本發(fā)明處于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中。具體而言，本發(fā)明涉及針對tau的抗體、包含此類tau抗體的組合物和使用此類tau抗體治療神經(jīng)退行性疾病(包括阿爾茲海默氏病(ad)、進(jìn)行性核上性麻痹(psp)和匹克氏病(pd))的方法。tau是促進(jìn)微管組裝和穩(wěn)定性的軸突微管結(jié)合蛋白。ad和psp是神經(jīng)退行性疾病，其病理上特征在于異常tau聚集。更具體而言，據(jù)信在ad和psp中過度磷酸化的tau促進(jìn)不溶性tau原纖維聚集，導(dǎo)致微管去穩(wěn)定和神經(jīng)元毒性。細(xì)胞培養(yǎng)和鼠模型研究已顯示，tau聚集體跨越神經(jīng)元突觸連接而擴(kuò)展且隔離單體(天然或非聚集)tau，從而誘導(dǎo)tau聚集體形成。在神經(jīng)退行性疾病諸如ad和psp中的tau聚集和累積的神經(jīng)解剖學(xué)進(jìn)展表明，tau原纖維聚集沿神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)傳播，最后導(dǎo)致微管去穩(wěn)定且最后導(dǎo)致神經(jīng)元功能局部受損。tau聚集的密度和神經(jīng)解剖學(xué)定位與ad和psp神經(jīng)病學(xué)癥狀和疾病進(jìn)展強(qiáng)烈相關(guān)。例如，在ad中，tau形成神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(nft)，其傾向于依次從橫嗅(transentorhinal)區(qū)至邊緣區(qū)，至新皮質(zhì)區(qū)發(fā)展，且其與癡呆癥的嚴(yán)重程度和神經(jīng)元損失的程度相關(guān)。在psp中，tau聚集可見于皮質(zhì)下區(qū)和皮質(zhì)區(qū)內(nèi)的神經(jīng)元、星狀膠質(zhì)細(xì)胞和寡樹突膠質(zhì)細(xì)胞中，且已顯示聚集的tau的密度與神經(jīng)元損失的嚴(yán)重程度相關(guān)。針對tau的抗體是已知的。例如，美國專利號8,926,974和國際公開號wo2011/026031、wo2012/049570和wo2013/050567公開針對tau的抗體和tau抗體用于治療神經(jīng)退行性疾病諸如ad的用途。然而，迄今為止仍沒有批準(zhǔn)用于治療用途的靶向tau的抗體且目前尚無批準(zhǔn)用于ad或psp的疾病改變療法。因此，仍需要替代性tau抗體。具體而言，仍需要特異性結(jié)合tau聚集體且減少tau聚集體形成、nft形成和神經(jīng)元損失的傳播的替代性tau抗體。優(yōu)選地，此類tau抗體也具有良好物理化學(xué)性質(zhì)以有助于開發(fā)、制造和/或配制。本發(fā)明提供結(jié)合人類tau的單克隆抗體且其包含輕鏈可變區(qū)(lcvr)和重鏈可變區(qū)(hcvr)，其中l(wèi)cvr包含互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)lcdr1、lcdr2和lcdr3且hcvr包含cdrhcdr1、hcdr2和hcdr3。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，lcdr1的氨基酸序列由seqidno.3給出，lcdr2的氨基酸序列由seqidno.4給出，lcdr3的氨基酸序列由seqidno.5給出，hcdr1的氨基酸序列由seqidno.6給出，hcdr2的氨基酸序列由seqidno.7給出且hcdr3的氨基酸序列由seqidno.8給出。在一個實施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合人類tau的單克隆抗體，其包含lcvr和hcvr，其中l(wèi)cvr的氨基酸序列由seqidno.9給出且hcvr的氨基酸序列由seqidno.10給出。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合人類tau的單克隆抗體，其包含輕鏈(lc)和重鏈(hc)，其中l(wèi)c的氨基酸序列由seqidno.1給出且hc的氨基酸序列由seqidno.2給出。本發(fā)明提供結(jié)合人類tau的單克隆抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合人類tau的構(gòu)象表位的單克隆抗體。在一個具體實施方案中，人類tau的構(gòu)象表位包括人類tau的氨基酸殘基7-9和312-322，其中人類tau的氨基酸序列由seqidno.13給出。本發(fā)明進(jìn)一步提供包含本發(fā)明的單克隆抗體和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。此外，本發(fā)明提供治療ad、psp或pd的方法，其包括向有需要的患者施用本發(fā)明的藥物組合物。另外，本發(fā)明提供治療神經(jīng)退行性疾病的方法。更具體而言，本發(fā)明提供治療ad、psp或pd的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本發(fā)明單克隆抗體。本發(fā)明還提供本發(fā)明單克隆抗體，其用于療法中。更具體而言，本發(fā)明還提供本發(fā)明單克隆抗體，用于治療ad、psp或pd。在一個實施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明單克隆抗體用于制造用于治療ad、psp或pd的藥劑的用途。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明單克隆抗體的核酸分子和表達(dá)載體。在一個實施方案中，本發(fā)明提供包含編碼具有seqidno.1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子。在一個實施方案中，本發(fā)明提供包含編碼具有seqidno.2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供包含編碼具有seqidno.1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列且包含編碼具有seqidno.2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子。在一個具體實施方案中，編碼具有seqidno.1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列由seqidno.11給出且編碼具有seqidno.2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列由seqidno.12給出。此外，本發(fā)明提供根據(jù)方法制備的單克隆抗體，其中所述方法包括在使得表達(dá)單克隆抗體的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含編碼具有seqidno.1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列和編碼具有seqidno.2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，和從所述宿主細(xì)胞回收包含lc和hc的單克隆抗體，其中l(wèi)c的氨基酸序列由seqidno.1給出且hc的氨基酸序列由seqidno.2給出。如本文所用，“抗體”是包含通過二硫鍵互聯(lián)的2個hc和2個lc的免疫球蛋白分子。各lc和hc的氨基端部分包括約100-120個氨基酸的可變區(qū)，其主要負(fù)責(zé)經(jīng)由其中所含有的cdr來識別抗原。cdr散布有更保守的稱為框架區(qū)(“fr”)的區(qū)域。各lcvr和hcvr由3個cdr和4個fr構(gòu)成，其從氨基端至羧基端以以下順序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。lc的3個cdr稱為“l(fā)cdr1、lcdr2和lcdr3”，且hc的3個cdr稱為“hcdr1、hcdr2和hcdr3”。cdr含有與抗原形成特異性相互作用的大多數(shù)殘基?？贵w結(jié)合具體抗原的功能性能力主要受6個cdr影響。將氨基酸指定至本發(fā)明抗體的lcvr和hcvr區(qū)內(nèi)的cdr結(jié)構(gòu)域基于眾所周知的kabat編號規(guī)定(kabat,等人,ann.nyacad.sci.190:382-93(1971);kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第五版,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91-3242(1991))和north編號規(guī)定(north等人,anewclusteringofantibodycdrloopconformations,journalofmolecularbiology,406:228-256(2011))。