本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及一個影響山羊早期生長的分子標記、檢測方法及其應用。

背景技術：

黑素皮質素受體-4（Melanocortin receptor-4,MC4R）是動物下丘腦腹內側核分泌的一類肽類物質，是黑素皮質素受體家族5個亞型之一，它屬于G蛋白偶聯(lián)受體超級家族，為跨膜神經(jīng)受體。在哺乳動物中，MC4R具有介導Leptin蛋白的功能，是一個調節(jié)能量平衡與能量動態(tài)平衡的重要信號分子。MC4R通過與其內源性配體黑素皮質素激素或刺鼠色蛋白和agouti相關蛋白相結合，從而在控制食欲和體重穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用。1993年，Gantz等最先克隆出人的MC4R基因，并用熒光標記原位雜交法將其定位于人18號染色體上。1997年，Huszar等首次證明了MC4R在能量平衡中的關鍵作用，即遺傳敲除MC4R基因的小鼠出現(xiàn)遺傳性肥胖，表現(xiàn)多食、肥胖、胰島素分泌過多等癥狀。

2000年Kim等發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)豬MC4R基因外顯子第892bp處存在1個G→A錯義突變，該突變致使TaqⅠ酶切位點發(fā)生改變，并導致MC4R蛋白的第298位氨基酸由天冬氨酸突變?yōu)樘於０?Asp298Asn),在5個商業(yè)品系豬群中，該突變位點與部分品系的生長速度、采食量及背膘厚顯著關聯(lián)，其中AA基因型具有顯著提高日增重、采食量和背膘厚的效應。Jokubka等進一步證明了在立陶宛白豬中MC4R基因Asp298Asn變異位點的A等位基因具有顯著提高日增重、瘦肉率和降低背膘厚的效應。李星潤等研究結果顯示MC4R基因Asp298Asn位點確實與某些品種豬的生長性狀顯著關聯(lián),但在不同品種中,該位點的具體效應可能有所不同。L.Fontanesl等分析了意大利長白豬MC4R基因6個SNPs位點與生產(chǎn)性能的關系，結果證實Asp298Asn變異位點與背膘厚和料肉比等性狀顯著相關。劉桂蘭等采用了PCR-RFLP技術分析了MC4R基因部分片段在豬資源家系群體中Asp298Asn位點的多態(tài)性分布，結果表明，MC4R基因型頻率在不同品種群體中有不同分布，與豬胸腰椎間膘厚、臀部膘厚、平均背膘、眼肌面積、皮率呈顯著相關。

劉洪瑜等通過對西門塔爾牛、日本和牛、皖東黃牛、皖南牛和廣豐牛MC4R基因的1069C>G檢測，發(fā)現(xiàn)該突變位點不同基因型個體的體斜長在西門塔爾牛群體中存在顯著差異，體斜長和胸圍在皖東黃牛群體中存在顯著差異，因此可以把MC4R基因作為肉牛生長發(fā)育的輔助選擇的分子標記。李天科發(fā)現(xiàn)牦牛MC4R基因外顯子3處的多態(tài)位點437(G/A)與牦牛的體高、體長、體重和胸圍顯著相關，對牦牛的生長性狀有影響。

仇雪梅等發(fā)現(xiàn)雞MC4R基因5’調控區(qū)（-524nt）和編碼區(qū)(61nt、315nt、336nt)上的4個突變位點對雞的體重、屠體性狀有顯著影響?；裘鳀|等發(fā)現(xiàn)MC4R基因編碼區(qū)G315T的核苷酸變異影響雞體重和胸肌生長,陶勇等發(fā)現(xiàn)京海黃雞MC4R基因編碼區(qū)662處發(fā)生G→C突變，第733～734位間插入1個C堿基，檢測結果表明2處突變與京海黃雞的體重、體尺及屠宰等性狀均有相關性,對某些性狀的影響甚至達到顯著或極顯著水平。張超運用技術結合基因測序的方法對鴨MC4R基因CDS區(qū)進行了多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)了197bp處發(fā)生了T/A的單堿基突變，并使第66位氨基酸由纈氨酸變成谷氨酸，屬錯義突變，酶切后產(chǎn)生了TT、TA、AA三個基因型。此突變對鴨肌內脂肪的沉積具有一定的正向調控作用。蔣美山等對兔MC4R基因237bp處A/G突變研究顯示此位點顯著影響兔體重、全凈膛重以及飼料轉化率。張軼博等發(fā)現(xiàn)比格犬MC4R基因226bp處的C/A變異與體重顯著相關。

