交叉引用相關(guān)申請(qǐng)

本案系主張美國臨時(shí)專利申請(qǐng)案(申請(qǐng)?zhí)?2/052,088，申請(qǐng)日2014年9月18日)之優(yōu)先權(quán)。

本發(fā)明系關(guān)于多能性(multipotent)祖細(xì)胞、一種自子宮體(uterinecorpus)制備祖細(xì)胞之方法、及該祖細(xì)胞之應(yīng)用。

先前技術(shù)

祖細(xì)胞療法似乎已成為治愈退化性疾病之最佳解答，退化性疾病(如帕金森氏癥)及缺血性疾病(如中風(fēng)及心肌梗塞)—所有疾病實(shí)體均與老化族群高度相關(guān)。目前，人類祖細(xì)胞(亦已知為干細(xì)胞)來源系包含全能性干細(xì)胞(psc)(如人類胚胎干細(xì)胞(hesc)及誘導(dǎo)性全能性干細(xì)胞(ips))及成人干細(xì)胞(asc)(如骨髓間葉干細(xì)胞(bmmsc)及神經(jīng)干細(xì)胞)。然而，各種來源均無法排除其臨床使用上的缺點(diǎn)：全能性干細(xì)胞有道德倫理上與腫瘤發(fā)生的疑慮(參考文獻(xiàn)：thomson,j.a.,itskovitz-eldor,j.,shapiro,s.s.,waknitz,m.a.,swiergiel,j.j.,marshall,v.s.,andjones,j.m.(1998).embryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocysts.science282,1145-1147；yamanaka,s.(2009).afreshlookatipscells.cell137,13-17)，而成人干細(xì)胞則為非常稀少的細(xì)胞，須以侵入式手段獲得，且細(xì)胞數(shù)量與干細(xì)胞功能系隨年紀(jì)及體外(exvivo)擴(kuò)增而遞減(參考文獻(xiàn)：rao,m.s.,andmattson,m.p.(2001).stemcellsandaging:expandingthepossibilities.mechageingdev122,713-734；以及ho,p.j.,yen,m.l.,tang,b.c.,chen,c.t.,andyen,b.l.(2013).h2o2accumulationmediatesdifferentiationcapacityalteration,butnotproliferativedecline,insenescenthumanfetalmesenchymalstemcells.antioxidredoxsignal18,1895-1905(“hoetal”))。

子宮為女性生殖道中的器官之一，功能為容存人類胎兒及提供營(yíng)養(yǎng)至生產(chǎn)。為了適應(yīng)懷孕之生理需求而能夠密集生長(zhǎng)，子宮體主要由平滑肌細(xì)胞(子宮肌層)所構(gòu)成且為高度血管化。移除子宮、或子宮切除術(shù)(hysterectomy)，系對(duì)未懷孕婦女最常見的手術(shù)程序；在美國，超過60歲的婦女有三分之一接受過子宮切除術(shù)(參考文獻(xiàn)：schaffer,j.i.,andword,a.(2002).hysterectomy--stillausefuloperation.nengljmed347,1360-1362；carlson,k.j.,nichols,d.h.,andschiff,i.(1993).indicationsforhysterectomy.nengljmed328,856-860；frequentlyaskedquestions:hysterectomy.(2009).officeonwomen’shealth,u.s.departmentofhealth&humanservices)。

onoetal.已報(bào)導(dǎo)稱為“子宮肌層側(cè)群干細(xì)胞(myosp)”之細(xì)胞可由人類子宮所分離(參考文獻(xiàn)：ono,m.,maruyama,t.,masuda,h.,kajitani,t.,nagashima,t.,arase,t.,ito,m.,ohta,k.,uchida,h.,asada,h.,etal.(2007).sidepopulationinhumanuterinemyometriumdisplaysphenotypicandfunctionalcharacteristicsofmyometrialstemcells.procnatlacadsciusa104,18700-18705(“onoetal,pnas2007”))。子宮肌層組織必須培養(yǎng)于最低酶添加(0.02％)之培養(yǎng)基中達(dá)4-16小時(shí)，接著過濾(2次)及梯度篩選(ficollpaque)，接著進(jìn)一步以胰蛋白酶處理(trypsinized)。子宮肌層側(cè)群干細(xì)胞(myosps)之特征為，能夠流出(efflux)hoechst33342染劑，其于流式細(xì)胞儀分析中顯示為“側(cè)群(sidepopulation)”，并具有cd31(+)、cd34(+)及cd44(-)。然而，子宮肌層側(cè)群干細(xì)胞無法分化成軟骨源細(xì)胞(chondrogeniccells)，亦未曾報(bào)導(dǎo)過可分化為神經(jīng)源細(xì)胞(neurogeniccells)。

