本發(fā)明涉及一種藥物載體，具體涉及一種嵌段聚合物、含有其的藥物載體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥即惡性腫瘤，是由于人體細(xì)胞的正常增殖機(jī)制被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖，人體代謝失衡，組織和器官的結(jié)構(gòu)與功能受損，最終患者會(huì)因器官衰竭而死亡。而隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展和人口的老齡化，癌癥成為發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家人體健康的頭號(hào)殺手，其中乳腺癌、肺癌、直腸癌在發(fā)展中國家發(fā)病率最高。目前，對(duì)于癌癥的預(yù)防與治療主要通過早期的診斷和治療，煙草控制，以及疫苗的使用(肝癌、宮頸癌)等，同時(shí)向大眾不斷普及癌癥預(yù)防與控制知識(shí)也能很大程度的減輕癌癥帶來的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)負(fù)擔(dān)。

癌癥目前的治療方式主要是手術(shù)并配合放射治療與化學(xué)治療。在傳統(tǒng)的癌癥治療中，藥物治療是主要的治療方式之一，即化療?；熓峭ㄟ^對(duì)患者進(jìn)行全身或者局部給藥，實(shí)現(xiàn)對(duì)惡性增殖細(xì)胞的抑制并殺死腫瘤細(xì)胞?；熕幬锏姆N類主要有烷化劑(卡氮芥、環(huán)磷酰胺)，抗代謝藥物(吉西他濱、卡莫氟)，抗腫瘤抗生素(阿霉素、吡喃阿霉素)，抗腫瘤動(dòng)植物成分藥物(紫杉醇、羥基喜樹堿)，抗腫瘤激素類藥物(他莫昔芬、阿他美坦)及一些雜類如順鉑、樂沙定等。但是，傳統(tǒng)抗癌藥物的作用機(jī)理是根據(jù)腫瘤細(xì)胞惡性增殖、代謝旺盛的特性對(duì)其生長進(jìn)行抑制并達(dá)到殺死癌細(xì)胞的目的，這一性質(zhì)導(dǎo)致此類藥物不僅抑制癌細(xì)胞增殖，對(duì)正常的組織細(xì)胞生長也會(huì)產(chǎn)生抑制作用。因此，針對(duì)這一問題，為了提高對(duì)癌細(xì)胞的抑制效果并降低對(duì)正常細(xì)胞的傷害，能夠靶向作用的藥物載體成為藥劑學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

靶向藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(targetdrugdeliverysystem，tdds)包括作為藥物載體的脂質(zhì)體、乳劑、微囊和微球、納米囊、或納米球等，其功能是將藥物靶向運(yùn)輸?shù)阶饔貌课徊⒏患Ａ粢欢螘r(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)藥效的提升，降低藥物的生物毒性。peg-plga嵌段共聚物作為制備納米粒子載體的原料應(yīng)用前景廣闊，但由于peg主鏈上缺少易于功能化修飾的官能團(tuán)，使得其作為藥物載體的應(yīng)用受到了一定限制。聚[n-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺](phpma)作為水溶性高分子聚合物，生物毒性低且具有優(yōu)良的生化性能和良好的可功能化性，通過自身的羥基 反應(yīng)或者與其他功能性單體共聚合的方法可以制備含有不同功能基團(tuán)的聚合物；大分子量的phpma具有epr(增強(qiáng)的滲透和滯留)效應(yīng)，有利于其在腫瘤部位的聚集，可替代peg作為聚合物材料的親水嵌段。但是，由于目前phpma載體的制備普遍采用普通自由基聚合，制備所得的聚合物分子量不可控，且分子量分布很寬，會(huì)對(duì)載體的epr效應(yīng)以及藥物的釋放產(chǎn)生嚴(yán)重影響，進(jìn)一步則會(huì)影響到藥物對(duì)腫瘤的治療效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種嵌段聚合物、含有其的藥物載體及其制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明提供一種嵌段聚合物，其聚合單體包括第一單體和第二單體，所述第一單體為交酯或內(nèi)酯中的一種或多種，所述第二單體為(甲基)丙烯酸酯類化合物或(甲基)丙烯酰胺類化合物中的一種或多種，所述嵌段聚合物以r-oh作為引發(fā)劑引發(fā)第一單體開環(huán)聚合(rop)，然后以所得的端基為r基團(tuán)的聚合物作為大分子引發(fā)劑引發(fā)第二單體的進(jìn)一步聚合而得；其中，r為具有可逆加成斷裂轉(zhuǎn)移(raft)或原子轉(zhuǎn)移自由基(atrp)聚合活性的基團(tuán)。