lc被歸類為κ或λ，其各自特征在于如本領(lǐng)域已知的具體恒定區(qū)。本發(fā)明單克隆抗體包括κlc。hc被歸類為γ、μ、α、δ或ε并將抗體的同種型分別定義為igg、igm、iga、igd、或ige。本發(fā)明單克隆抗體包括igghc。igg抗體可進(jìn)一步分為亞類，例如igg1、igg2、igg3、igg4。在一個具體實施方案中，本發(fā)明單克隆抗體是igg4。各hc的羧基端部分定義主要負(fù)責(zé)效應(yīng)子功能的恒定區(qū)。在一個具體實施方案中，本發(fā)明單克隆抗體在各hc的恒定區(qū)中具有降低效應(yīng)子功能的一種或多種修飾。在一個更具體實施方案中，本發(fā)明單克隆抗體是igg4并在兩個hc的恒定區(qū)中具有降低效應(yīng)子功能的修飾，包括在殘基230和231兩者處的氨基酸丙氨酸(殘基編號基于seqidno.2的例舉的hc)。在一個甚至更具體實施方案中，本發(fā)明單克隆抗體是igg4并在兩個hc的恒定區(qū)中具有降低效應(yīng)子功能的修飾，包括在殘基230和231兩者處的氨基酸丙氨酸，并在兩個hc的恒定區(qū)中具有促進(jìn)穩(wěn)定性的其他修飾，包括在殘基224處的氨基酸脯氨酸和缺失在殘基443處的氨基酸賴氨酸(殘基編號基于seqidno.2的例舉的hc)。本發(fā)明抗體是單克隆抗體(“mab”)。本發(fā)明mab是含有2個hc和2個lc的完整mab。如本文所提及，mab是衍生自單一拷貝或克隆(包括例如任何真核、原核或噬菌體克隆)的抗體，而不是其產(chǎn)生的方法。單克隆抗體可例如通過雜交瘤技術(shù)、重組技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、合成技術(shù)(例如cdr移植)或此類技術(shù)或本領(lǐng)域已知的其他技術(shù)的組合產(chǎn)生。產(chǎn)生和純化抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的且可見于例如harlow和lane(1988),antibodies,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.，第5-8章和第15章，isbn0-87969-314-2。例如，可用來自特征為患有ad的患者的腦組織的人類tau成對螺旋絲(“phf”)來免疫小鼠(jicha等人，j.neurosci.res.,15：48(2),128-132(1997年4月))且可回收、純化所得抗體，并使用本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)方法來測定氨基酸序列。本發(fā)明單克隆抗體經(jīng)工程改造以含有一個或多個圍繞衍生自非人類抗體的cdr的人類框架區(qū)。人類框架種系序列可從immunogenetics(ingt)(經(jīng)由其網(wǎng)站http://imgt.cines.fr)或從theimmunoglobulinfactsbook(marie-paulelefranc和gerardlefranc,academicpress,2001,isbn012441351)獲得。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，用于本發(fā)明單克隆抗體中的具體種系hc框架區(qū)和lc框架區(qū)分別包括5-51和a27。在本發(fā)明的具體實施方案中，抗體或編碼其的核酸以分離形式提供。如本文所用，術(shù)語“分離的”是指不含或?qū)嵸|(zhì)上不含在細(xì)胞環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的其他大分子物質(zhì)的蛋白、肽或核酸。本發(fā)明單克隆抗體可使用已知方法來制備并純化。例如，編碼hc(例如由seqidno.2給出的氨基酸序列)和lc(例如由seqidno.1給出的氨基酸序列)的cdna序列可經(jīng)克隆并工程改造至gs(谷氨酰胺合成酶)表達(dá)載體中。然后，工程改造的免疫球蛋白表達(dá)載體可穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至cho細(xì)胞中。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，抗體的哺乳動物表達(dá)將導(dǎo)致通常在fc區(qū)中在高度保守的n-糖基化位點處的糖基化。穩(wěn)定克隆可針對特異性結(jié)合至tau聚集體的抗體的表達(dá)來驗證?？稍谏锓磻?yīng)器中將陽性克隆擴(kuò)展至用于抗體產(chǎn)生的無血清培養(yǎng)基中?？贵w已分泌至其中的培養(yǎng)基可通過常規(guī)技術(shù)來純化。例如，培養(yǎng)基可方便地施加至已使用相容緩沖液諸如磷酸鹽緩沖鹽水來平衡的蛋白a或g瓊脂糖ff柱。洗滌柱以移除非特異性結(jié)合組分。將結(jié)合的抗體例如通過ph梯度來洗脫，且抗體級分諸如通過sds-page來檢測且然后合并?？贵w可使用常用技術(shù)濃縮和/或無菌過濾?？扇苄跃奂w和多聚體可通過常用技術(shù)有效移除，所述技術(shù)包括大小排阻、疏水相互作用、離子交換或羥磷灰石色譜。產(chǎn)物可立刻冷凍(例如在-70℃下)或可凍干。本發(fā)明單克隆抗體可用于患者的治療中。更具體而言，預(yù)期本發(fā)明抗體治療一類稱為tau蛋白病變的神經(jīng)退行性病癥，其包括ad、psp和pd。盡管預(yù)期本發(fā)明單克隆抗體可用于治療ad、psp和pd，但此類抗體也可用于治療其他tau蛋白病變包括慢性創(chuàng)傷性腦病。如本文可互換使用，“治療”(“treatment”和/或“treating”和/或“treat”)意指其中可減緩、中斷、阻止、控制、停止或逆轉(zhuǎn)本文所述病癥的進(jìn)展的所有過程，但不一定指示所有病癥癥狀的完全消除。治療包括施用本發(fā)明抗體用于治療人類的疾病或病況，所述疾病或病況會受益于tau聚集體形成、nft形成和神經(jīng)元損失中的至少一種的傳播的減少，且所述治療包括：(a)抑制疾病的進(jìn)一步進(jìn)展，即阻止其發(fā)展；和(b)減輕疾病，即引起疾病或病癥消退或緩解其癥狀或并發(fā)癥。如本文可互換使用，術(shù)語“患者”、“受試者”和“個體”是指人類。在某些實施方案中，患者的特征進(jìn)一步在于會受益于tau聚集體形成、nft形成和神經(jīng)元損失中的至少一種的傳播的減少的疾病、病癥或病況(例如，神經(jīng)退行性病癥)。在另一個實施方案中，患者進(jìn)一步特征在于處于發(fā)展神經(jīng)退行性病癥、疾病或病況的風(fēng)險中，所述神經(jīng)退行性病癥、疾病或病況會受益于tau聚集體形成、nft形成和神經(jīng)元損失中的至少一種的傳播的減少。如本文所用，術(shù)語“結(jié)合(bind或binds)”tau是指抗體與人類tau聚集體的表位的相互作用。更優(yōu)選地，表位是人類tau的構(gòu)象表位。在一個具體實施方案中，術(shù)語“結(jié)合(bind或binds)”tau是指與構(gòu)象表位的相互作用，該構(gòu)象表位包括人類tau聚集體的氨基酸殘基7-9和312-322(殘基編號基于seqidno.13的例舉的人類tau)。應(yīng)理解，存在已知例如由剪接變體導(dǎo)致的人類tau蛋白的變型。然而，此類已知變型具有包括seqidno.13的氨基酸殘基7-9和312-322的構(gòu)象表位。然而，已知變體可導(dǎo)致seqidno.13的氨基酸殘基7-9和312-322的殘基編號改變。盡管在一些變體中可改變殘基編號，但構(gòu)成表位的氨基酸保持相同。如本文所用的術(shù)語“表位”是指抗原的由本發(fā)明單克隆抗體所識別的不連續(xù)三維位點。本發(fā)明單克隆抗體可并入藥物組合物中，該藥物組合物可通過本領(lǐng)域眾所周知的方法制備且包含本發(fā)明單克隆抗體和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑(例如，remington,thescienceandpracticeofpharmacy，第22版，loydv.編輯，pharmaceuticalpress，2012，其提供如從業(yè)者通常已知的配制技術(shù)的概要)。用于藥物組合物的合適載體包括當(dāng)與本發(fā)明單克隆抗體組合時，保持分子的活性且不與患者的免疫系統(tǒng)反應(yīng)的任何材料。