本發(fā)明涉及基因診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種新的導(dǎo)致X連鎖無(wú)汗性外胚層發(fā)育不良的突變位點(diǎn)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

外胚層發(fā)育不良(ecodermal dysplasias，EDs)的概念是由Thurman于1848年首先提出，其后Wedderhorn做了詳細(xì)的描述。臨床上根據(jù)有無(wú)發(fā)汗分為有汗性外胚層發(fā)育不良和無(wú)汗/少汗性外胚層發(fā)育不良。ED按孟德爾遺傳規(guī)律傳遞，遺傳方式包括常染色體顯性、常染色體隱性、X連鎖顯性和隱性遺傳。

X連鎖少汗或無(wú)汗性外胚層發(fā)育不良(X-linked hypohidrotic or anhidrotic ectodermal dysplasia，XLHED)亦稱為Christ-Siemens-Touraine綜合征，出生患病率為1/100,000。典型的臨床表型為無(wú)汗或少汗、毛發(fā)稀疏或全禿、少牙或牙形態(tài)異常等三聯(lián)癥，具有較大的異質(zhì)性。因?yàn)槭荴連鎖遺傳，所以患病男性表現(xiàn)出所有或絕大部分臨床典型表現(xiàn)，女性攜帶者則表現(xiàn)較輕，不同家系表現(xiàn)不同，甚至同一家系表現(xiàn)亦相差較大。

EDA基因編碼EDA蛋白(ectodysplasinA)。EDA基因位于Xq12-q13，共有12個(gè)外顯子，其中8個(gè)外顯子編碼EDA蛋白。EDA基因的任何一個(gè)domain突變均可導(dǎo)致XLHED，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)該基因有200多個(gè)突變，突變形式包括缺失突變及插入突變，但80％的病例只有一個(gè)突變。EDA蛋白及其介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)外胚層起源器官的發(fā)育十分重要，如頭發(fā)、指甲、垂體、乳腺、汗腺、鼻、眼及牙齒形成等。

ED是一組遺傳異質(zhì)性疾病，可導(dǎo)致程度不同的出生缺陷，嚴(yán)重威脅患者的身心健康。嚴(yán)重者幼兒時(shí)期反復(fù)高熱發(fā)作，可導(dǎo)致死亡。及早診斷和采取相應(yīng)應(yīng)對(duì)措施有利于防止高熱發(fā)作，減少并發(fā)癥，降低死亡率。免疫缺陷性少汗性ED是外胚層發(fā)育不良的一種罕見類型，其治療包括預(yù)防治療和病因治療等。盡管如此，多年來兒童XLHED死亡率約30％，嬰兒期，高熱、呼吸道感染是常見并發(fā)癥。因此，如何減少ED所致出生缺陷、如何減少該病死亡率是每一位科研及臨床醫(yī)務(wù)人員不可推卸的責(zé)任。隨著種植前遺傳學(xué)診斷(PGD)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，將來可以利用基因芯片技術(shù)對(duì)現(xiàn)有外胚層發(fā)育不良家系提供分子學(xué)產(chǎn)前診斷，進(jìn)一步提供遺傳咨詢，減少出生缺陷，為我國(guó)的優(yōu)生優(yōu)育作貢獻(xiàn)。鑒于此，探索ED發(fā)生的遺傳機(jī)制，發(fā)現(xiàn)更多ED的致病性突變將有利于ED產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢的開展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種新的導(dǎo)致ED的突變位點(diǎn)。

第一方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)EDA基因第6號(hào)內(nèi)含子起始端第二個(gè)堿基的試劑在制備診斷X連鎖無(wú)汗性外胚層發(fā)育不良的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

第二方面，本發(fā)明提供了一種診斷X連鎖無(wú)汗性外胚層發(fā)育不良的試劑盒，所述的試劑盒含有檢測(cè)EDA基因第6號(hào)內(nèi)含子起始端第二個(gè)堿基的試劑。