根據(jù)本發(fā)明，所述r-oh為下述式(i)～式(iii)所示化合物的一種：

其中，r1為具有raft聚合活性的烷基二硫代酯基、芳基二硫代酯基、烷基三硫代碳酸酯基、芳基三硫代碳酸酯基、烷基磺酸酯基、芳基磺酸酯基、烷基二硫代氨基甲酸酯基或芳基二硫代氨基甲酸酯基；

r2為r1、具有atrp引發(fā)活性的含氯原子(cl)或溴原子(br)的基團(tuán)、或r4-co-nh-r3-；

r3為-gflg-、-gplgiagq-或-gplgiagqkkkkkkkk-等多肽；

r4為r1、或者具有atrp引發(fā)活性的含氯原子(cl)或溴原子(br)的基團(tuán)。

優(yōu)選地，r1中，烷基為c8-16烷基，優(yōu)選為c12烷基；芳基為苯基或萘基，優(yōu)選為苯基。

優(yōu)選地，r1為苯基二硫代酯基或者十二烷基三硫代碳酸酯基。

優(yōu)選地，所述含氯原子(cl)或溴原子(br)的基團(tuán)例如為2-溴異丙基、2-氯異丙基、 2-氯乙基、2-溴乙基、2-氯丁基或2-溴丁基。

優(yōu)選地，r2為苯基二硫代酯基、十二烷基三硫代碳酸酯基或2-溴異丙基。

優(yōu)選地，所述交酯為丙交酯(la)或乙交酯(ga)；所述內(nèi)酯為己內(nèi)酯(cl)。

優(yōu)選地，所述(甲基)丙烯酸酯類化合物或(甲基)丙烯酰胺類化合物為(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺或n-(羥基烷基)(甲基)丙烯酰胺。優(yōu)選地，n-(羥基烷基)(甲基)丙烯酰胺中的烷基為c1-6烷基，進(jìn)一步優(yōu)選為c2-4烷基，例如為丙基。更優(yōu)選地，n-(羥基烷基)(甲基)丙烯酰胺為n-(2’-羥基)丙基甲基丙烯酰胺(hpma)。

根據(jù)本發(fā)明，所述聚合物的通式如式(iv)所示：

式(iv)中，r’可為r1、氯原子(cl)或溴原子(br)；x可為-c(ch3)(cn)ch2ch2ch2-、-c(ch3)(cn)ch2ch2c(o)och2ch2-、-c(ch3)(cn)ch2ch2c(o)och2ch2-s-s-ch2ch2-、-c(ch3)(ch3)c(o)och2ch2-、-c(ch3)(ch3)c(o)och2ch2-s-s-ch2ch2-、-c(ch3)(cn)ch2ch2c(o)nh-gflg-c(o)och2ch2-、-c(ch3)(ch3)c(o)nh-gflg-c(o)och2ch2-、-c(ch3)(cn)ch2ch2c(o)nh-gplgiagq-c(o)och2ch2-、-c(ch3)(cn)ch2ch2c(o)nhgplgiagqkkkkkkkk-c(o)och2ch2-、-c(ch3)(ch3)c(o)nh-gplgiagq-c(o)och2ch2-、-c(ch3)(ch3)c(o)nh-gplgiagqkkkkkkkk-c(o)och2ch2-等非響應(yīng)性、還原響應(yīng)性或酶響應(yīng)性連接鍵；y可為-c(ch3)-、-ch2-、-(ch2)5-中的一種或多種(如前兩種)；m為5000-20000，n為1000-20000。

根據(jù)本發(fā)明，所述聚合物的通式如式(v)所示：

式(v)中，m為5000-20000，n為1000-20000。

根據(jù)本發(fā)明，其中第二單體部分的摩爾含量為20mol％-80mol％。

根據(jù)本發(fā)明，所述嵌段聚合物為兩親性嵌段共聚物，其數(shù)均分子量為6000～40000，分子量分布指數(shù)pdi＜1.2。其中疏水段分子量為1000-20000，例如分別為2000、5000、10000、20000，親水段(如phpma)分子量為5000-20000，例如分別為5000、10000、20000。