galvez等人之文獻(xiàn)(galvezetal.,invivo2009)、wo2010/057965及wo2011/042547a1系揭露子宮肌層所衍生之間葉干細(xì)胞及其分離方法。所分離細(xì)胞系稱為“成人子宮肌層祖細(xì)胞(amp)”，系分離自子宮肌層組織。該子宮肌層組織系培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基，并僅選擇小室之片段進(jìn)一步培養(yǎng)。因此，該方法系用以選擇類內(nèi)皮細(xì)胞，且可據(jù)此說明結(jié)果所顯示之該等分離所得成人子宮肌層祖細(xì)胞中具有高cd31(+)比例(小鼠amp為>99.7％，人類amp為>90％)。amp之細(xì)胞表面標(biāo)記狀況為cd73(-)、cd31(+)及hla-dr(+)。僅小鼠amp之分化能力被揭露，該小鼠amp具有骨生成(osteogenesis)、脂肪生成(adipogenesis)及神經(jīng)發(fā)生(neurogenesis)，但缺乏軟骨生成(chondrogenesis)。

因此，對(duì)于獲得祖細(xì)胞之替代性來源及制備該祖細(xì)胞之方法仍有需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明系描述一種制備祖細(xì)胞之方法，包括：由子宮取得包含子宮肌層之組織樣本，以酶處理該組織樣本以移除纖維組織，及培養(yǎng)該經(jīng)處理之組織樣本以獲得該祖細(xì)胞，以及其中該祖細(xì)胞具有多能性及免疫調(diào)節(jié)性。

本發(fā)明亦提供一種由上述方法所得之祖細(xì)胞。

本發(fā)明另提供一種治療退化性疾病、缺血性疾病、或由異常免疫反應(yīng)所致之疾病之方法，系包括對(duì)罹患該疾病之病患提供由上述方法所得之祖細(xì)胞。

附圖簡(jiǎn)單說明

圖1顯示子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞(mdmp)之特征。(a)與脂肪組織衍生干細(xì)胞相較之mdmp之增殖潛能。(b)mdmp為側(cè)群(sp)細(xì)胞陰性表達(dá)。為檢測(cè)側(cè)群細(xì)胞，將mdmp與hoechst33342染劑于維拉帕米(verapamil)存在或不存在下共培養(yǎng)，維拉帕米系阻擋hoechst33342染劑之流出，即側(cè)群細(xì)胞之活性。將碘化丙啶以最終濃度為2ag/ml添加至該等細(xì)胞以將活細(xì)胞分閘，并進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，該hoechst33342染劑系于357nm激活且其熒光系以雙波長(zhǎng)分析(藍(lán)色，402–446nm；紅色，650–670nm)。(c)流式細(xì)胞儀之子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞之表面標(biāo)記圖譜，灰色填滿曲線為同型對(duì)照組：黑色未填滿曲線為所指示之抗體。(c)于子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞中，不同標(biāo)記之免疫熒光染色；比例尺為100μm。

圖2顯示子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞(mdmp)之多種系分化能力。(a)mdmp朝向骨源種系(茜素紅染色)、軟骨源種系(阿新藍(lán)染色)、脂肪源種系(油紅o染色)、及神經(jīng)源種系(相位差)之分化能力。比例尺為200μm。(b)mdmp之神經(jīng)源分化潛能之進(jìn)一步特征。于mdmp培養(yǎng)于神經(jīng)生成誘導(dǎo)條件后，以實(shí)時(shí)pcr分析神經(jīng)種系基因之基因表達(dá)(如圖中所指示)，神經(jīng)生成誘導(dǎo)條件為：無血清培養(yǎng)基添加維生素a酸(ra；0.1μm)或完全培養(yǎng)基添加y27632(y；10μm，一種rhoa激酶之抑制劑)。ctl，對(duì)照組(完全培養(yǎng)基)；*,p<0.05，與對(duì)照組比較。

