12基因表達(dá)珠陣列雜交。使用Genome Studio軟件(Illumina)分析原始數(shù)據(jù)。在背景減除數(shù)據(jù)和三次樣條歸一化之后，使用Genome Studio的Illumina定制模型確定差異表達(dá)的p值。使用Microsoft Excel和SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)。使用GenePattern[65]進(jìn)行分層聚簇分析(hierarchical clustering)和自組裝映射聚簇分析。

實(shí)施例19-蛋白提取物制備和免疫印跡法

通過胰蛋白酶消化收集待通過蛋白免疫印跡法分析的細(xì)胞，用冷的磷酸鹽緩沖鹽水溶液洗滌，并且通過離心收集為細(xì)胞沉淀物。全細(xì)胞提取物通過在含有10mM NaMoO₄、1％抑肽酶、全蛋白酶抑制劑(Roche,Castle Hill,Australia)和0.5mM苯甲基磺酰氟的RIPA緩沖液(10mM NaPO₄(pH 7.0)、150mM NaCl、2mM EDTA、1％脫氧膽酸鈉、1％NP-40、0.1％β-巰基乙醇)中裂解細(xì)胞，并且在4℃旋轉(zhuǎn)15min來制備。通過在4℃以14,000x g離心15min，去除不溶的碎片。使用Bradford染料試劑(Bio-Rad,Regents Park,Australia)評(píng)價(jià)蛋白濃度。蛋白通過變性的7.5％聚丙烯酰胺-SDS凝膠通過電泳被分級(jí)，并且轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，如之前描述的[66]。為了檢測(cè)FOXA1的表達(dá)，以100μg每泳道加載T-47D全細(xì)胞提取物和以10μg每泳道加載轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的提取物。使用以1∶800稀釋的山羊抗人類FOXA1多克隆抗體(Abcam ab5089,Sapphire Biosciences,Waterloo,Australia)，以及兔抗山羊辣根過氧化物酶綴合的二抗(Dako Cytomation,Kingsgrove,Australia)檢測(cè)FOXA1。為了檢測(cè)PR蛋白的表達(dá)，如所示的加載全細(xì)胞提取物。使用hPRa6和hPRa7內(nèi)部鼠單克隆抗體(各自1:100)和山羊抗小鼠辣根過氧化物酶綴合的二抗(Dako)檢測(cè)PR。通過使用ECL試劑(Quantum Scientific,Murrarie,Australia)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，并且曝光于膠片或使用Kodak Image Station(Carestream Health,Richmond,Australia)成像使蛋白條帶可視化。

實(shí)施例20-T-47D和AB32細(xì)胞中的PR結(jié)合位點(diǎn)的基因組分布。

如圖1中示出的，使用Bowtie將通過ChIP-seq鑒定的孕激素依賴的PR結(jié)合DNA片段與基因組比對(duì)，并且使用ERANGE鑒定結(jié)合的峰，具有0.27％的FDR。(A和B)使用CisGenome確定(A)T-47D和(B)AB32細(xì)胞中PR結(jié)合區(qū)域相對(duì)于RefSeq基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的位置。(C和D)在(C)T-47D和(D)AB32細(xì)胞中按基因數(shù)目排序的根據(jù)染色體的PR結(jié)合區(qū)域分布。(E和F)在(E)T-47D和(F)AB32細(xì)胞中在距TSS的給定距離以內(nèi)具有PR結(jié)合區(qū)域的孕激素調(diào)節(jié)的基因的百分比。實(shí)線-與上調(diào)基因相關(guān)的結(jié)合區(qū)域，虛線-與下調(diào)基因相關(guān)的結(jié)合區(qū)域。指示了上調(diào)和下調(diào)基因到最靠近的TSS的中值距離。

實(shí)施例21-與孕激素應(yīng)答基因相關(guān)的PR結(jié)合。

如圖2中示出的，確定了在用10nM ORG2058處理后2h、6h和24h的T-47D和AB32細(xì)胞中的基因表達(dá)譜。相比于未處理的對(duì)照，在2h、6h和/或24h顯著地差異地表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本被認(rèn)為被孕激素調(diào)節(jié)，并且與相同的細(xì)胞系中的PR結(jié)合區(qū)域的列表比較。(A和B)在(A)T-47D和(B)AB32細(xì)胞中PR結(jié)合區(qū)域與孕激素調(diào)節(jié)的基因之間的重疊。(C和D)在(C)T-47D和(D)AB32細(xì)胞中在2h、6h和24h在被調(diào)節(jié)的基因的10kb以內(nèi)或在5’-UTR中的PR結(jié)合區(qū)域。(E)使用Gene Pattern通過SOM聚簇分析鑒定了T-47D細(xì)胞中分組在一起的具有孕激素調(diào)節(jié)模式的基因。調(diào)節(jié)模式被繪制為相對(duì)于未處理的對(duì)照的平均log倍數(shù)變化。誤差條代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。(F)與(E)中示出的每個(gè)SOM聚簇相關(guān)的PR結(jié)合區(qū)域到TSS的平均距離。