本發(fā)明提供一種制備上述嵌段聚合物的方法，其包括以下步驟：

(1)以r-oh作為引發(fā)劑引發(fā)第一單體開環(huán)聚合，然后

(2)以所得的端基為r基團(tuán)的聚合物作為大分子鏈轉(zhuǎn)移劑引發(fā)第二單體的進(jìn)一步聚合，得到所述嵌段聚合物；

其中，r為具有可逆加成斷裂轉(zhuǎn)移(raft)或原子轉(zhuǎn)移自由基(atrp)聚合活性的基團(tuán)，所述第一單體為交酯或內(nèi)酯中的一種或多種，所述第二單體為(甲基)丙烯酸酯類化合物或(甲基)丙烯酰胺類化合物中的一種或多種。

根據(jù)本發(fā)明，所述引發(fā)劑r-oh，以4-十二烷基三硫代碳酸酯基-4-氰基戊醇為例，合成步驟可細(xì)分為兩步，首先將十二烷基硫醇與二硫化碳以及對(duì)甲苯磺酰氯反應(yīng)合成雙十二烷基雙三硫代碳酸酯，然后通過雙十二烷基雙三硫代碳酸酯與4，4’-偶氮雙(4-氰基戊醇)反應(yīng)制備4-十二烷基三硫代碳酸酯基-4-氰基戊醇。

根據(jù)本發(fā)明，所述步驟(1)具體為：在惰性氣體(如氬氣)環(huán)境中，加入溶劑、r-oh引發(fā)劑、催化劑和第一單體，開環(huán)聚合，得到端基為r基團(tuán)的聚合物，也即大分子鏈轉(zhuǎn)移劑。

優(yōu)選地，步驟(1)中，所述溶劑選自三氯甲烷、四氫呋喃、n，n-二甲基甲酰胺、甲苯或二甲基亞砜等。所述催化劑為4-二甲氨基吡啶(dmap)、7-甲基-1，5，7-三氮雜二環(huán)[4.4.0]癸-5-烯(mtbd)、1，5-二氮雜二環(huán)[4.3.0]壬-5-烯(dbn)、1，8-二氮雜二環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯(dbu)或1，5，7-三氮雜二環(huán)[4.4.0]癸-5-烯(tbd)等。

優(yōu)選地，第一單體為交酯時(shí)，所述催化劑為dbu；第一單體為內(nèi)酯時(shí)，所述催化劑為 tbd。

優(yōu)選地，步驟(1)中，所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度為30～60℃，優(yōu)選40～50℃，更優(yōu)選45℃；反應(yīng)時(shí)間為30-70分鐘，優(yōu)選40-60分鐘，更優(yōu)選45分鐘。

優(yōu)選地，步驟(1)中，所述第一單體與r-oh引發(fā)劑的摩爾比為50～150∶1，優(yōu)選地80～120∶1，更優(yōu)選100∶1。所述第一單體與催化劑的摩爾比為500～1500∶1，優(yōu)選地800～1200∶1，更優(yōu)選1000∶1。

根據(jù)本發(fā)明，所述步驟(2)具體為：在惰性氣體(如氬氣)環(huán)境中，加入溶劑、上述的大分子鏈轉(zhuǎn)移劑、第二引發(fā)劑和第二單體，進(jìn)行可逆加成斷裂轉(zhuǎn)移(raft)或原子轉(zhuǎn)移自由基(atrp)聚合反應(yīng)，得到本發(fā)明的兩親性嵌段聚合物。

優(yōu)選地，步驟(2)中，所述溶劑為二甲基亞砜。所述第二引發(fā)劑為4，4’-偶氮二(4-氰基戊酸)(v501)

優(yōu)選地，步驟(2)中，所述raft或atrp聚合反應(yīng)的反應(yīng)溫度為50～90℃，優(yōu)選60～80℃，更優(yōu)選70℃；反應(yīng)時(shí)間為12～36小時(shí)，優(yōu)選20～30小時(shí)，更優(yōu)選24小時(shí)。

優(yōu)選地，步驟(2)中，將raft或atrp聚合反應(yīng)所得反應(yīng)液濃縮后于沉淀劑(如異丙醇)中沉淀除去未反應(yīng)的單體即可得到純化的兩親性嵌段共聚物。