進(jìn)一步地，所述的試劑盒含有操作說明書，所述的操作說明書記載有以下內(nèi)容：如果EDA基因第6號(hào)內(nèi)含子起始端第二個(gè)堿基為A，則檢測(cè)對(duì)象為X連鎖無(wú)汗性外胚層發(fā)育不良個(gè)體。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：

本發(fā)明通過對(duì)一X連鎖無(wú)汗性外胚層發(fā)育不良家系EDA基因PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)本家系中IVS 6+2T>A(g.69250372,Xq22.3)突變?yōu)榧羟兄虏⊥蛔儯瑢賴?guó)內(nèi)外首報(bào)，是X連鎖無(wú)汗性外胚層發(fā)育不良的新發(fā)現(xiàn)致病突變。該突變可用于ED的產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢，減少出生缺陷?；诖?，可將檢測(cè)EDA基因第6號(hào)內(nèi)含子起始端第二個(gè)堿基的試劑用于制備診斷ED的試劑，開發(fā)診斷試劑盒。

附圖說明

圖1.先證者表型。

圖2.XLHED家系圖。

圖3.XLHED家系基因測(cè)序圖(部分)。P1為Ⅱ:3；P2為Ⅱ:2；P8為Ⅲ:6；P9為Ⅳ:1；P10為Ⅲ:7；P11為Ⅳ:3；P12為Ⅲ:8；P13為Ⅳ:2；P3、4、5、6、7分別為Ⅲ:3、Ⅲ:4、Ⅲ:5、Ⅲ:2、Ⅲ:1，未列出。

圖4.DNAsisst軟件比對(duì)圖。0為基因組標(biāo)準(zhǔn)序列70030468-70030520，8和10為患者，其余為家系其他正常成員。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

一、資料與方法

1.臨床資料

先證者(圖1，圖2中Ⅲ7)：男性，漢族，44歲，出生時(shí)即發(fā)現(xiàn)其全身毛發(fā)稀少，長(zhǎng)大后發(fā)現(xiàn)頭發(fā)稀黃、體毛稀少，牙齒稀疏，指趾甲發(fā)育未見異常，夏季不出汗，易發(fā)熱，皮膚干燥，智力正常；特殊面容：前額突出，鞍狀鼻，無(wú)鼻毛，唇厚外翻；追問病史：先證者出生后即無(wú)頭發(fā)，幼兒期常出現(xiàn)無(wú)誘因發(fā)熱，發(fā)熱程度與環(huán)境溫度相關(guān)。患者母親已離世，表現(xiàn)出輕微癥狀：頭發(fā)稀疏，缺門牙3顆。患者父親體健，非近親結(jié)婚。因患者拒絕取皮膚行病理學(xué)檢測(cè)而無(wú)法得到該病理學(xué)結(jié)果，但是家系先證者經(jīng)兩所三級(jí)甲等醫(yī)院的不同皮膚科醫(yī)生診斷為少汗性外胚層發(fā)育不良。先證者生育1子，身體健康，現(xiàn)19歲，排汗、牙齒發(fā)育、毛發(fā)等未見異常，先證者有一哥哥(圖2中Ⅲ6)，留取血樣半年后去世，表現(xiàn)與其相似，育有一子一女，均體?。换颊哌€有一弟弟，身體健康，未生育。

2.方法

2.1基因組DNA制備

獲得所有家庭成員知情同意后，采集患者及其家系其他健在成員外周靜脈血，EDTA抗凝，Dzup基因組DNA抽提試劑盒(上海生工，B518201)提取全家系基因組DNA。TE緩沖液溶解，NanoDrop ND-1000紫外分光光度計(jì)定量備用。