包含本發(fā)明單克隆抗體的藥物組合物可通過腸胃外途徑(例如皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)或經(jīng)皮)施用于處于如本文所述的疾病或病癥的風(fēng)險中或展現(xiàn)如本文所述的疾病或病癥的患者。本發(fā)明的藥物組合物含有“有效”或“治療有效”量(在本文中可互換使用)的本發(fā)明單克隆抗體。有效量是指實現(xiàn)期望治療結(jié)果的必需量(在劑量下且對于時間段且對于施用方式)。單克隆抗體的有效量可根據(jù)諸如以下的因素變化：個體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重和單克隆抗體引起個體中的期望反應(yīng)的能力。有效量也是治療有益效應(yīng)勝過本發(fā)明單克隆抗體的任何毒性或有害效應(yīng)的量。工程改造的tau抗體當(dāng)構(gòu)建本發(fā)明單克隆tau抗體時遇到與化學(xué)和物理穩(wěn)定性相關(guān)聯(lián)的重大問題。所遇到的問題包括低結(jié)合親和力、免疫原性、聚集、hc二聚化、以及可變區(qū)脫酰胺、氧化、異構(gòu)化和錯折疊。例如，鼠igg1抗體mc-1(“mc-1”)(alberteinsteincollegeofmedicine，jicha等人，1997)，識別tau蛋白在氨基酸殘基7-9和312-322(殘基編號基于具有seqidno.13的氨基酸序列的例舉的人類tau蛋白)的構(gòu)象表位，該抗體最初通過將3個mc-1鼠hccdr工程改造至多個人類hc框架種系基因中和將3個mc-1鼠lccdr工程改造至多個人類lc框架種系基因中而人源化。mc-1的人源化構(gòu)建體利用重鏈和輕鏈框架的96種不同組合，其表示12個hc框架種系家族(特定人類hc框架：1-24、1-46、1-69、2-05、3-15、3-23、3-53、3-72、4-04、4-39、5-51和6-01)中的每一個和8個lc種系家族(特定人類lc框架：a-26、a-27、b-2、b-3、l-2、l-12、o11和o-2)中的每一個。將各別框架種系基因克隆于重鏈和輕鏈人類igg4表達(dá)載體中且轉(zhuǎn)染于hek293細(xì)胞中用于表達(dá)且通過elisa分析結(jié)合。盡管多個框架對在elisa中展示一定水平的與人類tau的結(jié)合，但是所得抗體構(gòu)建體顯示極多問題，包括結(jié)合親和力差、聚集、hc二聚化，和化學(xué)穩(wěn)定性問題，諸如可變區(qū)中的脫酰胺、氧化和異構(gòu)化。因此，將修飾工程改造以開發(fā)具有改善結(jié)合親和力、消除或減少的hc二聚化、減少的免疫原性和改善的化學(xué)和物理穩(wěn)定性的tau抗體。在hcdr2和hcdr3以及l(fā)cdr1、lcdr2和lcdr3中工程改造氨基酸修飾(相對于mc-1，jicha等人，1997)。修飾的鼠抗體基本上如上所述通過將3個hccdr工程改造至多個人類hc框架種系基因中并將3個lccdr工程改造至多個人類lc框架種系基因中而人源化。此外，實施廣泛蛋白穩(wěn)定性研究，并針對表達(dá)和熱穩(wěn)定性性質(zhì)以及結(jié)合親和力性質(zhì)來篩選工程改造的單克隆抗體。含有7個cdr突變(氨基酸位置基于反映于表1中例舉的本發(fā)明抗體的線性氨基酸殘基編號：hcdr2中的n61e和e62k；hcdr3中的p103v和y105d；lcdr1中的g34q；lcdr2中的s57d；和lcdr3中的h98l)的單克隆抗體被鑒定為改善本發(fā)明單克隆抗體的結(jié)合親和力、化學(xué)和物理穩(wěn)定性和免疫原性(相對于mc-1，jicha等人，1997)。在mc-1或人源化的mc-1抗體構(gòu)建體的表征中都未鑒定到上述修飾。例舉的本發(fā)明的工程改造的tau單克隆抗體呈現(xiàn)于表1中。例舉的工程改造的tau單克隆抗體包括人類hc框架5-51和人類lc框架a27。例舉的工程改造的tau單克隆抗體的各個區(qū)域的關(guān)系如下(氨基酸的編號應(yīng)用線性編號；將氨基酸指定至可變結(jié)構(gòu)域基于可在www.imgt.org獲得的internationalimmunogeneticsinformationsystem?；將氨基酸指定至cdr結(jié)構(gòu)域基于眾所周知的north編號規(guī)定，除了基于眾所周知的kabat編號規(guī)定的hcdr2)：表1：例舉的本發(fā)明的工程改造的tau單克隆抗體的氨基酸區(qū)域。以下實施例和測定展示，本發(fā)明單克隆抗體可用于治療與tau聚集體的傳播相關(guān)的神經(jīng)退行性病癥，諸如ad、psp或pd。然而，應(yīng)理解，以下實施例以說明性而非限制性方式陳述，且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可作出各種修改。實施例工程改造的tau抗體的表達(dá)本發(fā)明的工程改造的tau單克隆抗體可基本上如下文來表達(dá)和純化。含有seqidno.11的dna序列(編碼seqidno.1的lc氨基酸序列)和seqidno.12的dna序列(編碼seqidno.2的hc氨基酸序列)的谷氨酰胺合成酶(gs)表達(dá)載體用于通過電穿孔來轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞系(cho)。表達(dá)載體編碼sv早期(猿猴病毒40e)啟動子和gs的基因。gs的表達(dá)容許生物化學(xué)合成cho細(xì)胞所需的氨基酸谷氨酰胺。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞經(jīng)歷使用50μml-甲硫氨酸亞砜亞胺(l-methioninesulfoximine,msx)的集團(tuán)選擇(bulkselection)。通過msx的gs的抑制用于增加選擇的嚴(yán)格性。可針對cho野生型細(xì)胞選擇將表達(dá)載體cdna整合至宿主細(xì)胞基因組的轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)中的細(xì)胞(其表達(dá)內(nèi)源性水平的gs)。將轉(zhuǎn)染合并物以低密度鋪板以允許穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞的接近克隆的過度生長。針對抗體表達(dá)篩選主孔且然后在無血清懸浮液培養(yǎng)物中按比例放大以用于生產(chǎn)。抗體分泌至其中的澄清培養(yǎng)基施加至已用相容緩沖液諸如磷酸鹽緩沖鹽水(ph7.4)平衡的蛋白a親和柱。使用1mnacl洗滌柱以移除非特異性結(jié)合組分。例如用ph(約)3.5的檸檬酸鈉來洗脫結(jié)合的tau單克隆抗體并用1mtris緩沖液來中和級分。諸如通過sds-page或分析大小排阻來檢測tau單克隆抗體級分且然后合并。可溶性聚集體和多聚體可通過常用技術(shù)有效移除，所述技術(shù)包括大小排阻、疏水相互作用、離子交換或羥磷灰石色譜。本發(fā)明tau單克隆抗體使用常用技術(shù)來濃縮和/或無菌過濾。在這些色譜步驟后，tau單克隆抗體的純度大于95%。本發(fā)明tau單克隆抗體可立刻在-70℃下冷凍或在4℃下儲存幾個月。結(jié)合動力學(xué)和親和力用biacore?2000儀器(在25℃下用hbs-ep+運行緩沖液(gehealthcare,10mmhepesph7.4+150mmnacl+3mmedta+0.05%表面活性劑p20)引發(fā))測量的表面等離子共振(spr)測定用于測量實施例1的例舉的tau單克隆抗體與人類單體(例如天然或非聚集)tau和人類tau聚集體兩者(兩者都具有如示于seqidno:13中的氨基酸序列)的結(jié)合。人源化的mc-1抗體構(gòu)建體(具有框架組合：5-51重鏈，a27輕鏈)與人類單體tau和人類tau聚集體的結(jié)合以相同方式測量。除非如注明，所有試劑和材料均來自biacore?ab(upsala,sweden)。使用在所有4個流動室(fc)上含有固定化蛋白a的cm5芯片(使用標(biāo)準(zhǔn)nhs-edc胺偶聯(lián)產(chǎn)生)來采用捕獲方法。通過稀釋于運行緩沖液中來制備0.5μg/ml的抗體樣品。通過稀釋于運行緩沖液中來將單體tau和原纖維tau制備為2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.82、3.91、1.95和0(空白)nm的濃度。各分析循環(huán)由以下組成：(1)將抗體樣品捕獲于單獨流動室(fc2、fc3和fc4)上；(2)以50μl/min的速率經(jīng)各別fc注射250μl(300秒)單體tau或tau原纖維聚集體；(3)返回至緩沖液流持續(xù)20min以監(jiān)測解離相；(4)用注射25μl(30秒)ph1.5的甘氨酸使芯片表面再生；(5)用注射50μl(60秒)hbs-ep+來平衡芯片表面。