本發(fā)明提供一種藥物載體，其含有上述聚合物。

根據(jù)本發(fā)明，所述聚合物制備成聚合物納米粒子，含有聚合物納米粒子的載體可以進(jìn)行被動(dòng)靶向給藥，具體的是長循環(huán)抗腫瘤靶向藥物載體。

本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其含有上述藥物載體。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，含有本發(fā)明聚合物的藥物載體能夠遞送的藥物并不受限制，各種藥物都可以使用本發(fā)明的藥物載體來遞送。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的藥物載體可以用來遞送需要緩釋或者控釋的藥物，包括但不限于抗腫瘤藥、抗感染藥、激素類藥物等，所述抗腫瘤藥物包括但不限于抗腫瘤大分子，如具有抗腫瘤能力的蛋白質(zhì)、多肽、質(zhì)粒dna、sirna等，抗腫瘤小分子如7-乙基-10-羥基喜樹堿(sn38)、紫杉醇(ptx)或阿霉素(dox)等。

本發(fā)明進(jìn)一步提供所述聚合物作為藥物載體(特別是抗腫瘤藥物被動(dòng)靶向藥物載體)的應(yīng)用或作為熒光指示劑載體的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果有：

本發(fā)明采用以r-oh作為引發(fā)劑的開環(huán)聚合(rop)以及可逆加成斷裂轉(zhuǎn)移(raft)或原子轉(zhuǎn)移自由基(atrp)聚合的方法，通過兩步簡單、高效的合成出本發(fā)明的兩親性嵌段共聚物；而且該反應(yīng)催化效率極高，較傳統(tǒng)的辛酸亞錫催化所需時(shí)間大大縮短。另外，相較于傳統(tǒng)的普通自由基聚合所制備的聚合物分子量不可控且分子量分布較寬，通過本發(fā)明方法制備的兩親性嵌段聚合物分子量組成可調(diào)，分子量可控，分子量分布窄(＜1.2)。

本發(fā)明的嵌段聚合物制備的藥物載體，能夠有效延長藥物在血液中的循環(huán)時(shí)間，并還可以通過主動(dòng)靶向或被動(dòng)靶向作用定向富集至腫瘤病灶部位，此外，與傳統(tǒng)的聚乙二醇修飾的納米粒子相比較能夠減輕血液加速清除效應(yīng)，減輕多次給藥過程中藥物的損失和對(duì)正常器官的毒副作用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明提供的兩親性嵌段共聚物以pdlla-b-phpma為例的合成路線示意圖。

圖2是本發(fā)明方法制備的pdlla的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析曲線。

圖3是本發(fā)明制備的pdlla的gpc曲線。

圖4是本發(fā)明制備的pdlla-b-phpma的gpc曲線。

圖5是本發(fā)明制備的pdlla-b-phpma的¹hnmr譜圖。

圖6是本發(fā)明制備的pdlla-b-phpma納米粒子隨時(shí)間在小鼠巨噬細(xì)胞raw264.7內(nèi)吞噬量變化的clsm圖。

圖7是通過流式細(xì)胞儀檢測得到的本發(fā)明制備的pdlla-b-phpma納米粒子在小鼠巨噬細(xì)胞raw264.7內(nèi)的吞噬量。

圖8是本發(fā)明制備的pdlla-b-phpma納米粒子與pdlla-b-peg納米粒子作為藥物載體第一次給藥后的血液清除實(shí)驗(yàn)。

圖9是本發(fā)明制備的pdlla-b-phpma納米粒子與pdlla-b-peg納米粒子作為藥物載體第二次給藥后的血液清除實(shí)驗(yàn)。

圖10是本發(fā)明制備的pdlla-b-phpma納米粒子與pdlla-b-peg納米粒子兩次給藥24小時(shí)后熒光強(qiáng)度之間的差異。

圖11是本發(fā)明制備的pdlla-b-phpma納米粒子在小鼠體內(nèi)分布的活體成像圖片；其中，在活體或器官中黑色部分為熒光信號(hào)最強(qiáng)，白色部分熒光信號(hào)最弱。