實(shí)施例22-在T-47D和AB32中的差異PR結(jié)合和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。

參考圖3A，使用Bed Tools中的IntersectBed功能鑒定了T-47D和AB32細(xì)胞之間共有的PR結(jié)合區(qū)域。示出了T-47D或AB32細(xì)胞獨(dú)特的或是兩個(gè)細(xì)胞系共有的區(qū)域的數(shù)目和百分比。

參考圖3B，用10nM ORG2058(ORG)或媒介物處理T-47D和AB32細(xì)胞持續(xù)2h、6h和24h。通過全基因組微陣列測(cè)量轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在T-47D或AB32細(xì)胞中在一個(gè)或更多個(gè)時(shí)間點(diǎn)在ORG2058處理的樣品中相對(duì)于未處理的對(duì)照差異表達(dá)的基因，通過無監(jiān)督分層聚簇分析被比較。紅色-相對(duì)于媒介物處理的對(duì)照增加的表達(dá)，綠色-相對(duì)于媒介物處理的對(duì)照減少的表達(dá)。

參考圖3C，示出了在2h、6h或24h在T-47D和AB32細(xì)胞中被孕激素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本之間的重疊。示出了在T-47D或AB32中被孕激素獨(dú)特地調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本和是兩個(gè)細(xì)胞系共有的調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本的數(shù)目和百分比。

參考圖3D，示出了在單獨(dú)的處理時(shí)間在T-47D和AB32中孕激素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本的數(shù)目。示出了在特定的時(shí)間點(diǎn)在T-47D或AB32細(xì)胞中被獨(dú)特地調(diào)節(jié)的或在二者中均被調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本的數(shù)目。

實(shí)施例23-PR結(jié)合區(qū)域中的基序富集。

參考圖4A，示出了在T-47D和AB32細(xì)胞中的結(jié)合區(qū)域中鑒定的全長(zhǎng)和核心PRE。使用MEME-ChIP和Homer分析調(diào)節(jié)相關(guān)的PR結(jié)合區(qū)域序列的保守的序列基序的統(tǒng)計(jì)富集。在兩個(gè)細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了全長(zhǎng)和核心PR結(jié)合元件。示出了通過MEME-ChIP鑒定的全長(zhǎng)PRE和Homer中鑒定的核心元件。

參考圖4B和C，示出了(B)T-47D和(C)AB32細(xì)胞中依據(jù)p值的PRE強(qiáng)度。PRE被分類為強(qiáng)(+++，p<1x10^-5)、中等(++，p＝1x10^-5到1x10^-3)或弱/不存在(+，p>1x10^-3)。

參考圖4D和4E，示出了(D)T-47D和(E)AB32細(xì)胞中調(diào)節(jié)和非調(diào)節(jié)相關(guān)的PR結(jié)合區(qū)域中的PR峰高。(F)T-47D和AB32細(xì)胞中上部轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序的富集。

實(shí)施例24-將FOXA1引入AB32細(xì)胞內(nèi)改變?cè)屑に貞?yīng)答。

參考圖5A，示出了在FOXA1的存在和不存在下，在AB32細(xì)胞中響應(yīng)孕激素的轉(zhuǎn)錄譜的無監(jiān)督聚簇分析。用包含pCDH-FOXA1構(gòu)建體或空pCDH對(duì)照的病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)AB32細(xì)胞持續(xù)24h。用10nM ORG2058(ORG)或媒介物處理細(xì)胞6h和24h。通過全基因組微陣列測(cè)量基因的表達(dá)。通過無監(jiān)督分層聚簇分析，分析與對(duì)照相比在ORG2058處理的細(xì)胞中在任何時(shí)間點(diǎn)差異表達(dá)的基因。紅色-增加的log倍數(shù)表達(dá)，綠色-減少的log倍數(shù)表達(dá)。

參考圖5B，示出了與T-47D細(xì)胞中的內(nèi)源表達(dá)相比，在病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)之前和之后，在AB32細(xì)胞和親本MCF-10A細(xì)胞中的FOXA1蛋白表達(dá)。

參考圖5C，示出了在FOXA1的存在和不存在下，AB32細(xì)胞中孕激素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本的數(shù)目。