圖3顯示子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞(mdmp)之體外及體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)特征。(a)mdmp可抑制經(jīng)刺激之人類外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)增殖，且較骨髓間葉干細(xì)胞(bmmsc)更為顯著。人類外周血單個(gè)核細(xì)胞先以羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(cfse，一種綠色熒光染劑)染色，以追蹤經(jīng)植物凝集素(pha)或抗cd3/28珠粒(α-cd3/28)(其更專一性地刺激t淋巴球)刺激后之細(xì)胞分裂。接著，將經(jīng)活化的cfse染色之外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)與或不與骨髓間葉干細(xì)胞(bmmsc)或子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞(mdmp)共培養(yǎng)，并以流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞分裂，低度cfse染色者代表增殖之人類外周血單個(gè)核細(xì)胞(以藍(lán)色標(biāo)記％)，左側(cè)圖式系表示代表性數(shù)據(jù)，而右側(cè)圖式系表示合并資料。(b)子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞可抑制cd4及cd8t淋巴球兩者之增殖，且較骨髓間葉干細(xì)胞更為顯著。首先以磁珠選擇cd4及cd8t淋巴球，以cfse染色，以α-cd3/28刺激，與骨髓間葉干細(xì)胞或子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞共培養(yǎng)與否，并以流式細(xì)胞儀分析低度cfse染色之t細(xì)胞(以藍(lán)色標(biāo)記％)。左側(cè)圖式系表示代表性數(shù)據(jù)，而右側(cè)圖式系表示合并資料，各組n＝4。(c)于接受人類骨髓間葉干細(xì)胞或子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞之過繼性移轉(zhuǎn)之野生型c57bl/6j小鼠中建立體內(nèi)發(fā)炎條件之實(shí)驗(yàn)策略。于細(xì)胞移轉(zhuǎn)后，以腹腔注射(i.p.)給予脂多醣(lps)刺激。于lps刺激后第3天，犧牲小鼠并自脾臟及區(qū)域性淋巴結(jié)分離出淋巴球，以評(píng)估第1型cd4細(xì)胞(th1)及調(diào)節(jié)型t細(xì)胞之t細(xì)胞次族群。(d)子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞可抑制表達(dá)干擾素-γ(ifn-γ)之th1細(xì)胞及(e)誘發(fā)cd25^high/foxp³⁺調(diào)節(jié)型t細(xì)胞，且于體內(nèi)較骨髓間葉干細(xì)胞為顯著。*,p<0.05；**,p<0.01。

實(shí)施方式

本發(fā)明系描述一種制備祖細(xì)胞之方法，包括由子宮取得包含子宮肌層之組織樣本。該分離之祖細(xì)胞為多能性及免疫調(diào)節(jié)性。

于此處，該術(shù)語“子宮肌層”意指衍生自子宮壁之中間層之組織。

于此處，該術(shù)語“子宮”系涵蓋子宮頸及子宮腔。

本發(fā)明之多能性及免疫調(diào)節(jié)性之祖細(xì)胞可由任何包含子宮肌層之組織樣本獲得，而該樣本可來自任何適當(dāng)動(dòng)物之任何適當(dāng)來源。于一實(shí)施方案中，該適當(dāng)動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，例如嚙齒目、靈長(zhǎng)目、食肉目、偶蹄目等，優(yōu)選為靈長(zhǎng)目。

于一實(shí)施方案中，該組織樣本可由非病理性術(shù)后子宮獲得。

于一優(yōu)選實(shí)施方案中，該組織樣本可由人類子宮體獲得。

于一實(shí)施方案中，該子宮可來自子宮切除術(shù)。子宮切除術(shù)為未懷孕婦女最常見之外科手術(shù)。本發(fā)明之方法能夠由子宮切除術(shù)后檢體(手術(shù)后丟棄)有效地分離出具有多種系分化能力、免疫調(diào)節(jié)作用及高增殖潛能之子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞(mpmd)。另外，本發(fā)明之方法系用以自一般可得之手術(shù)“廢棄物”制備具有高度治療應(yīng)用性之祖細(xì)胞，故不需進(jìn)行進(jìn)一步侵入性療程，且無道德倫理之爭(zhēng)議。

于本發(fā)明之方法中，該包含子宮肌層之組織樣本系以酶處理以移除纖維組織。其為一步法酶處理，不需要進(jìn)一步之處理步驟如過濾或梯度篩選等。于一實(shí)施方案中，該酶包含膠原蛋白酶。經(jīng)酶處理之組織樣本接著培養(yǎng)于血清補(bǔ)給培養(yǎng)基中，以獲得祖細(xì)胞。于一實(shí)施方案中，經(jīng)處理之組織樣本系培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基以血清及抗生素補(bǔ)充。