具體實(shí)施方式

如上所述，本發(fā)明公開了一種嵌段聚合物和包含該聚合物的藥物載體。本發(fā)明的嵌段聚合物能夠有效延長藥物在血液中的循環(huán)時(shí)間，因而可以作為緩釋藥物的載體使用；其次，本發(fā)明的嵌段聚合物還可以通過主動(dòng)靶向或被動(dòng)靶向作用定向富集至腫瘤病灶部位，因而可以作為長循環(huán)抗腫瘤靶向藥物載體使用。根據(jù)應(yīng)用要求，本發(fā)明的嵌段聚合物可通過物理包埋的方式作為抗腫瘤藥物載體包埋疏水性藥物，通過制備的嵌段聚合物納米粒子的尺寸效應(yīng)以及腫瘤組織的增強(qiáng)滲透與滯留效應(yīng)(enhancedpermeabilityandretention，epr效應(yīng))對(duì)腫瘤實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向給藥。

本發(fā)明中，為驗(yàn)證phpma較peg的“隱身”性能差異，制備納米粒子包載尼羅紅作為熒光探針，通過共聚焦激光掃描顯微鏡(clsm)觀察小鼠巨噬細(xì)胞raw264.7對(duì)聚合物納米粒子的吞噬量隨時(shí)間的變化，并使用流式細(xì)胞儀定量檢測各實(shí)驗(yàn)組中聚合物的吞噬量。其次，由于peg作為藥物載體時(shí)具有加速血液清除(acceleratedbloodclearance，abc)效應(yīng)，為了驗(yàn)證phpma的引入對(duì)載藥體系abc效應(yīng)的緩解，分別制備pdlla-b-peg和pdlla-b-phpma的納米粒子包載cy7.5，二次給藥后考察藥物載體在小鼠血液中的清除速率。再有，為驗(yàn)證該嵌段聚合物的生物分布及腫瘤靶向效果，制備納米粒子過程中包載疏水性熒光染料cy7.5作為熒光探針，通過小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)觀察嵌段聚合物進(jìn)入小鼠體內(nèi)后的循環(huán)及富集情況。

下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

本發(fā)明所述數(shù)均分子量及分子量分布指數(shù)通過dmf相凝膠滲透色譜(gpc)以及¹h核磁共振光譜(¹hnmr)測量得到。

實(shí)施例1、4-十二烷基三硫代酯基-4-氰基戊醇(cta-oh)的合成

取1000ml圓底燒瓶，將14.6gkoh加入450ml水中，再緩慢加入40.4g(48ml)十二烷基硫醇得到乳濁液狀溶液，同時(shí)緩慢加入0.8g甲基三辛基氯化銨和14.4g(12.06ml)cs2的混合溶液，觀察到溶液由土黃色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色最終為橙色。室溫反應(yīng)1小時(shí)后于冰鹽浴(nacl) 中冷卻至-5℃，緩慢加入20g對(duì)甲苯磺酰氯，保持-5℃條件反應(yīng)2小時(shí)后于45℃水浴中反應(yīng)45分鐘生成橘色油狀產(chǎn)物，冰水浴冷卻1小時(shí)形成固體產(chǎn)物，抽濾并用冰水水洗數(shù)次除去水溶性雜質(zhì)。再于丙酮中重結(jié)晶純化：于61℃水浴中逐漸加丙酮，不斷攪拌至溶解平衡即可，待冷卻至室溫后置于-20℃冰箱中過夜重結(jié)晶。將抽濾得到的晶體溶于150ml石油醚中，加無水naso4攪拌1小時(shí)除水，濃縮后通過柱層析分離純化，流動(dòng)相為石油醚，所得產(chǎn)物為雙十二烷基雙三硫代碳酸酯。取所得純化產(chǎn)物5g與4.5g4，4`-偶氮雙(4-氰基戊醇)溶于150ml乙酸乙酯中冷凝回流避光反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)溫度為95℃，得到的終產(chǎn)物再次通過柱層析分離純化回收，流動(dòng)相為石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1。

所述雙十二烷基雙三硫代碳酸酯的結(jié)構(gòu)式如下：

實(shí)施例2、乙二醇單4-十二烷基三硫代酯基-4-氰基戊酸酯的合成

取實(shí)施例1中所制備雙十二烷基雙三硫代碳酸酯5g與5g4，4`-偶氮雙(4-氰基戊酸)溶于150ml乙酸乙酯中冷凝回流避光反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)溫度為95℃，得到的終產(chǎn)物再次通過柱層析分離純化回收，流動(dòng)相為石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1。所得產(chǎn)物4.03g與3.1g乙二醇溶于50ml無水二氯甲烷，加入4.5g二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)和0.2g4-二甲氨基吡啶(dmap)催化進(jìn)行酯化反應(yīng)，反應(yīng)48小時(shí)后過濾除去產(chǎn)生的副產(chǎn)物二環(huán)己基脲，得到的終產(chǎn)物再次通過柱層析分離純化回收，流動(dòng)相為石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1。