參考圖5D，示出了在PR、ER和FOXA1結(jié)合位點(diǎn)的FOXA1結(jié)合強(qiáng)度的比較。

參考圖5E，示出了針對(duì)隨著FOXA1表達(dá)丟失、獲得或保持孕激素調(diào)節(jié)的基因，PR結(jié)合區(qū)域與AB32細(xì)胞中被調(diào)節(jié)的基因的比率。

參考圖5F，示出了AB32中從PR結(jié)合區(qū)域到隨著FOXA1表達(dá)丟失、獲得或保持孕激素調(diào)節(jié)的基因的距離。誤差條代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。

實(shí)施例26-T-47D和AB32細(xì)胞中PR結(jié)合區(qū)域相對(duì)染色體的分布。

參考圖6，通過T-47D和AB32數(shù)據(jù)集之間的線性回歸比較每條染色體的PR結(jié)合區(qū)域的總數(shù)目。示出了擬合的線和95％置信區(qū)間。標(biāo)簽代表染色體號(hào)。

實(shí)施例27-PR結(jié)合和孕激素調(diào)節(jié)的時(shí)間之間的關(guān)系。

參考圖7，確定了(A)T-47D和(B)AB32細(xì)胞中在處理后2h、6h或24h，與一個(gè)或更多個(gè)PR結(jié)合區(qū)域相關(guān)的孕激素調(diào)節(jié)的基因的比例。

實(shí)施例28-PR結(jié)合區(qū)域的位置。

參考圖8，使用CisGenome v1.1確定了(A)T-47D和(B)AB32細(xì)胞中所有PR結(jié)合區(qū)域相對(duì)于最靠近的基因的分布。

實(shí)施例29-PR結(jié)合區(qū)域的位置。

參考圖9，使用CisGenome v1.1確定了(A)T-47D和(B)AB32細(xì)胞中所有PR結(jié)合區(qū)域相對(duì)于最靠近的基因的分布。

實(shí)施例30-AB32細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的模式。

參考圖10，通過基因表達(dá)譜分析鑒定了在用10nM ORG2058處理2h、6h和24h的AB32細(xì)胞中孕激素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本。使用Gene Pattern，通過自組裝映射聚簇分析，鑒定了經(jīng)過24h時(shí)間進(jìn)程的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的模式。

實(shí)施例31-T-47D和AB32細(xì)胞中的PR結(jié)合區(qū)域。

參考圖11，T-47D或AB32細(xì)胞獨(dú)特的或是兩個(gè)細(xì)胞系共有的PR結(jié)合區(qū)域的實(shí)例被顯示為在UCSC基因組瀏覽器中展示的定制的軌跡(custom track)。

實(shí)施例32-驗(yàn)證在ChIP-seq中鑒定的細(xì)胞類型特異性的PR結(jié)合區(qū)域。

參考圖12，使用結(jié)合區(qū)域特異性的引物和定量實(shí)時(shí)PCR，通過定向的PR-ChIP驗(yàn)證在(A)T-47D、(B)AB32或(C)兩個(gè)細(xì)胞系中通過ChIP-seq鑒定的PR結(jié)合區(qū)域?？拷赥-47D中但未在AB32中被調(diào)節(jié)的ACSL1和PACSIN1結(jié)合的區(qū)域，產(chǎn)生在T-47D細(xì)胞中且未在AB32中的結(jié)合的片段的顯著的富集。相反的情況對(duì)于在AB32中但未在T-47D中鑒定的PR靶區(qū)域是真實(shí)的。FLRT3和DHRS9(二者都是僅在AB32中的轉(zhuǎn)錄靶)在AB32中被PR強(qiáng)烈地結(jié)合，但在T-47D細(xì)胞中顯示弱的締合。PDK4和Notch 2(其在兩個(gè)細(xì)胞系中都被孕激素調(diào)節(jié))在兩個(gè)細(xì)胞系中被PR結(jié)合，盡管在T-47D中的締合更強(qiáng)(在T-47D與AB32中，PDK-4的85倍與42倍結(jié)合富集和Notch 2結(jié)合的300倍與37倍富集)。

實(shí)施例33-ORG2058處理的T-47D和AB32中PR結(jié)合區(qū)域與孕酮(P4)處理之后的T-47D中的結(jié)合的重疊(圖13)。

將我們的數(shù)據(jù)與在Tang等[1]中概述的并且在http://cistrome.dfci.harvard.edu/NR_Cistrome/可得的T-47D中孕酮配合的PR結(jié)合比較。