使用標(biāo)準(zhǔn)雙重參照處理結(jié)合至tau聚集體的數(shù)據(jù)并使用biacore2000評估軟件(4.1版)擬合至1：1結(jié)合模型，以測定結(jié)合速率(kon,m-1s-1單位)、解離速率(koff,s-1單位)和rmax(ru單位)。平衡解離常數(shù)(kd)根據(jù)關(guān)系kd=koff/kon來計算且以摩爾單位計。由于快速結(jié)合和解離速率，結(jié)合至單體tau的數(shù)據(jù)無法通過如上文所述的spr精確測定。因此，結(jié)合至單體tau的kd通過使用穩(wěn)態(tài)結(jié)合擬合模型從繪制抗原濃度對反應(yīng)單位的曲線來獲得。所得結(jié)合數(shù)據(jù)提供于表2中。表2：與人類單體tau和聚集tau兩者的spr結(jié)合數(shù)據(jù)。*kd結(jié)果視為相對的，因為所述結(jié)果未針對親合力的影響進(jìn)行均一化。提供于表2中的結(jié)果展示，實施例1的tau單克隆抗體不具有可測量的與單體tau的結(jié)合，使得可通過biacore分析精確測定親和力值(由于快速結(jié)合和解離速率)。相反，提供于表2中的結(jié)果展示，與人源化的mc-1抗體構(gòu)建體相比，實施例1的tau單克隆抗體具有與tau聚集體的改善親和力。酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)用于測定實施例1的例舉的tau單克隆抗體與來自ad腦勻漿的聚集tau原纖維的相對結(jié)合親和力。ad腦勻漿從ad患者的腦的約80g皮質(zhì)制備。簡言之，以約10ml/1g(組織)將緩沖液(tbs/1mmpmsf/1xcomplete?蛋白酶抑制劑混合物(roche，p/n.11697498001)和磷酸酶抑制劑(thermofischer，p/n.78428))添加至ad腦組織中。使用手持式kinematicapolytron以速度6-7將組織勻漿化。然后，使用parrbomb(parrinstrument，p/n.4653)在1500psi氮氣下將組織進(jìn)一步勻漿化30min。將勻漿在4℃下以28,000g(j14beckman轉(zhuǎn)子)旋轉(zhuǎn)30min。收集上清液，合并且在sepharose400superflow的4cm高保護(hù)柱上運行以移除較大碎片，然后以每小時50-60ml的流速在25mlmc1-affigel10柱上運行，以純化結(jié)合mc1的tau原纖維。為了使純化的回收率最大化，通過mc-1柱在4℃下經(jīng)18-20小時再循環(huán)上清液。將保護(hù)柱移除并使用至少40個柱體積用tbs洗滌mc1柱。然后，將結(jié)合的tau聚集體用2個柱體積的3mkscn洗脫，收集于約1ml級分中。各洗脫級分中的蛋白濃度通過微量滴定板bradford測定來檢查。將含有陽性蛋白水平的級分合并，使用centricon(milliporeultracel-30k)在4℃下濃縮至約2ml并使用slide-a-lyzer盒(10kmwco3-12ml,pierce)針對1升tbs透析過夜。從ad腦勻漿純化的tau原纖維內(nèi)的tau濃度通過夾心elisa使用da-9捕獲抗體和cp27檢測抗體來測量。將pbs中的純化的tau原纖維(50μl)以對應(yīng)于0.7μg/ml總tau的濃度包被于96孔板(coastar，p/n.3690)的孔上。將板在4℃下孵育過夜，然后用150μlpbst(含有0.05%tween-20的pbs)洗滌3次，在室溫下于100μlbb3(immunochemistrytechnology，p/n.643)中封閉至少1小時(通常2小時)。封閉之后，將封閉緩沖液從孔移除。將實施例1的例舉的tau單克隆抗體和人源化的mc-1抗體構(gòu)建體(具有框架組合：5-51重鏈，a27輕鏈)于0.25%酪蛋白緩沖液中稀釋為1000nm儲備液，然后以二倍稀釋度連續(xù)稀釋23次。將50μl儲備液和連續(xù)稀釋的抗體(實施例1的例舉的tau單克隆抗體或人源化的mc-1抗體構(gòu)建體)添加至單獨孔中并在室溫下孵育2小時，然后將板用200μlpbst/孔洗滌4次。添加50μl抗人類igg-hrp抗體(以1：4000稀釋至0.25%酪蛋白緩沖液中)并在室溫下孵育1小時，然后將板用200μlpbst/孔洗滌4次。添加50μltmb/h2o2并在室溫下孵育約10分鐘。通過添加50μl終止溶液(2nh2so4)來終止反應(yīng)并在450nm下測量比色信號。將數(shù)據(jù)輸入prism6(graphpad)程序中并使用非線性回歸曲線擬合和s型劑量反應(yīng)來產(chǎn)生ec50值。結(jié)果呈現(xiàn)于表3中。表3.與純化的adtau原纖維的結(jié)合的ec50比較測定的抗體ec50(pm)實施例1的例舉的taumab6.8人源化mc-1ab構(gòu)建體409.1如表3中所反映，例舉的本發(fā)明tau單克隆抗體展示60倍優(yōu)于人源化mc-1抗體構(gòu)建體的與純化tau原纖維的改善親和力(如通過ec50所測量)。實施例1的tau單克隆抗體對tau聚集體相對于對tau單體的選擇性通過直接elisa來測定。在實質(zhì)上如上文所提供的elisa程序后，以對應(yīng)于“高”濃度(1μg/ml)或“低”濃度(15ng/ml)的濃度將重組tau(rtau)包被于96孔板上。當(dāng)包被于微孔板上時，高濃度的rtau聚集，模擬與聚集的tau的結(jié)合。當(dāng)包被于微孔板上時，低濃度的rtau模擬與tau單體的結(jié)合。分別包被有高或低濃度的rtau的板暴露于實施例1的例舉的tau單克隆抗體，且例舉的tau單克隆抗體與各別濃度的rtau的結(jié)合實質(zhì)上如上文的elisa測定中所述來測量。結(jié)果提供于表4中。表4.與“高”相對于“低”濃度的rtau的結(jié)合的ec50比較rtau單體濃度ec50(pm)“高”(1μg/ml)6.0“低”(15ng/ml)722.7如表4中所反映，實施例1的例舉的tau單克隆抗體展示120倍優(yōu)于單體tau的與聚集tau的改善親和力(如通過ec50所測量)。離體靶標(biāo)參與(targetengagement)研究實施例1的例舉的tau單克隆抗體與源自人類腦的聚集的tau的結(jié)合通過福爾馬林固定的石蠟包埋(ffpe)的從以下獲得的腦切片的免疫組織化學(xué)染色來測定：“正?！眰€體(顯示最低tau聚集)；ad患者(展現(xiàn)嚴(yán)重tau聚集和nft形成，以及淀粉樣蛋白斑塊病理)；pd患者(展現(xiàn)嚴(yán)重tau聚集)。還對源自不具有人類tau的“對照”野生型小鼠的腦切片實施染色以測定背景非特異性染色水平。將ffpe切片脫石蠟且再水化。此后，對切片實施抗原修復(fù)(使用labvisionpt模塊系統(tǒng)，thermoscientific)，其包括在100℃下在檸檬酸鹽緩沖液(thermoscientific，p/n.ta-250-pm1x)中加熱切片20分鐘，然后將切片于dh2o中冷卻。然后，將切片暴露于以下7個孵育步驟(在室溫下)：(1)于0.03%h2o2中10min.；(2)于正常山羊血清(vectorlabs.，p/n.s-1000)稀釋于pbst中的1：20稀釋液中30min.；(3)于實施例1的例舉的tau單克隆抗體或人源化的mc-1抗體構(gòu)建體(具有框架組合：5-51重鏈，a27輕鏈)中60min.(例舉的tau單克隆抗體和人源化的mc-1抗體構(gòu)建體兩者都均一化至1mg/ml，然后于pbst中稀釋至1：4000的稀釋液，之后與切片一起孵育)；(4)于以1.1μg/ml的濃度于pbst中的兔抗人類igg4(針對例舉的抗體的fc區(qū)產(chǎn)生)中30min.；(5)于生物素化的山羊抗兔igg(vectorlabs.,p/n.ba-1000)稀釋于pbst中的1：200稀釋液中30min.；(6)于抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物溶液(vectorlabs.,p/n.pk-7100)中30min.；(7)于3,3’-二氨基聯(lián)苯胺(vectorlabs.,p/n.sk-4105)中5min.。在上述7個步驟的每一個之間均使用pbst洗滌切片。在上述7個孵育步驟之后，用蘇木精復(fù)染切片，脫水并蓋上蓋玻片。對于小鼠“對照”組織切片，對上述方案進(jìn)行以下修改：在孵育步驟(3)中，使用例舉的tau單克隆抗體和人源化的mc-1抗體構(gòu)建體兩者的1：8000稀釋液(相對于1：4000稀釋液)；并用生物素化的山羊抗人類igg(vectorlabs.，p/n.ba-3000)于pbst中的1：200稀釋液中的單一30min.來替代孵育步驟(4)和(5)。在實質(zhì)上如上文所述的程序之后，實施對實施例1的例舉的tau單克隆抗體與源自人類腦的tau的結(jié)合的分析。結(jié)果提供于表5中。表5.與ffpead腦切片中的聚集的tau的結(jié)合的半定量分析。