實(shí)施例3、乙二醇單2-溴異丁酸酯的合成

取9.3g乙二醇和2.02g三乙胺溶于100ml二氯甲烷中，采用冰水浴將體系溫度降到5℃，使用恒壓滴液漏斗緩慢滴加4.6g2-溴異丁酰溴，滴加完畢后反應(yīng)24小時(shí)。待反應(yīng)完畢后過濾除去產(chǎn)生的三乙胺氫溴酸鹽，濾液分別用1％碳酸氫鈉水溶液和純水洗三次。收集有機(jī)相加入無水硫酸鈉干燥后旋蒸濃縮除去有機(jī)溶劑得純凈產(chǎn)物。

實(shí)施例4、雙羥乙基二硫化物單2-溴異丁酸酯

取12g雙(2-羥乙基)二硫化物和2.02g三乙胺溶于100ml二氯甲烷中，采用冰水浴將體系溫度降到5℃，使用恒壓滴液漏斗緩慢滴加4.6g2-溴異丁酰溴，滴加完畢后反應(yīng)24小時(shí)。待反應(yīng)完畢后過濾除去產(chǎn)生的三乙胺氫溴酸鹽，濾液分別用1％碳酸氫鈉水溶液和純水洗三次。收集有機(jī)相加入無水硫酸鈉干燥后旋蒸濃縮除去有機(jī)溶劑得純凈產(chǎn)物。

實(shí)施例5、乙二醇單2-溴異丁酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酸酯

取1.17ggflg四肽和0.33g三乙胺溶于10mln，n-二甲基甲酰胺(dmf)，冰浴條件下滴加0.3g二溴異丁酰溴，滴加完畢后室溫反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)完畢后真空濃縮至2-3ml，逐滴加入二氯甲烷中，過濾收集沉淀。將沉淀溶于dmf并重復(fù)在二氯甲烷中沉淀以除去原料和所產(chǎn)生的鹽。取0.54g沉淀與0.12g乙二醇溶于10ml無水dmf中，加入0.56gdcc和0.1gdmap催化酯化反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)24小時(shí)后過濾除去環(huán)己基脲(dcu)。加入50ml 二氯甲烷溶解產(chǎn)物，所得溶液用50ml純水洗4次。收集有機(jī)相并加入無水硫酸鈉干燥，過濾后旋蒸濃縮即得產(chǎn)物。其它基于多肽的r-oh的合成過程與本實(shí)施例相同。

實(shí)施例6、聚合物pdlla20000制備的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析實(shí)驗(yàn)

提前將實(shí)驗(yàn)所需的反應(yīng)瓶于120℃烘箱中烘干2小時(shí)除水，在45℃、氬氣保護(hù)條件下進(jìn)行下列操作。將烘干的反應(yīng)瓶抽真空15min以確保沒有空氣，在通氬氣的情況下取5gdlla單體加入反應(yīng)瓶中。再于通氬氣情況下取提前蒸餾純化的三氯甲烷30ml于反應(yīng)瓶中，攪拌溶解后加入2ml實(shí)施例1制備的cta-oh的chcl3溶液(25mg/ml)。在加入50mgdbu的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，間隔2min取樣一次，連續(xù)取1小時(shí)，所取樣品于7ml異丙醇中沉淀，于冷凍離心機(jī)中8000r/min離心1分鐘。所得沉淀于60℃真空烘箱中干燥，烘干后測gpc曲線，結(jié)果如圖2所示，根據(jù)保留時(shí)間及產(chǎn)物分子量分布系數(shù)(pdi)的變化確定最佳反應(yīng)時(shí)間為45分鐘。根據(jù)確定的反應(yīng)條件，改變投料比分別制備pdlla5000、pdllam000、pdlla20000聚合物，其gpc曲線如圖3所示，分子量分布系數(shù)pdi分別為1.08，1.08和1.11，結(jié)果表明通過本發(fā)明的合成方法可以獲得具有很好的單分散性的聚酯。