2.2PCR擴(kuò)增EDA基因的外顯子

利用軟件Primer3對(duì)參與該基因編碼的8個(gè)外顯子及臨界區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(見表1)，對(duì)8個(gè)外顯子及其上下游100bp臨界區(qū)域的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系50μl，含100ng DNA；10pmol dNTPs；各20pmol上下游引物；10×PCR Buffer 5μl(200mM Tris-HCl(pH8.8)、100mM KCl、160mM(NH₄)₂SO₄、20mM MgSO₄、1.0mg/ml BSA、1.0％TritonX-100)；5Unit Pfu DNA聚合酶。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性60s，95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸3min，最后72℃最終延伸5min，共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后產(chǎn)物于1.5％瓊脂糖(含溴化乙啶0.5g/mL)凝膠電泳檢測(cè)后送生工生物工程(上海)股份有限公司基因測(cè)序，所用測(cè)序儀為ABI測(cè)序儀(3730xlDNAAnalyzer)。Chromas(version 2.4.1)軟件讀取測(cè)序結(jié)果，同時(shí)輸出DNA序列。以美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的基因組序列為參考序列，用DNAssit(version 2.2)比對(duì)并找到突變位點(diǎn)后Chromas截取峰形圖并存檔。

表1EDA外顯子1-8PCR擴(kuò)增引物序列

二、結(jié)果

1.PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

先證者及其哥哥(圖2中Ⅲ6、Ⅲ7)DNA使用8對(duì)引物在前述條件下分別擴(kuò)增出相應(yīng)產(chǎn)物，測(cè)序顯示其中第6號(hào)內(nèi)含子起始端第二個(gè)堿基發(fā)生突變，IVS 6+2T>A(g.69250372,Xq22.3)。家系其他成員均無(wú)此突變(圖3，圖4)。

IVS 6+2T>A(g.69250372)突變位置位于該內(nèi)含子的剪切供體位置，其發(fā)生突變可導(dǎo)致基因的mRNA剪切異常，從而導(dǎo)致EDA蛋白的數(shù)量或結(jié)構(gòu)發(fā)生異常，影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。由于該家系連續(xù)3代均出現(xiàn)發(fā)病者，且男女均可受累，符合X染色體隱性遺傳特點(diǎn)，且發(fā)病者均具有典型臨床表現(xiàn)，基因檢測(cè)有相同的突變位點(diǎn)，正常人群及家系其他不發(fā)病成員無(wú)類似突變，因此綜合以上特點(diǎn)證實(shí)IVS 6+2T>A(g.69250372,Xq22.3)突變?yōu)榧羟兄虏⌒酝蛔儭?/p>

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市第一人民醫(yī)院

<120> 一種X連鎖無(wú)汗性外胚層發(fā)育不良突變基因及其應(yīng)用

<130> /

<160> 26

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggggcggggt cggccgggac ctcctccttc 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggccgccgcc gcccctacta ggtgactcac 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gatgggctca ggctttagac acatcaaact 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agtgataaag gatcaactga gtagacttac 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agatttttct ccctagggaa gaatcttcct 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gacagcaatt ttataaagtc aggaacttac 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tagaactcct gacagtacac tcatcacagg 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctggtggggt ggagagacag gggaactcac 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aggcaatact cagaagtttc cctgctgggt 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tacccaggaa gagagcaatc cccagccaac 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atcccaagac aggggagagg gatcagaatt 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcaaagaatg acttcgtatg ccaacggtac 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aagtttggcc ttctaggcta ccctggttgc 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aagaagagtt aggcctaaga ccgtactcac 30

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cccaatccct tcttgttgcc tctcactcag 30

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctggccttct tcttaggctg caatgctcc 29

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gaccccaagg gggctgctgc tcctctcttg 30

<210> 18

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gaacaaaatc cctctgtcct atcctcacc 29

<210> 19

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acctccagaa gtcccttcaa t 21

<210> 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gagtgctacc tctctgagcc t 21

<210> 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

actccaggca tgtgtctggc cctaactcct 30

<210> 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gtcctctctt tcaggtcttc cctccatcc 29

<210> 23

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tgtgactcct tatctctttc caccatacct 30

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tctaagggcc tttttagctc taaatttctc 30

<210> 25

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ctttgatcca tgtatgagtg tatgtgtt 28

<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cacctaacat gtaggaagta ctcacgccg 29