提供于表5中的結(jié)果反映，如與人源化的mc-1抗體構(gòu)建體相比，在來自ad和pd患者兩者的海馬體腦切片中，實施例1的例舉的tau單克隆抗體展示顯著較高的對聚集的tau的染色水平。提供于表5中的結(jié)果也展示，實施例1的例舉的tau單克隆抗體并未展示高于人源化的mc-1抗體構(gòu)建體的非特異性結(jié)合(在正常對照人類切片中，例舉的tau單克隆抗體展示與最少量的聚集的tau的結(jié)合)。此外，由于ad和pd特征在于編碼tau的基因的獨特剪接變體，所以這些結(jié)果支持如下結(jié)論：實施例1的例舉的tau單克隆抗體特異性結(jié)合包含人類tau的氨基酸殘基7-9和312-322(殘基編號基于seqidno.13的例舉的人類tau)的構(gòu)象表位，該構(gòu)象表位是ad和pd兩者的tau聚集體共有的。tau聚集體傳播的體外中和已知來自約5個月齡p301s小鼠的勻漿腦制備物在天然非聚集tau存在的情況下誘導(dǎo)天然tau的聚集且展示tau聚集的傳播樣效應(yīng)。將來自4.5至5個月齡p301s小鼠的腦組織的sarkosyl不溶性勻漿制備物超聲處理并用opti-mem(gibco，lifetech.，p/n.31985-062)稀釋以使得所測量的tau(每制備物)達(dá)到0.77μg/ml的終濃度。各制備物與實施例1的例舉的tau單克隆抗體(濃度：21.00、7.00、2.33、0.78、0.26、0.09、0.03和0.01μg/ml)或人源化的mc-1抗體構(gòu)建體(濃度：50.00、16.67、5.56、1.85、0.62、0.21、0.07、0.02和0.01μg/ml)之一在室溫下孵育30分鐘。將hek293細(xì)胞(人類胚腎細(xì)胞系)通過電穿孔轉(zhuǎn)染以誘導(dǎo)性表達(dá)人類tau的突變體形式(1n4l，其在殘基301處用絲氨酸取代脯氨酸(p301s)(殘基編號基于seqidno.13的例舉的人類tau))。(falconb.等人，j.biol.chem.290：1049-1065，2015)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的hek293細(xì)胞以1×104個細(xì)胞/孔的濃度鋪板于96孔板的孔中的完全培養(yǎng)基(d-mem培養(yǎng)基(invitrogen，p/n.11965-092)，10%胎牛血清(invitrogen，p/n.16000)，1×青霉素鏈霉素(invitrogen，p/n.15140-122)，5μg/ml殺稻瘟菌素(blasticin，invitrogen，p/n.r210-01)，200μg/ml博萊霉素(invitrogen，p/n.r250-01))中。將板在37℃下孵育3天。孵育后，每孔以1：1000稀釋度添加1mg/ml四環(huán)素(至1μg四環(huán)素/ml培養(yǎng)基的終濃度)以誘導(dǎo)表達(dá)突變體tau。然后將板在37℃下孵育24小時。孵育后，將培養(yǎng)基移除并添加50μl勻漿制備物與各別濃度之一的實施例1的例舉的tau單克隆抗體或人源化的mc-1抗體構(gòu)建體(如上文所述制備)之一。將板孵育3小時，然后移除勻漿制備物并將100μl含有1μg/ml四環(huán)素的完全培養(yǎng)基和相同各別濃度的例舉的tau單克隆抗體或人源化的mc-1抗體構(gòu)建體添加至每一各別孔。將板在37℃下孵育24小時，然后移除培養(yǎng)基并將100μl完全培養(yǎng)基和相同各別濃度的例舉的tau單克隆抗體或人源化的mc-1抗體構(gòu)建體添加至各別孔。將板在37℃下孵育48小時。孵育后，用200μldpbs洗滌細(xì)胞并流干。將細(xì)胞重懸于每孔50μlh緩沖液(tbs，ph7.4，含有2mmegta、5mmedta、蛋白酶和磷酸酶抑制劑(thermoscientific，p/n.784420))中并超聲浴處理10分鐘。通過bcatm蛋白測定(thermoscientific，p/n.pi-23227)測量總蛋白濃度。通過夾心elisa測定tau聚集體水平。在4℃下將96孔板用50μl2μg/mlat8抗體包被過夜。將板用pbst洗滌3次，然后在室溫下用100μlbb3封閉1小時。使用ad腦總提取物通過在0.25%酪蛋白緩沖液中使用兩倍稀釋度從40μg/ml的起始濃度連續(xù)稀釋至0.3125μg/ml的終濃度來制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。將細(xì)胞裂解物稀釋至0.25%酪蛋白緩沖液中至約0.1mg/ml的總蛋白濃度。然后，將50ul各標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋液或稀釋的細(xì)胞樣品添加至經(jīng)封閉的板的單獨孔中并在4℃下孵育過夜，然后將板用pbst洗滌4次。生物素化的cp27抗體以1：2000稀釋于0.25%酪蛋白緩沖液中且然后將50μl添加至含有樣品的孔中。將板在室溫下孵育2小時，然后將板用pbst洗滌4次。將鏈霉抗生物素蛋白-hrp(invitrogen,p/n.snn2004)以1：5000稀釋于0.25%酪蛋白緩沖液中且然后將50μl添加至各孔中，并將板在室溫下孵育1小時。孵育后，將板用pbst洗滌4次并添加50μlh2o2和tmb的1：1混合物(thermoscientific，p/n.34021)。將板在室溫下孵育10min.且通過添加50μlh2so4來終止反應(yīng)。在450nm或650nm下測量比色信號。將at8陽性tau水平針對各樣品中的總蛋白水平均一化。將各樣品的均一化值針對對照樣品(未用抗體處理)中的at8陽性tau水平進(jìn)一步均一化。各樣品中對tau聚集體傳播的抑制%通過從100減去進(jìn)一步均一化的值來確定，并將各樣品的抑制值%輸入prism6軟件程序(graphpad)中，其應(yīng)用非線性回歸曲線擬合和s型劑量反應(yīng)來產(chǎn)生ec50值。結(jié)果提供于表6中。表6.代表tau聚集體傳播抑制的ec50值。實施例1的例舉的工程改造的tauab人源化mc-1ab構(gòu)建體ec50(表示at8-陽性tau聚集體傳播的抑制(ng/ml))16476。提供于表6中的結(jié)果反映，實施例1的例舉的tau單克隆抗體在抑制誘導(dǎo)的tau聚集體傳播方面展示約30倍改善。tau聚集體傳播的體內(nèi)中和已知來自約5個月齡p301s小鼠的勻漿腦干制備物在注射至正常10周齡雌性p301s小鼠的海馬體中后誘導(dǎo)天然非聚集tau的聚集，展示tau聚集的傳播樣效應(yīng)。來自4.5至5個月齡p301s小鼠的腦干組織的勻漿制備物以實質(zhì)上與上文所述相同的方式來制備。向正常10周齡雌性p301s小鼠于海馬體的左半球中注射5μl勻漿腦制備物和：7.5μg實施例1的例舉的tau單克隆抗體(n=12)；或7.5μg對照人類igg4抗體(n=11)。注射后4周，將小鼠處死并收集左半球和右半球，石蠟包埋，并將6μm連續(xù)切片封固于載玻片上。將含有前囟(a-p=-2.30)的載玻片脫石蠟，使包埋的組織再水化且通過于檸檬酸鹽緩沖液中將載玻片加熱至100℃持續(xù)20min.來實施抗原修復(fù)。將載玻片于dh2o中冷卻并在室溫下根據(jù)以下步驟孵育：(a)于(0.03%)h2o2中10min.；(b)于正常山羊血清的1：20稀釋液中30min.；(c)于pg-5抗體的1：8000稀釋液(于pbst中稀釋)中60min.(pg-5抗體從peterdavies博士，alberteinsteincollegeofmedicineofyeshivauniversity的實驗室獲得；當(dāng)磷酸化時，pg-5抗體特異性結(jié)合tau的殘基409處的絲氨酸，殘基編號基于seqidno.13的例舉的人類tau)；(d)于生物素化的山羊抗小鼠igg抗體的1：200稀釋液(于pbst中稀釋)中30min.；(e)于抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物溶液中30min.；和(f)于3,3’-二氨基聯(lián)苯胺中5min.。使用pbst用于在各別步驟之間洗滌。于3,3’-二氨基聯(lián)苯胺中孵育5min.后，將切片用蘇木精復(fù)染，然后再水化并蓋上蓋玻片。通過scanscopeatslide掃描儀(aperio)在20×放大率下測量染色信號。將pg-5免疫反應(yīng)性定量并使用imagescope軟件(v.11.1.2.780，aperio)的正像素算法表示為百分比。結(jié)果提供于表7中。表7.左海馬體和右海馬體中分別的平均%pg-5免疫反應(yīng)性。提供于表7中的結(jié)果展示，如與對照igg4抗體相比，實施例1的例舉的tau單克隆抗體降低左海馬體和右海馬體兩者中的tau聚集水平。如所顯示，與對照igg4抗體相比，例舉的tau單克隆抗體分別在左海馬體中產(chǎn)生多60.5%的tau聚集減少并在右海馬體中產(chǎn)生多66.5%的tau聚集減少。