張菊等成功克隆了綿羊的MC4R基因的cDNA序列，張子軍等克隆了安徽白山羊MC4R基因的編碼區(qū)和部分5’、3’非編碼區(qū)序列，曲海娥等克隆得到了絨山羊MC4R基因的DNA及cDNA片段。曾獻存等發(fā)現(xiàn)中國美利奴羊MC4R基因編碼區(qū)存在G894C點突變（MC4R-3位點），3'側翼區(qū)存在1223G、G1229A、和T1307G3個點突變（MC4R-4位點）。通過不同基因型與綿羊生長性狀關聯(lián)分析表明，3’側翼區(qū)3個突變位點導致的不同基因型對中國美利奴羊腰角寬和體斜長有顯著影響（p＜0.05），而對其它性狀無顯著影響；BB基因型個體體斜長最大，顯著高于AB、AC和BC基因型個體（p＜0.05）。王春玲等發(fā)現(xiàn)湖羊MC4R基因548處存在C→T錯義突變，導致氨基酸由絲氨酸突變?yōu)榧琢虬彼幔撐稽c與湖羊2月齡體質量和4月齡體長顯著相關，CT基因型2月齡體質量顯著高于TT基因型，4月齡體長顯著高于CC型，且極顯著高于TT基因型。Song等對湖羊MC4R基因多態(tài)性進行研究，發(fā)現(xiàn)其3'非編碼區(qū)的4個SNPs(g.1016G/A、1240T/C、1264G/A和1325A/G)均與45d斷奶體質量顯著相關。張高振發(fā)現(xiàn)MC4R基因3'非編碼區(qū)的2個SNPs（G1229A、A1440T）與湖羊斷奶重均表現(xiàn)為極顯著相關。已有研究顯示波爾山羊MC4R基因的C986T突變其六月齡體質量和六月齡日增質量均極顯著相關(p＜0.01)，與其周歲齡體質量和周歲日增質量均顯著相關(p＜0.05)，但MC4R基因502位點多態(tài)性及其與山羊早期生長的相關性還未見報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服山羊育種中生長性狀表型選擇準確性低，遺傳進展慢的缺陷，提供一種山羊生長性狀的MC4R基因分子標記選擇方法，用于山羊分子育種，可以提高山羊生長性狀選擇的準確性，加快山羊新品種培育進程。

本發(fā)明的目的可通過如下技術方案實現(xiàn)：

一個影響山羊早期體重的分子標記，所述分子標記位于山羊MC4R基因502位點，且具有A/G多態(tài)性，AA型山羊早期體重高于GG型山羊早期體重。

本發(fā)明所述的早期體重指山羊3月齡及之前的體重。

本發(fā)明所述的分子標記在山羊分子育種中的應用。

一種用于檢測本發(fā)明所述的分子標記的引物對，上游引物P1如序列表中SEQ ID NO：1所示，下游引物P2如序列表中SEQ ID NO：2所示。

本發(fā)明所述的引物對在山羊分子育種中的應用。

一種檢測本發(fā)明所述的分子標記的方法，包含PCR擴增山羊基因組中含有本發(fā)明所述的分子標記的一段序列，對擴增產(chǎn)物進行測序，判讀山羊MC4R基因502位點的A/G多態(tài)性。

一種檢測權利要求1所述的分子標記的方法，包括利用本發(fā)明所述的引物對PCR擴增山羊基因組中含有本發(fā)明所述的分子標記的一段序列，利用BseJI限制性內切酶對所述的擴增產(chǎn)物進行酶切、電泳分型，獲得513bp、245bp兩個片段的定義為AA型，獲得758bp、513bp、245bp三個片段的定義為AG型，獲得758bp片段的定義為GG型。

一種篩選早期快速生長山羊品系的方法，包括檢測山羊MC4R基因502位點的多態(tài)性，選擇AA型個體留種。

本發(fā)明所述的方法，優(yōu)選包括以下步驟：

1）提取山羊基因組DNA；

2）利用權利要求3所述的引物對PCR擴增MC4R基因編碼區(qū)序列（序列NM_001285591.1），得到758bp擴增產(chǎn)物；

3）利用BseJI限制性內切酶對所述的擴增產(chǎn)物進行酶切、電泳分型，獲得513bp、245bp兩個片段的定義為AA型，獲得758bp、513bp、245bp三個片段的定義為AG型，獲得758bp片段的定義為GG型；

4）選擇AA型個體留種。

其中，所述PCR擴增的反應總體系優(yōu)選為20μL，模板DNA 15-100ng，5U/μL Taq聚合酶0.2μL，10mM的dNTP0.4μL，引物P1和P2各6pmol，25mM的MgCl₂ 1.2μL，10×緩沖液2μL，加滅菌雙蒸水至20μL；所述PCR擴增的反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，54-58℃退火30s，72℃延伸50s，35個循環(huán)；72℃延伸5min。

所述酶切的反應體系優(yōu)選為10-16μL，PCR產(chǎn)物3-5μL，10U/μL BseJI酶0.2-0.5μL，10×緩沖液1.0-1.6μL，補充滅菌雙蒸水至10-16μL；37℃酶切3-5h。