實(shí)施例34-另外的乳腺細(xì)胞系中基因表達(dá)的孕激素調(diào)節(jié)。

參考圖14，用10nM ORG2058或媒介物處理ZR-75-1乳腺癌細(xì)胞和AB9PR陽性轉(zhuǎn)化的正常乳腺細(xì)胞2h、6h或24h，然后收集細(xì)胞并分離總RNA。通過Illumina HT-12微陣列評(píng)價(jià)基因表達(dá)水平。使用Genome Studio軟件分析數(shù)據(jù)。相比于媒介物處理的細(xì)胞，具有在ORG2058中顯著地不同的(diff p值<0.01)并且具有1.5或更多的倍數(shù)變化的水平的轉(zhuǎn)錄本被認(rèn)為被孕激素調(diào)節(jié)。(A)ZR-75-1或AB9細(xì)胞或二者中孕激素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本的數(shù)目。(B)使用Gene Pattern，對(duì)在一個(gè)或兩個(gè)細(xì)胞系中被孕激素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本的子集進(jìn)行陣列(皮爾遜相關(guān))和基因表達(dá)倍數(shù)變化(非中心的相關(guān))的無監(jiān)督平均連鎖分層聚簇分析。紅色-相對(duì)于媒介物通過ORG2058增加的表達(dá)，綠色-相對(duì)于媒介物通過ORG2058減少的表達(dá)。

實(shí)施例35-T-47D和AB32細(xì)胞中在調(diào)節(jié)相關(guān)的結(jié)合位點(diǎn)中PRE和輔因子基序的富集。

參考圖15，示出了含有PRE具有或不具有一個(gè)或更多個(gè)上部富集的轉(zhuǎn)錄輔因子結(jié)合基序的調(diào)節(jié)相關(guān)的PR結(jié)合區(qū)域的相對(duì)比例。示出了(A)T-47D和(B)AB32的基序分布。

實(shí)施例36-T-47D和AB32細(xì)胞中PR結(jié)合區(qū)域中PRE位置的分布。

參考圖16，(A)T-47D和(B)AB32細(xì)胞中的PR結(jié)合區(qū)域中PRE基序相對(duì)于峰中心的位置被繪制成頻率分布。

實(shí)施例37-PRE強(qiáng)度不預(yù)測(cè)PR結(jié)合。

參考圖17，使用MEME中的FIMO程序[2]，將PR結(jié)合區(qū)域中的PRE基序分類。將每個(gè)結(jié)合區(qū)域中最強(qiáng)的候選PRE的強(qiáng)度(如由p值確定的)相對(duì)于峰高繪圖，作為PR結(jié)合強(qiáng)度的指示。評(píng)價(jià)了估計(jì)的擬合線和皮爾遜相關(guān)R²值。示出了(A)T-47D和(B)AB32細(xì)胞的數(shù)據(jù)。

實(shí)施例38-細(xì)胞系中FOXA1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

參考圖18，將在Illumina HT-12陣列上測(cè)量的在乳腺癌(T-47D、ZR-75-1)和轉(zhuǎn)化的正常乳腺細(xì)胞(AB9、AB32)中的FOXA1轉(zhuǎn)錄表達(dá)比較。FOXA1水平相對(duì)于AB32細(xì)胞中的水平表示。

實(shí)施例39-在具有或不具有預(yù)測(cè)的FOXA1基序的PR結(jié)合區(qū)域的FOXA1結(jié)合。

參考圖19，使用Homer軟件預(yù)測(cè)PR結(jié)合區(qū)域中FOXA1基序的存在。預(yù)測(cè)為結(jié)合FOXA1的PR結(jié)合區(qū)域和缺乏FOXA1結(jié)合基序的區(qū)域被單獨(dú)地分析實(shí)際的FOXA1結(jié)合富集。示出了T-47D中來自ChIP-seq的在含有FOXA1基序(藍(lán)色線)的PR結(jié)合區(qū)域和缺乏任何預(yù)測(cè)的FOXA1基序(紅色線)的PR結(jié)合區(qū)域的平均FOXA1結(jié)合強(qiáng)度。

實(shí)施例40-在T-47D、AB32和AB9細(xì)胞中的PR表達(dá)。

參考圖20，以所示的加載的來自全細(xì)胞提取物的蛋白，通過變性的7.5％聚丙烯酰胺-SDS凝膠電泳被分級(jí)并且轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。PR蛋白條帶被可視化，如本文中描述的。

實(shí)施例41-表S1：AB32中根據(jù)染色體的基因功能注釋的小結(jié)