本發(fā)明亦提供由前述方法所得之祖細(xì)胞。該祖細(xì)胞為獨(dú)特的，且可于分離方法、分化能力、及細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)圖譜各方面與先前技術(shù)進(jìn)行區(qū)分。

該祖細(xì)胞具有細(xì)胞表面標(biāo)記cd34為陰性表達(dá)，即cd34(-)。于一實(shí)施方案中，該祖細(xì)胞具有細(xì)胞表面標(biāo)記cd44、cd73、cd90、cd105、或其任意組合為陽性表達(dá)。于一實(shí)施方案中，該祖細(xì)胞具有細(xì)胞表面標(biāo)記cd31、cd14、cd45、cd19、hla-dr、側(cè)群(sidepop)、或其任意組合為陰性表達(dá)。于一優(yōu)選實(shí)施方案中，該祖細(xì)胞具有細(xì)胞表面標(biāo)記cd44、cd73、cd90及cd105為陽性表達(dá)，且具有細(xì)胞表面標(biāo)記cd31、cd34、cd14、cd45、cd19、hla-dr及sidepop為陰性表達(dá)。

本發(fā)明之祖細(xì)胞可進(jìn)行骨生成、脂肪生成、軟骨生成、及神經(jīng)發(fā)生作用。

本發(fā)明之祖細(xì)胞具有強(qiáng)力免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)，并對(duì)cd4及cd8t淋巴球兩者均有抑制效果。

本發(fā)明之祖細(xì)胞系代表一種人類干細(xì)胞之嶄新來源，可在無道德爭(zhēng)議下進(jìn)行分離，且具有高容量之廣泛臨床應(yīng)用性。該祖細(xì)胞之臨床應(yīng)用包括，但不限于，退化性疾病、缺血性疾病、由異常免疫反應(yīng)所致之疾病等。

因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種治療退化性疾病、缺血性疾病、或由異常免疫反應(yīng)所致之疾病之方法，系包括對(duì)罹患該疾病之病患提供該祖細(xì)胞。

于一實(shí)施方案中，該退化性疾病系包括，但不限于，帕金森氏癥、阿茲海默癥、亨廷頓氏癥、腦萎縮、小腦萎縮、精神分裂癥及癡呆。

于一實(shí)施方案中，該缺血性疾病系包括，但不限于，中風(fēng)、腦中風(fēng)、腦出血、腦梗塞、頭部創(chuàng)傷、血管性癡呆及心肌梗塞。

于一實(shí)施方案中，該由異常免疫反應(yīng)所致之疾病系包括，但不限于，自體免疫疾病或器官移植之移植排斥。該自體免疫疾病包括，例如，全身性紅斑性狼瘡、多發(fā)性硬化癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、i型糖尿病、乳糜瀉、干燥綜合征(syndrome)、橋本氏甲狀腺炎、葛瑞夫茲氏癥、及特發(fā)性血小板減少性紫癜癥。

于該方法中，該病患可為哺乳動(dòng)物，例如嚙齒目、靈長(zhǎng)目、食肉目、偶蹄目等，優(yōu)選為靈長(zhǎng)目。于一實(shí)施方案中，該病患為人類。

以下以實(shí)施例詳細(xì)說明該祖細(xì)胞之制備。

實(shí)施例

材料及方法

細(xì)胞分離及培養(yǎng)

取得來自良性疾病之子宮切除術(shù)之子宮，此經(jīng)告知同意并經(jīng)本機(jī)構(gòu)審議委員會(huì)核準(zhǔn)。將子宮肌層與子宮內(nèi)膜及絨毛膜分開(dissected)并分離，接著以膠原蛋白酶iv(sigma-aldrich)降解30分鐘。接著，將樣本及上清液培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基系由杜氏改良伊果式培養(yǎng)基低葡萄糖(gibco-invitrogen,grandisland,usa)并補(bǔ)充10％胎牛血清(fbs；選定批號(hào)，hyclone,logan,ut,usa)、100u/ml青霉素及100g/ml煉霉素(sigma-aldrich,st.louis,mo,usa)所組成。細(xì)胞培養(yǎng)條件系維持在37℃，水氣飽和氛圍及5％co2。每周更換一至二次培養(yǎng)基，且當(dāng)致密度達(dá)80％時(shí)，將細(xì)胞以1：3比例進(jìn)行次培養(yǎng)。