由于dbu催化效率極高，為確定最佳反應(yīng)時(shí)間及反應(yīng)溫度，制備可控分子量且分子量分布較窄的聚合物，本實(shí)施例進(jìn)行了反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，確定在45分鐘時(shí)聚合物達(dá)到設(shè)計(jì)的分子量并且分子量分布最窄。

實(shí)施例7、兩親性嵌段聚合物pdlla-b-phpma的制備

不同分子量的聚合物制備方法相同，只需要改變?cè)系耐读媳燃纯?，在此列舉兩親性嵌段聚合物pdlla10000-b-phpma5000的投料比例。取實(shí)施例6的pdlla10000聚合物2g，hpma單體1.2g，4，4’-偶氮二(4-氰基戊酸)(v501)7mg，共同溶于15mldmso中。將反應(yīng)瓶置于液氮中，待液體凝固后抽真空15min，再將反應(yīng)瓶置于70℃水浴中通氬氣磁力攪拌溶解，待完全溶解后再置于液氮中冷卻，如此通氬氣凍融三次以除去空氣。最后置于70℃水浴反應(yīng)24小時(shí)，將反應(yīng)后的溶液于去離子水中透析2天除去未反應(yīng)的單體，凍干得到純化的產(chǎn)物，分別進(jìn)行g(shù)pc和¹hnmr表征。

通過類似方法可以合成pdlla10000-b-phpma10000和pdlla10000-b-phpma20000，分別進(jìn)行g(shù)pc和¹hnmr表征。

gpc和¹hnmr表征結(jié)果如圖4、圖5所示。圖4可見，分子量分布系數(shù)pdi分別為1.05，1.11和1.12，這些結(jié)果表明所得聚合物的分子量分布具有很好的單分散性。圖5為所制備的 聚合物的核磁譜圖，從中可計(jì)算得到聚合物的實(shí)際組成，其結(jié)果與設(shè)計(jì)分子量非常接近，進(jìn)一步表明了聚合過程的活性特征。

實(shí)施例8、不同分子量組成的pdlla-b-phpma納米粒子的細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)

在制備pdlla-b-phpma納米粒子的過程中加入尼羅紅作為熒光探針，指示raw264.7巨噬細(xì)胞對(duì)聚合物納米粒子的吞噬量隨時(shí)間的變化。

將細(xì)胞均勻培養(yǎng)在6孔板培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)一定時(shí)間后分別加入各個(gè)實(shí)驗(yàn)組尼羅紅標(biāo)記的pdlla-b-phpma納米粒子溶液，計(jì)時(shí)分別于1小時(shí)及6小時(shí)將細(xì)胞固定并用dapi溶液(10μl，10μg/ml)染細(xì)胞核后通過聚焦激光掃描顯微鏡(clsm)來觀察熒光圖像，并使用流式細(xì)胞儀定量分析各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的吞噬量，結(jié)果如圖6、圖7所示。

圖6中，每欄圖片從左到右依次為明場、dapi(細(xì)胞核)、dii(納米粒子)、三個(gè)通道合并以及合并圖片的局部放大圖片。其中左側(cè)為共培養(yǎng)1h所得的照片，右側(cè)為共培養(yǎng)6h所得的照片。從圖中可以發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間延長，巨噬細(xì)胞對(duì)納米粒子的內(nèi)吞量增加，但是pdlla-b-phpma和pdlla-b-peg納米粒子的內(nèi)吞量要明顯低于pdlla納米粒子的細(xì)胞內(nèi)吞量，證明phpma和peg能夠有效抑制巨噬細(xì)胞對(duì)納米粒子的攝取。與pdlla-b-peg相比，pdlla-b-phpma納米粒子的細(xì)胞內(nèi)吞量更低，體現(xiàn)出phpma聚合物的優(yōu)勢(shì)。另外，phpma的引入能夠明顯抑制巨噬細(xì)胞的攝取，其中phpma鏈段越長，巨噬細(xì)胞攝取量越低。與peg修飾的納米粒子相比，phpma修飾納米粒子的巨噬細(xì)胞攝取量更低，進(jìn)一步證明了體系優(yōu)異的“隱身”性能。