有益效果

山羊生長性狀是一個重要的經(jīng)濟性狀，屬于數(shù)量性狀，傳統(tǒng)的表型選擇準確性低，且表型值需要在山羊成年后才能逐步表現(xiàn)出來，周期很長，無法進行超早期選擇，遺傳進展緩慢。本發(fā)明采用PCR-RFLP方法檢測MC4R基因502A/G BseJI酶切位點的多態(tài)性，并將基因型與波爾山羊的早期體重進行關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)MC4R基因502A/G位點AA型山羊初生重、一周齡、二周齡、三周齡、一月齡、二月齡、三月齡重均高于GG型山羊；并且在一周齡、二周齡、二月齡、三月齡達到顯著水平（p＜0.05）。該多態(tài)位點可用于波爾山羊生長的輔助選擇，提高選擇的準確性，同時可以在波爾山羊出生時就通過檢測基因型進行選擇，加快育種進程，降低育種成本。不僅對進一步提高波爾山羊生長性狀有重要的實際意義，而且對以波爾山羊為素材開展的新品種（系）培育具有重要的實踐價值。

附圖說明

圖1波爾山羊MC4R基因502A/G突變位點測序圖

圖2波爾山羊MC4R基因502A/G突變位點電泳分型圖

如圖所示：泳道M為DL2000marker，AA、AG、GG分別表示波爾山羊MC4R基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)BseJI酶切后分為AA、AG、GG基因型。

具體實施方式

下述實施例中提到的實驗方法，如無特別說明均為常規(guī)方法，內切酶和熒光定量PCR試劑購自大連寶生物有限公司，高純總RNA快速提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司，其余試劑購自南京生興生物技術有限公司。

實施例1、山羊早期生長的MC4R基因502A/G分子標記選擇方法

材料與方法：

（一）羊群

163只波爾山羊樣本由江蘇省農業(yè)科學院六合動物實驗基地統(tǒng)一飼養(yǎng)管理，營養(yǎng)以及管理水平保持一致。其體重資料均由江蘇省農業(yè)科學院六合動物實驗基地提供。

（二）方法

1、樣品采集

每個個體采集耳組織樣，置冰桶中帶回實驗室，-20℃保存。

2、DNA的提取

采用常規(guī)酚、氯仿法提取DNA，采用電泳及測定OD₂₆₀/₂₈₀檢測DNA質量。

3、含MC4R基因502位點序列的擴增

根據(jù)序列NM_001285591.1，利用Primer Primer 5設計一對特異性引物(序列為P1：AATCCAAGATGAACTCTACCCA（SEQ ID NO.1），P2：CAGGATGGTCAGCGTGAT（SEQ ID NO.2）)，PCR擴增波爾山羊MC4R基因502位點序列。

PCR擴增的反應總體系為20μL，模板DNA 15-100ng，5U/μL Taq聚合酶0.2μL，10mM的dNTP0.4μL，引物P1和P2各6pmol，25mM的MgCl₂ 1.2μL，10×緩沖液2μL，加滅菌雙蒸水至20μL；所述PCR擴增的反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，54-58℃退火30s，72℃延伸50s，35個循環(huán)；72℃延伸5min。

4、PCR擴增產(chǎn)物的BseJI酶切分型。酶切的反應體系為10-16μL，PCR產(chǎn)物3-5μL，10U/μLBseJI酶0.2-0.5μL，10×緩沖液1.0-1.6μL，補充滅菌雙蒸水至10-16μL；37℃酶切3-5h。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

5、MC4R基因502A/G位點不同基因型波爾山羊早期體重的差異顯著性分析，采用SPSS 11.5中的One-way ANOVA方法進行。

（三）結果與分析

1、MC4R基因502A/G位點BseJI酶切多態(tài)性

163個樣本的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)BseJI酶切出現(xiàn)3種基因型（圖1），獲得513bp、245bp兩個片段的定義為AA型；獲得758bp、513bp、245bp三個片段的定義為AG型，獲得758bp片段的定義為GG型。

2、MC4R基因502A/G位點不同基因型波爾山羊早期體重差異顯著性分析

采用單因素方差分析比較不同基因型羊群間早期體重的差異發(fā)現(xiàn)，AA型山羊初生重、一周齡、二周齡、三周齡、一月齡、二月齡、三月齡重均高于GG型山羊；并且在一周齡、二周齡、二月齡、三月齡達到顯著水平（p＜0.05）（表1）。

表1 MC4R基因502位點不同基因型波爾山羊早期體重

注:同行不同大寫字母上標表示差異極顯著(p＜0.01)，同行不同小寫字母上標表示差異顯著(p＜0.05)。

綜合分析以上結果可以看出，AA型山羊在早期生長方面具有優(yōu)勢，該位點可以作為山羊早期生長性狀選擇的分子標記，在留種時選擇AA型個體。

<110> 江蘇省農業(yè)科學院

<120> 一個影響山羊早期生長的分子標記、檢測方法及其應用

<160> 2

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物P1

<400> 1

aatccaagat gaactctacc ca 22

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物P2

<400> 2

caggatggtc agcgtgat 18