免疫表型

為檢測(cè)表面抗原，于0.25％胰蛋白酶/edta去吸附后，以含有2％fbs之pbs洗滌數(shù)份細(xì)胞。所有抗體均購自bdbiosciences(franklinlakes,nj)。將細(xì)胞以異硫氰酸熒光素(fitc)綴合抗體或藻紅素(pe)綴合抗體染色，并與適當(dāng)同型對(duì)照組比對(duì)。流式細(xì)胞儀分析系以facscalibur流式細(xì)胞儀及cellquest軟件(bdbiosciences)進(jìn)行，如發(fā)明人先前報(bào)告所述(參考文獻(xiàn)：yen,b.l.,huang,h.i.,chien,c.c.,jui,h.y.,ko,b.s.,yao,m.,shun,c.t.,yen,m.l.,lee,m.c.,andchen,y.c.(2005).isolationofmultipotentcellsfromhumantermplacenta.stemcells23,3-9；yen,b.l.,yen,m.l.,hsu,p.j.,liu,k.j.,wang,c.j.,bai,c.h.,andsytwu,h.k.(2013).multipotenthumanmesenchymalstromalcellsmediateexpansionofmyeloid-derivedsuppressorcellsviahepatocytegrowthfactor/c-metandstat3.stemcellreports1,139-151)。側(cè)群細(xì)胞之測(cè)定方式系如先前報(bào)告所述(onoetal.pnas2007)，使用50μm維拉帕米以阻擋hoechst33342染劑(sigma-aldrich)之流出(參考文獻(xiàn)：goodell,m.a.,brose,k.,paradis,g.,conner,a.s.,andmulligan,r.c.(1996).isolationandfunctionalpropertiesofmurinehematopoieticstemcellsthatarereplicatinginvivo.jexpmed183,1797-1806)。

分化研究及特征

對(duì)脂肪生成、骨生成及軟骨生成之種系分化之進(jìn)行及定性方式，系如本案發(fā)明人及其它人先前報(bào)告所述(參考文獻(xiàn)：liu,k.j.,wang,c.j.,chang,c.j.,hu,h.i.,hsu,p.j.,wu,y.c.,bai,c.h.,sytwu,h.k.,andyen,b.l.(2011).surfaceexpressionofhla-gisinvolvedinmediatingimmunomodulatoryeffectsofplacenta-derivedmultipotentcells(pdmcs)towardsnaturalkillerlymphocytes.celltransplant20,1721-1730；pittenger,m.f.,mackay,a.m.,beck,s.c.,jaiswal,r.k.,douglas,r.,mosca,j.d.,moorman,m.a.,simonetti,d.w.,craig,s.,andmarshak,d.r.(1999).multilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcells.science284,143-147)。以標(biāo)準(zhǔn)方法誘導(dǎo)神經(jīng)分化，如參考文獻(xiàn)所報(bào)告之方式進(jìn)行；簡(jiǎn)言之，以低密度(1000細(xì)胞/cm³)將細(xì)胞培養(yǎng)于添加0.5μm維生素a酸之無血清培養(yǎng)基，或于添加10μmy-27632之完全培養(yǎng)基(參考文獻(xiàn)：sanchez-ramos,j.r.,song,s.,kamath,s.g.,zigova,t.,willing,a.,cardozo-pelaez,f.,stedeford,t.,chopp,m.,andsanberg,p.r.(2001).expressionofneuralmarkersinhumanumbilicalcordblood.expneurol171,109-115；wang,c.h.,wu,c.c.,hsu,s.h.,liou,j.y.,li,y.w.,wu,k.k.,lai,y.k.,andyen,b.l.(2013).theroleofrhoakinaseinhibitioninhumanplacenta-derivedmultipotentcellsonneuralphenotypeandcellsurvival.biomaterials34,3223-3230(“wangetal.”))。所有試劑均購自sigma-aldrich，除了軟骨生成分化所用之tgf-β3，其系購自r&dsystems(minneapolis,mn)。