實(shí)施例9、包載cy7.5的pdlla-b-peg納米粒子和包載cy7.5的pdlla-b-phpma納米粒子的血液清除實(shí)驗(yàn)

在制備pdlla-b-peg納米粒子和pdlla-b-phpma納米粒子的過程中加入cy7.5作為熒光指示劑，分別制備了50nm粒徑和100nm粒徑的四種不同納米粒子，設(shè)置每個(gè)實(shí)驗(yàn)組使用三只balb/c雌鼠(20±2g，5-6周齡)小鼠，通過尾靜脈注射后，分別在0h，1h，3h，8h和24h通過眼部取血后，使用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)(ivisspectrum，caliperlifesciences，usa)拍攝并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，考察血液中熒光強(qiáng)度的改變情況。第一次給藥實(shí)驗(yàn)結(jié)束后7天進(jìn)行第二次給藥，并重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，整理數(shù)據(jù)并作圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8-10所示。

圖8為本發(fā)明制備的pdlla-b-phpma納米粒子及pdlla-b-peg納米粒子作為藥物載體，第一次給藥后，在小鼠體內(nèi)的清除速率曲線。圖9為本發(fā)明制備的pdlla-b-phpma納 米粒子及pdlla-b-peg納米粒子作為藥物載體，第二次給藥后，在小鼠體內(nèi)的清除速率曲線。圖10為本發(fā)明制備的pdlla-b-phpma納米粒子及pdlla-b-peg納米粒子作為藥物載體，第一次給藥24小時(shí)后，較第二次給藥24小時(shí)后，在小鼠血液中熒光強(qiáng)度的差值。從結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，在第一次給藥之時(shí)，相同粒徑的pdlla-b-peg納米粒子和pdlla-b-phpma納米粒子擁有相似的血液清除行為，且小粒徑納米粒子擁有更長的血液循環(huán)時(shí)間。然而，在第二次給藥之后，我們可以發(fā)現(xiàn)pdlla-b-peg納米粒子由于abc效應(yīng)的存在使得血液清除速率明顯加快。對(duì)于pdlla-b-phpma納米粒子而言，第二次給藥的血液清除速率與第一次相比也有一定程度的增加，但是從圖10中的該變量來看，血液清除速率的降低程度要小于pdlla-b-peg納米粒子，這也表明pdlla-b-phpma納米粒子優(yōu)異的體內(nèi)長循環(huán)性能。

實(shí)施例10、包載cy7.5的不同分子量組成的pdlla-b-phpma納米粒子的體內(nèi)生物分布實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)所用小鼠為balb/c雌鼠(20±2g，5-6周齡)，并在實(shí)驗(yàn)前一周在小鼠背部右下側(cè)構(gòu)建4t1小鼠乳腺癌模型，每三只攜帶4t1乳腺癌模型的balb/c雌鼠作為一組進(jìn)行pdlla-b-phpma納米粒子的生物分布實(shí)驗(yàn)。cy7.5標(biāo)記的各實(shí)驗(yàn)組聚合物粒子溶液通過尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)并開始計(jì)時(shí)。分別在1，3，6，9，12，24，48小時(shí)通過小動(dòng)物麻醉系統(tǒng)對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，使用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)(ivisspectrum，caliperlifesciences，usa)拍攝，根據(jù)熒光成像觀察藥物在小鼠體內(nèi)的分布。48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的活體成像拍攝完成后，通過頸椎錯(cuò)位處死小鼠，解剖取出心臟，肺，肝臟，脾臟，腎臟及腫瘤再次使用活體成像系統(tǒng)拍攝熒光圖像，根據(jù)所給出的熒光強(qiáng)度值，比較各實(shí)驗(yàn)組在小鼠體內(nèi)的生物分布及腫瘤富集情況，結(jié)果如圖11所示。

圖11為本發(fā)明制備的pdlla-b-phpma納米粒子包載cy7.5熒光探針后，通過尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)后，觀察隨時(shí)間變化納米粒子在小鼠體內(nèi)分布的活體成像圖片。結(jié)果表明，pdlla-b-phpma納米粒子能夠通過epr效應(yīng)有效地富集到腫瘤組織部位，與pdlla-b-peg納米粒子相比較，pdlla-b-phpma納米粒子擁有相似的腫瘤組織靶向能力，上述結(jié)果進(jìn)一步證明了pdlla-b-phpma納米粒子良好的應(yīng)用前景。