這些結(jié)果展示，例舉的tau單克隆抗體具有針對tau聚集的傳播的中和活性。tg4510鼠模型中的體內(nèi)效力分析轉(zhuǎn)基因tg4510小鼠表達(dá)人類tau的突變體形式(4r0n，其在殘基301處用亮氨酸取代脯氨酸(p301l)，ramsdenm.等人，j.neuroscience.,25:10637-10647(2005)和santacruzk.等人，science(2005)；殘基編號基于seqidno.13的例舉的人類tau)。tg4510小鼠在海馬體和新皮質(zhì)區(qū)中展現(xiàn)p301l突變體人類tau的高表達(dá)水平，其展示年齡依賴性tau聚集進(jìn)展。本發(fā)明tau抗體可在tg4510小鼠中誘導(dǎo)免疫原性反應(yīng)。因此，為了測試本發(fā)明tau單克隆抗體用于嚙齒類動物模型中長期施用的治療潛力，構(gòu)建替代鼠tau抗體，其靶向相同構(gòu)象表位且相對于實施例1的例舉的tau單克隆抗體反映類似水平的改善親和力。替代tau抗體對純化的adtau原纖維的親和力(ec50)為13.1pm，如上文所述(針對實施例1的例舉的tau單克隆抗體)通過elisa來測量。將8周齡雌性tg4510小鼠分組為3個單獨組。第一組(n=15)用對照小鼠igg1抗體(15mg/kg)每周注射兩次，持續(xù)9周。第二組(n=15)用從注射有mc-1雜交瘤的小鼠腹水產(chǎn)生的重組mc-1抗體(15mg/kg)每周注射兩次，持續(xù)9周。第三組(n=15)用替代鼠tau抗體(15mg/kg)每周注射兩次，持續(xù)9周。最終施用后，將小鼠處死并收集其腦。收集皮質(zhì)部分和海馬體切片，石蠟包埋，并將6μm連續(xù)切片封固于載玻片上用于免疫組織化學(xué)用途。將收集的腦的剩余皮質(zhì)區(qū)在皮質(zhì)體積的10倍體積的h緩沖液中通過脈沖式超聲處理來勻漿化，在4℃下以21,000g旋轉(zhuǎn)20min.且從各皮質(zhì)收集上清液的等份試樣，且通過bcatm蛋白測定(thermoscientific，p/n.pi-23227)根據(jù)制造商的方案來測定總蛋白水平。將剩余的上清液在4℃下以100,000g旋轉(zhuǎn)1小時，丟棄上清液，并將獲得的不溶性沉淀重懸于h緩沖液中(體積為丟棄的上清液體積的?)。將重懸的沉淀超聲處理，且實質(zhì)上如上文所述，使用at8捕獲抗體和cp27檢測抗體通過elisa來測定各沉淀中的at8陽性tau聚集體水平。將at8陽性tau聚集體水平針對總蛋白水平均一化。類似地，將來自收集的腦的剩余海馬體于海馬體體積的10倍體積的h緩沖液中通過脈沖式超聲處理來勻漿化，在4℃下以21,000g旋轉(zhuǎn)20min.且從各海馬體收集上清液并測定總蛋白水平。實質(zhì)上如上文所述使用at8捕獲抗體和cp27檢測抗體通過elisa來測定上清液中的at8陽性tau聚集體水平。將at8陽性tau聚集體水平針對總蛋白水平均一化。結(jié)果提供于表8中。表8.經(jīng)由elisa測量的皮質(zhì)和海馬體腦勻漿中的at8-陽性tau聚集體的水平提供于表8中的結(jié)果展示，相對于對照migg1處理的小鼠，替代鼠tau抗體分別使皮質(zhì)和海馬體兩者中的tau聚集體水平下降24%和35%。結(jié)果進(jìn)一步顯示，用重組鼠mc-1抗體處理的小鼠未顯示優(yōu)于對照migg1處理的小鼠的改善的tau聚集體水平下降。還實質(zhì)上如上文所述通過免疫組織化學(xué)使用pg-5來測量從收集的腦制備的石蠟包埋切片的皮質(zhì)和海馬體中的tau聚集水平。通過轉(zhuǎn)換成log10值將數(shù)據(jù)均一化且結(jié)果概述于表9中。表9.皮質(zhì)和海馬體中的%pg-5免疫反應(yīng)性的平均log10值。提供于表9中的結(jié)果展示，相對于對照migg1抗體，替代鼠tau抗體降低皮質(zhì)(18%)和海馬體(43%)兩者中的tau聚集體水平，而相對于對照migg1抗體，重組鼠mc-1抗體在皮質(zhì)或海馬體中并未展示值得注意的tau聚集體水平的降低。工程改造的tau單克隆抗體的物理化學(xué)性質(zhì)實施例1的例舉的tau單克隆抗體展示良好溶解度、化學(xué)穩(wěn)定性和物理穩(wěn)定性。溶解度：期望足夠高溶解度以能夠便利地給藥。例如，通過1.0ml注射將1mg/kg劑量施用于100kg患者將需要100mg/ml的溶解度。另外，還期望在高濃度下將抗體維持在不具有高分子量(hmw)聚集的單體狀態(tài)。通過用10k分子量截止過濾器(amiconu.c.過濾器，millipore，目錄號ufc903024)將15mg例舉的抗體濃縮至小于100μl的體積來分析實施例1的例舉的tau單克隆抗體的溶解度。使用nanodrop2000(thermoscientific)通過在a280下的uv吸光度來測量樣品的終濃度。在實質(zhì)上如上文所述的程序后，實施例1的例舉的tau單克隆抗體顯示以下溶解度：大于140mg/ml(在ph6的10mm檸檬酸鹽緩沖液中)；大于177mg/ml(在ph6的10mm檸檬酸鹽與150mmnacl中)；和大于170mg/ml(在ph7.4的pbs緩沖液中)。另外，在高濃度下僅存在低水平的hmw(從約3%至約5.4%)且未觀察到相分離。化學(xué)和物理穩(wěn)定性：化學(xué)穩(wěn)定性促進(jìn)具有足夠保質(zhì)期的藥物制劑的開發(fā)。通過將例舉的tau抗體于10mm檸檬酸鹽中配制至1mg/ml的濃度并緩沖至ph4、5、6或7來評價實施例1的例舉的tau單克隆抗體的化學(xué)穩(wěn)定性。將配制的樣品在加速降解研究中在4℃、25℃或40℃下孵育4周。抗體的電荷概況的改變(其反映化學(xué)改變)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序使用毛細(xì)管等電聚焦(cief)來評價。在實質(zhì)上如上文所述的程序之后，實施例1的例舉的tau單克隆抗體展示呈現(xiàn)于表10中的化學(xué)穩(wěn)定性結(jié)果。表10.相對于在4℃下孵育的樣品，通過cief測量的經(jīng)4周的主峰%和通過sec測量的hmw聚集體%的變化的概述。提供于表10中的結(jié)果展示，在40℃下儲存4周后，實施例1的例舉的tau抗體當(dāng)在ph5下配制時具有僅1.1個百分點的主峰減少%，且當(dāng)在ph6(抗體配制中的常用ph)下配制時具有僅0.3個百分點的減少。另外，質(zhì)譜分析展示在40℃下儲存4周后僅觀察到最低降解(約1.5%lcdr1脫酰胺，且在所有cdr序列中降解少于5%)，指示實施例1的例舉的tau單克隆抗體具有足夠化學(xué)穩(wěn)定性以促進(jìn)具有足夠保質(zhì)期的溶液制劑的開發(fā)。對于比較的目的，通過將抗體在40℃下在ph8下孵育2周來實施人源化的mc-1抗體構(gòu)建體(具有框架組合：5-51重鏈，a27輕鏈)的化學(xué)和物理穩(wěn)定性。人源化的mc-1抗體構(gòu)建體顯示顯著化學(xué)降解，包括lcdr1中的12%脫酰胺、hcdr3中的5%脫酰胺和10%異構(gòu)化以及hc框架中的3%氧化。在實施例1的例舉的tau單克隆抗體的4周加速降解研究之后，通過將例舉的單克隆抗體于10mm檸檬酸鹽中配制至1mg/ml的濃度且緩沖為ph4或6來評價結(jié)合親和力。將配制的樣品在加速降解研究中在4℃或40℃下孵育4周。孵育后，根據(jù)實質(zhì)上如上文所述的elisa程序通過直接elisa來測定實施例1的例舉的tau單克隆抗體與包被于96孔板上的rtau(15ng/ml)的結(jié)合親和力。以一式兩份實施的上文所述的結(jié)合親和力研究的結(jié)果提供于表11中。表11.加速降解研究后的ec50比較。表11展示，與在4℃下孵育的對照樣品相比，對于4周加速降解之后的樣品，實施例1的例舉的tau單克隆抗體與低濃度的rtau的結(jié)合親和力保持類似。