免疫熒光染色

以先前所報(bào)告之方式進(jìn)行神經(jīng)特征之免疫熒光染色(wangetal.)。簡(jiǎn)言之，經(jīng)培養(yǎng)之細(xì)胞以多聚甲醛(pfa)(sigma-aldrich)于室溫下固定10分鐘，并以0.1％曲拉通-x100(sigma-aldrich)透化10分鐘。抗人類抗原中間絲蛋白(nestin)及膠質(zhì)原纖維酸性蛋白之一抗系購自chemicon(temecula,ca)；抗α-sma之一抗系購自sigma-aldrich。樣本首先與一抗培養(yǎng)于4℃隔夜，接著以pbs潤(rùn)洗三次，并與fitc-綴合之二抗以1：100稀釋度于室溫下培養(yǎng)60分鐘。所有樣本均以4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi,1:2000；molecularprobes)染色。于熒光顯微鏡(olympus,tokyo,japan)下觀察染色。

細(xì)胞增殖評(píng)估

以第2代(p2)細(xì)胞進(jìn)行接種，初始密度為1.5x10⁴細(xì)胞/cm²。當(dāng)次致密生長(zhǎng)(sub-confluentgrowth)至密度為80％時(shí)，進(jìn)行一般細(xì)胞胰蛋白酶化并以初始密度重涂(replated)。生長(zhǎng)曲線測(cè)定方式系如發(fā)明人之文獻(xiàn)所述(hoetal.)。

反轉(zhuǎn)錄pcr(rtpcr)

rna之分離及rtpcr之進(jìn)行方法系如發(fā)明人之文獻(xiàn)所述(hoetal.)。引物如下：

neurod：正向引物ctgatctggtctccttcgtacag、反向引物gatgcgaatggctatcgaaag；

sox1：正向引物aaagtcaaaacgaggcgaga、反向引物aagtgcttggacctgcctta；及

中間絲蛋白：正向引物aacagcgacggaggtctcta、反向引物ttctcttgtcccgcagactt。

利用β-肌動(dòng)蛋白(引物：正向tggcaccacaccttctacaatgagc，反向gcacagcttctccttaatgtcacgc)常態(tài)化后進(jìn)行定量。

祖細(xì)胞/干細(xì)胞及人類外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)/淋巴球共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

pbmc相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行方式類似于本案發(fā)明人先前所述方法(chang,c.j.,yen,m.l.,chen,y.c.,chien,c.c.,huang,h.i.,bai,c.h.,andyen,b.l.(2006).placenta-derivedmultipotentcellsexhibitimmunosuppressivepropertiesthatareenhancedinthepresenceofinterferon-gamma.stemcells24,2466-2477("changetal.")；chen,p.m.,liu,k.j.,hsu,p.j.,wei,c.f.,bai,c.h.,ho,l.j.,sytwu,h.k.,andyen,b.l.(2014)inductionofimmunomodulatorymonocytesbyhumanmesenchymalstemcell(msc)-derivedhepatocytegrowthfactor(hgf)througherk1/2.jleukocbiol95,295-303("chenetal."))。簡(jiǎn)言之，由健康提供者之血液樣本(臺(tái)灣血液基因會(huì)，臺(tái)北捐血中心)之棕黃層分離出人類外周血單個(gè)核細(xì)胞，此經(jīng)告知同意并經(jīng)本機(jī)構(gòu)審議委員會(huì)核準(zhǔn)，并如先前報(bào)告所述方式進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)分離之外周血單個(gè)核細(xì)胞先以羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(cfse；gibco-invitrogen)(一種綠色熒光染劑)染色，以追蹤經(jīng)植物凝集素(pha；sigma-aldrich)或抗cd3/28珠粒(α-cd3/28；dynabeads)(其更專一性地刺激t淋巴球)刺激后之細(xì)胞分裂。在與經(jīng)刺激之外周血單個(gè)核細(xì)胞(1x10⁵)共培養(yǎng)之前，將祖細(xì)胞/干細(xì)胞(子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞或骨髓間葉干細(xì)胞)每孔3.5x10⁴細(xì)胞平涂于6孔平盤上，并培養(yǎng)于37℃達(dá)24小時(shí)。進(jìn)一步培養(yǎng)3天后，獲取細(xì)胞并以流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)cfse染色密度或不同蛋白質(zhì)(表面標(biāo)記、細(xì)胞激素、轉(zhuǎn)錄因子等)之表達(dá)。

小鼠體內(nèi)試驗(yàn)