確定了AB32細(xì)胞中染色體2、8和11上PR結(jié)合區(qū)域相關(guān)的基因的子集的基因本體(gene ontology)方面的富集。

實(shí)施例42-表S2：上部PR結(jié)合區(qū)域的驗(yàn)證

通過定向的ChIP-PCR證實(shí)PR與T-47D和AB32細(xì)胞中選擇的位點(diǎn)結(jié)合。選擇T-47D中的10個(gè)結(jié)合區(qū)域和AB32細(xì)胞中的9個(gè)用于驗(yàn)證。

T-47D

AB32

實(shí)施例43-表S3：隨著FOXA1的表達(dá)丟失、獲得和保留孕激素調(diào)節(jié)的基因簇的功能分析。

對(duì)在表達(dá)FOXA1后AB32細(xì)胞中丟失、獲得和保留孕激素調(diào)節(jié)的基因的組進(jìn)行功能注釋聚簇分析。

實(shí)施例44-通過奧那司酮減弱PR結(jié)合(圖21-24)

我們選擇了若干基因組區(qū)域，所述基因組區(qū)域我們之前在T-47D細(xì)胞中通過ChIP-seq顯示被PR結(jié)合，并且靠近這些細(xì)胞中被孕激素ORG2058(使用10nM的藥物濃度在6h)調(diào)節(jié)的基因。

我們?cè)赥-47D細(xì)胞中和第二乳腺癌細(xì)胞系HCC1428中用ORG2058、奧那司酮、其組合或媒介物進(jìn)行ChIP-PCR。使用的濃度是1nM ORG2058和100nM奧那司酮。這是基于揭示在該濃度的ORG作用最大并且被奧那司酮消除的初步實(shí)驗(yàn)。

在兩個(gè)細(xì)胞系中測(cè)試了十個(gè)PR結(jié)合區(qū)域，并且證實(shí)了10個(gè)中的9個(gè)被ORG2058配合的PR結(jié)合并被奧那司酮減弱。在一方面，我們觀察到在單獨(dú)的奧那司酮的存在下，PR與一些靶結(jié)合。這主要在T-47D細(xì)胞中，并且考慮到奧那司酮被報(bào)道阻斷DNA被PR結(jié)合，是出人意料的。

實(shí)施例45-表達(dá)譜分析(圖21-24)

表達(dá)譜分析揭示了309個(gè)差異地表達(dá)的探針，代表在一個(gè)或兩個(gè)細(xì)胞系中被1nM ORG2058調(diào)節(jié)的267個(gè)基因。除了T-47D中的5個(gè)基因和HCC1428中的6個(gè)基因之外，奧那司酮消除了所有基因的孕激素調(diào)節(jié)。通常孕激素應(yīng)答在T-47D細(xì)胞中更顯著，所述T-47D細(xì)胞以顯著高于HCC1428的水平表達(dá)PR。

總體說來，在兩個(gè)不相關(guān)的細(xì)胞系中的數(shù)據(jù)證實(shí)，被孕激素活化的PR可再現(xiàn)地與一系列的定義的DNA靶結(jié)合，并且該結(jié)合被奧那司酮減弱。

盡管以上的描述涉及特定的方面，應(yīng)該理解這些方面僅僅是闡述性的。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將明顯的是，可以對(duì)本文描述的多態(tài)形式和方法做出多種修改和變化。因此，本描述意圖包括在描述的范圍內(nèi)的修改和變化形式及其等價(jià)物。

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縮略詞(通過引用以其整體并入本文)

AP-1 活化物蛋白1

AR 雄激素受體

Bowtie 序列比對(duì)軟件(http://bowtie-bio.sourceforge.net)

CD44 細(xì)胞表面糖蛋白CD44

ChIP 染色質(zhì)免疫沉淀

Ct 定量實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中的循環(huán)閾值

CTCF CCCTC-結(jié)合因子

ER 雌激素受體

ERANGE findall.py ChIP 峰鑒定軟件工具

(http://woldlab.caltech.edu/rnaseq)

FDR 錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率

FOXA1 叉頭框A1

GR 糖皮質(zhì)激素受體

Homer 用于ChIP峰鑒定和DNA結(jié)合基序鑒定的序列分

析軟件(http://biowhat.ucsd.edu/homer/)

MEME-ChIP 用于特別地在ChIP-seq數(shù)據(jù)中的DNA結(jié)合基序鑒

定的在線序列分析工具(http://meme.nbcr.net/)

NF1 細(xì)胞核因子1

ORG Organon 2058

PRE 孕酮應(yīng)答元件

SOM 自組裝映射

SP1 特化蛋白1

Stat3 轉(zhuǎn)錄的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和活化物

TSS 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)