序列seqidno:1-實施例1的例舉的tau單克隆抗體的lcseqidno:2-實施例1的例舉的tau單克隆抗體的hcseqidno:3-實施例1的例舉的tau單克隆抗體的lcdr1seqidno:4-實施例1的例舉的tau單克隆抗體的lcdr2seqidno:5-實施例1的例舉的tau單克隆抗體的lcdr3seqidno:6-實施例1的例舉的tau單克隆抗體的hcdr1seqidno:7-實施例1的例舉的tau單克隆抗體的hcdr2seqidno:8-實施例1的例舉的tau單克隆抗體的hcdr3seqidno:9-實施例1的例舉的tau單克隆抗體的lcvrseqidno:10-實施例1的例舉的tau單克隆抗體的hcvrseqidno:11-編碼例舉的lc(seqidno:1)的核苷酸序列seqidno:12-編碼例舉的hc(seqidno:2)的核苷酸序列seqidno:13-人類全長tau的氨基酸序列序列表<110>elilillyandcompany<120>針對tau的抗體和其用途<130>x20624<150>us62/121,116<151>2015-02-26<160>13<170>patentinversion3.5<210>1<211>219<212>prt<213>人工序列<220><223>實施例1的例舉的tau單克隆抗體的lc<400>1gluilevalleuthrglnserproglythrleuserleuserprogly151015gluargalathrleusercysargserserglnserleuvalhisser202530asnglnasnthrtyrleuhistrptyrglnglnlysproglyglnala354045proargleuleuiletyrlysvalaspasnargpheserglyilepro505560aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthrile65707580serargleugluprogluaspphealavaltyrtyrcysserglnser859095thrleuvalproleuthrpheglyglyglythrlysvalgluilelys100105110argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu115120125glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe130135140tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln145150155160serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser165170175thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu180185190lyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser195200205provalthrlysserpheasnargglyglucys210215<210>2<211>442<212>prt<213>人工序列<220><223>實施例1的例舉的tau單克隆抗體的hc<400>2gluvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyglu151015serleulysilesercyslysglyserglytyrthrpheserasntyr202530trpileglutrpvalargglnmetproglylysglyleuglutrpmet354045glygluileleuproglyseraspserilelystyrglulysasnphe505560lysglyglnvalthrileseralaasplysserileserthralatyr65707580leuglntrpserserleulysalaseraspthralamettyrtyrcys859095alaargargglyasntyrvalaspasptrpglyglnglythrleuval100105110thrvalserseralaserthrlysglyproservalpheproleuala115120125procysserargserthrsergluserthralaalaleuglycysleu130135140vallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnsergly145150155160alaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnserser165170175glyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserserleu180185190glythrlysthrtyrthrcysasnvalasphislysproserasnthr195200205lysvalasplysargvalgluserlystyrglyproprocyspropro210215220cysproalaproglualaalaglyglyproservalpheleuphepro225230235240prolysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthr245250255cysvalvalvalaspvalserglngluaspprogluvalglnpheasn260265270trptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarg275280285glugluglnpheasnserthrtyrargvalvalservalleuthrval290295300leuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalser305310315320asnlysglyleuproserserileglulysthrileserlysalalys325330335glyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserglnglu340345350glumetthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphe355360365tyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnproglu370375380asnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphe385390395400pheleutyrserargleuthrvalasplysserargtrpglnglugly405410415asnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyr420425430thrglnlysserleuserleuserleugly435440<210>3<211>16<212>prt<213>人工序列<220><223>實施例1的例舉的tau單克隆抗體的lcdr1<400>3argserserglnserleuvalhisserasnglnasnthrtyrleuhis151015<210>4<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>實施例1的例舉的tau單克隆抗體的lcdr2<400>4tyrlysvalaspasnargpheser15<210>5<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>實施例1的例舉的tau單克隆抗體的lcdr3<400>5serglnserthrleuvalproleuthr15<210>6<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>實施例1的例舉的tau單克隆抗體的hcdr1<400>6lysglyserglytyrthrpheserasntyrtrpileglu1510<210>7<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>實施例1的例舉的tau單克隆抗體的hcdr2<400>7gluileleuproglyseraspserilelystyrglulysasnphelys151015gly<210>8<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>實施例1的例舉的tau單克隆抗體的hcdr3<400>8alaargargglyasntyrvalaspasp15<210>9<211>112<212>prt<213>人工序列<220><223>實施例1的例舉的tau單克隆抗體的lcvr<400>9gluilevalleuthrglnserproglythrleuserleuserprogly151015gluargalathrleusercysargserserglnserleuvalhisser202530asnglnasnthrtyrleuhistrptyrglnglnlysproglyglnala354045proargleuleuiletyrlysvalaspasnargpheserglyilepro505560aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthrile65707580serargleugluprogluaspphealavaltyrtyrcysserglnser859095thrleuvalproleuthrpheglyglyglythrlysvalgluilelys100105110<210>10<211>116<212>prt<213>人工序列<220><223>實施