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均依據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照護(hù)與使用委員會(huì)核準(zhǔn)之流程進(jìn)行。野生型c57bl/6j小鼠系購自臺(tái)灣實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(臺(tái)灣，臺(tái)北)。于體內(nèi)誘發(fā)促發(fā)炎性白介素之方式類似于參考文獻(xiàn)所述方法(shi,g.,vistica,b.p.,nugent,l.f.,tan,c.,wawrousek,e.f.,klinman,d.m.,andgery,i.(2013).differentialinvolvementofth1andth17inpathogenicautoimmuneprocessestriggeredbydifferenttlrligands.jimmunol191,415-423)。簡(jiǎn)言之，將脂多醣(lps；100μg,escherichiacoli00041:b4；sigma-aldrich)以腹腔注射至8至12周齡小鼠，2小時(shí)后，子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞或骨髓間葉干細(xì)胞(1x10⁵細(xì)胞/小鼠)擇一進(jìn)行轉(zhuǎn)移。3日后犧牲小鼠并自脾臟與區(qū)域淋巴結(jié)取得白血球，以先前報(bào)告之方法評(píng)估th1細(xì)胞及tregs(chenetal；changetal)。

結(jié)果

來自人類子宮體之多能性祖細(xì)胞之特征

子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞(mdmp)系分離自良性檢驗(yàn)結(jié)果之子宮切除術(shù)后檢體。與分離自脂肪組織之體祖細(xì)胞(為目前分離人類治療性祖細(xì)胞最受青睞的來源)相較，該等子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞具有高度增殖性(圖1a)。該子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞之特征顯示，該等祖細(xì)胞并未流出hoechst染劑，故不符合側(cè)群細(xì)胞之圖譜(圖1b)。就表面標(biāo)記表達(dá)而言，子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞之cd90、cd73、cd105及cd44呈陽性，但內(nèi)皮標(biāo)記cd31及包括cd34、cd14、cd45、cd19及hla-dr之許多造血標(biāo)記呈陰性(圖1c)。有趣的是，子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞對(duì)于兩種神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記：中間絲蛋白及gfap，系呈陽性(圖1d)。又，雖然子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞系分離自由平滑肌所構(gòu)成之器官，但該等細(xì)胞對(duì)平滑肌之α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-sma)呈陰性(圖1d)，暗示了子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞并不包含分化終端之子宮體平滑肌細(xì)胞。

子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞具有多種系潛能

接著評(píng)估子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞之分化潛能。發(fā)現(xiàn)子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞可分化成復(fù)數(shù)細(xì)胞種系，包括骨生成種系、軟骨生成種系、脂肪生成種系及神經(jīng)生成種系(圖2a)。進(jìn)一步檢驗(yàn)子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞之神經(jīng)生成分化潛能之特征，顯示當(dāng)培養(yǎng)于不同的神經(jīng)生成誘發(fā)條件下，此等祖細(xì)胞之部分神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)基因，如sox1、中間絲蛋白及neurod，表達(dá)量增加(圖2b)。因此，子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞具有多種系分化潛能，且具有廣泛應(yīng)用性，可應(yīng)用于骨生成疾病，包含骨折、骨質(zhì)疏松、成骨不全癥；軟骨生成疾病，包含骨關(guān)節(jié)炎及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；以及，神經(jīng)性疾病，包含中風(fēng)、帕金森氏癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥及癡呆。

子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞具有較骨髓間葉干細(xì)胞更為顯著之體外與體內(nèi)之免疫調(diào)節(jié)能力

越來越多證據(jù)顯示，發(fā)炎作用系涉及先前未曾聯(lián)想到此癥狀之復(fù)數(shù)疾病實(shí)體，且其包含流行病學(xué)之主要疾病，包含神經(jīng)退化性疾病、缺血性疾病及癌癥。子宮被視為具有獨(dú)特的免疫環(huán)境(moffett-king,a.(2002).naturalkillercellsandpregnancy.natrevimmunol2,656-663)，因此，檢驗(yàn)子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞是否具有免疫調(diào)節(jié)效果。為了評(píng)估子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞是否為免疫抑制性，進(jìn)行混合淋巴球反應(yīng)，使用經(jīng)刺激之人類外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)并同時(shí)與子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞(mdmp)或骨髓間葉干細(xì)胞(bmmsc)擇一共培養(yǎng)，骨髓間葉干細(xì)胞為一已知之免疫調(diào)節(jié)類型之干細(xì)胞/祖細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞之共培養(yǎng)，不僅抑制了經(jīng)植物凝集素或抗cd3/28珠粒擇一刺激之外周血單個(gè)核細(xì)胞之增殖，當(dāng)子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，更較骨髓間葉干細(xì)胞具有更為顯著的抑制性(圖3a)。又，子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞對(duì)cd4及cd8t淋巴球兩者具有抑制效果，cd4及cd8t淋巴球系參與許多免疫相關(guān)疾病之關(guān)鍵調(diào)控之兩組白血球，且較骨髓間葉干細(xì)胞具有更為顯著之抑制效果。另外，于發(fā)炎反應(yīng)之體內(nèi)模式中，與骨髓間葉干細(xì)胞相較，子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞可顯著地抑制輔助型t細(xì)胞功能，如干擾素γ分泌之cd4細(xì)胞(th1細(xì)胞)所表示，及增加免疫調(diào)節(jié)作用，如cd4⁺/cd25^high/foxp³⁺調(diào)節(jié)型t細(xì)胞所表示(圖3c&d)。故，子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞具有高度免疫調(diào)節(jié)性，且應(yīng)可應(yīng)用于治療免疫及發(fā)炎相關(guān)疾病，如自體免疫疾病、腸道炎癥、器官排斥、神經(jīng)退化性疾病及缺血性疾病。