例1的例舉的tau單克隆抗體的hcvr<400>10gluvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyglu151015serleulysilesercyslysglyserglytyrthrpheserasntyr202530trpileglutrpvalargglnmetproglylysglyleuglutrpmet354045glygluileleuproglyseraspserilelystyrglulysasnphe505560lysglyglnvalthrileseralaasplysserileserthralatyr65707580leuglntrpserserleulysalaseraspthralamettyrtyrcys859095alaargargglyasntyrvalaspasptrpglyglnglythrleuval100105110thrvalserser115<210>11<211>657<212>dna<213>人工序列<220><223>編碼例舉的lc(seqidno:1)的核苷酸序列<400>11gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccacc60ctctcctgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatcagaacacctatttacattgg120taccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctataaagttgacaaccgattt180tctggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatc240agcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgttctcaaagtacactggttccg300ctcacgttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggaccgtggctgcaccatctgtc360ttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctg420ctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaa480tcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctc540agcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaa600gtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgc657<210>12<211>1326<212>dna<213>人工序列<220><223>編碼例舉的hc(seqidno:2)的核苷酸序列<400>12gaggtgcagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaagatc60tcctgtaagggttctggctacacattcagtaactactggatagagtgggtgcgccagatg120cccgggaaaggcctggagtggatgggggagattttacctggaagtgatagtattaagtac180gaaaagaatttcaagggccaggtcaccatctcagccgacaagtccatcagcaccgcctac240ctgcagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgccatgtattactgtgcgagaaggggg300aactacgtggacgactggggccagggcaccctggtcaccgtctcctcagcttctaccaag360ggcccatcggtcttcccgctagcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgcc420ctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggc480gccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactcc540ctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctacacctgcaac600gtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtccc660ccatgcccaccctgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttcccc720ccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtg780gacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtg840cataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagc900gtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctcc960aacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccga1020gagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagc1080ctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagcaat1140gggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttc1200ttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctca1260tgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtct1320ctgggt1326<210>13<211>441<212>prt<213>人工序列<220><223>人類全長tau的氨基酸序列<400>13metalagluproargglngluphegluvalmetgluasphisalagly151015thrtyrglyleuglyasparglysaspglnglyglytyrthrmethis202530glnaspglngluglyaspthraspalaglyleulysgluserproleu354045glnthrprothrgluaspglyserglugluproglysergluthrser505560aspalalysserthrprothralagluaspvalthralaproleuval65707580aspgluglyalaproglylysglnalaalaalaglnprohisthrglu859095ileprogluglythrthralagluglualaglyileglyaspthrpro100105110serleugluaspglualaalaglyhisvalthrglnalaargmetval115120125serlysserlysaspglythrglyseraspasplyslysalalysgly130135140alaaspglylysthrlysilealathrproargglyalaalapropro145150155160glyglnlysglyglnalaasnalathrargileproalalysthrpro165170175proalaprolysthrproproserserglygluproprolyssergly180185190aspargserglytyrserserproglyserproglythrproglyser195200205argserargthrproserleuprothrproprothrarggluprolys210215220lysvalalavalvalargthrproprolysserproserseralalys225230235240serargleuglnthralaprovalprometproaspleulysasnval245250255lysserlysileglyserthrgluasnleulyshisglnproglygly260265270glylysvalglnileileasnlyslysleuaspleuserasnvalgln275280285serlyscysglyserlysaspasnilelyshisvalproglyglygly290295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