子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞與先前技術(shù)之比較

參照表1，系顯示比較之摘要結(jié)果。

onoetal.(onoetal,pnas2007)揭露子宮肌層側(cè)群干細(xì)胞(myosps)之分離方法為：將子宮肌層組織培養(yǎng)于最小酶添加(0.02％)之培養(yǎng)基中達(dá)4-16小時(shí)，接著進(jìn)行過濾(2次)及梯度篩選(ficollpaque)，再將該組織進(jìn)一步以胰蛋白酶處理。

galvezetal.,invivo2009、wo2010/057965及wo2011/042547a1揭露成人子宮肌層祖細(xì)胞(amp)之分離方法為：將該子宮肌層組織培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基，并僅選擇小室之片段進(jìn)一步培養(yǎng)。該方法似選擇類內(nèi)皮細(xì)胞，且可據(jù)此說明結(jié)果所顯示之該等分離所得成人子宮肌層祖細(xì)胞中具有高cd31(+)比例(小鼠amp為>99.7％，人類amp為>90％)。

于本發(fā)明之方法中，系應(yīng)用一步法之酶處理，處理時(shí)間低于1小時(shí)，不需過濾或梯度選擇，并培養(yǎng)于血清補(bǔ)給培養(yǎng)基。另外，本發(fā)明亦不需使用小室之片段進(jìn)一步培養(yǎng)。

子宮肌層側(cè)群干細(xì)胞(myosp)之特征系藉由流出hoechst33342染劑之能力，其顯示于流式細(xì)胞儀分析為“側(cè)群細(xì)胞”，但本發(fā)明并未獲得此種細(xì)胞(參見圖1b)。myosp展現(xiàn)cd31(+)、cd34(+)及cd44(-)；amp展現(xiàn)cd31(+)、cd73(-)及hla-dr(+)。然而，本發(fā)明之子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞為cd31(-)、cd34(-)、cd44(+)、cd73(+)及hla-dr(-)(參見圖1c)。

另外，myosp無法分化為軟骨源細(xì)胞，亦未曾報(bào)導(dǎo)過可分化為神經(jīng)源細(xì)胞，但子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞可以。onoetal.并未探討myosp之免疫調(diào)節(jié)作用，但myosp應(yīng)無法具備此功能，因?yàn)槠錇閏d34(+)及cd31(+)，暗示了造血功能及可能為免疫原性。

僅測(cè)試小鼠amp之分化能力，但未測(cè)試人類amp。小鼠amp具有骨生成、脂肪生成及神經(jīng)發(fā)生，但未報(bào)導(dǎo)軟骨生成。amp之免疫調(diào)節(jié)能力于上述文獻(xiàn)中均未被探討，但amp在基在線為hla-dr(+)，故可能為免疫原性。

很顯然地，本發(fā)明之子宮肌層衍生之多能性祖細(xì)胞具有與myosp及amp不同之特征。

表1、

上述特定實(shí)施例之內(nèi)容系為了詳細(xì)說明本發(fā)明，然而，該等實(shí)施例系僅用于說明，并非意欲限制本發(fā)明。熟習(xí)本領(lǐng)域之技藝者可理解，在不悖離后附申請(qǐng)專利范圍所界定之范疇下針對(duì)本發(fā)明所進(jìn)行之各種變化或修改系落入本發(fā)明之一部分。