本發(fā)明涉及一個水稻抗旱功能基因的分子標(biāo)記，屬于水稻抗旱分子設(shè)計育種和分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種水稻抗旱基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物抗旱包括形態(tài)學(xué)和生理生化的變化，是一個相當(dāng)復(fù)雜的過程。從生理機制來看，植物抵御干旱脅迫存在逃旱性、避旱性、耐旱性和復(fù)原抗旱性等機制，它們通常以一種抗旱機制為主，多種抗旱機制共同作用，最終達(dá)到抵御干旱的目的。植物抗旱性主要是植物為了適應(yīng)干旱的自然環(huán)境，通過長期自然選擇及遺傳變異，形成一套特異適應(yīng)干旱環(huán)境的生理機制。

水稻可以通過建立發(fā)達(dá)根系以躲避干旱土壤層。大量研究表明，水稻品種間根系生長的差異往往是其抗旱性差異的重要原因之一。DRO1受到生長素負(fù)向調(diào)控，并且影響了根尖部位的細(xì)胞伸長，從而導(dǎo)致根系的不對稱生長和對重力響應(yīng)的向下彎曲，使其生長方向更為豎直，改變根系構(gòu)型，從而提高水稻避旱能力(Uga et al.,2013)；OsDSR-1編碼一個鈣結(jié)合蛋白，是水稻中一個參與孕穗期和抽穗期干旱脅迫應(yīng)答的基因，同時OsDSR-1是ABA抑制側(cè)根生長的正調(diào)控因子，研究還發(fā)現(xiàn)OsDSR-1可能是信號傳導(dǎo)途徑中的一個Ca²⁺感受子，可參與調(diào)控高鉀條件下側(cè)根的發(fā)育(Yin et al.,2011)；OsNAC9和OsNAC10編碼一個NAC(NAM,ATAF and CUC)轉(zhuǎn)錄因子，在水稻根部的特異表達(dá)，正向調(diào)節(jié)水稻根系的生長發(fā)育，增強了抗旱能力，進(jìn)而提高了干旱條件下的水稻產(chǎn)量(Jeong et al.,2010；Redillas et al.,2012)；OsiSAP8是一個SAP脅迫相關(guān)蛋白家族成員，編碼一個具有A20和AN1型鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白，可能在各種脅迫響應(yīng)早期的信號傳導(dǎo)中發(fā)揮功能，在煙草和水稻中過量表達(dá)OsiSAP8都能提高植株對鹽、干旱和冷脅迫的耐受性，在脅迫條件下和脅迫恢復(fù)中，轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素保持、發(fā)芽率、植株鮮重、根和地上部伸長以及葉片發(fā)育都明顯好于對照植株(Kanneganti and Gupta,2008)。因此，根系發(fā)展與改善被認(rèn)為是提高水稻抗旱能力最重要途徑之一。

由于9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,Nced)是脫落酸(abscisic acid,ABA)合成途徑中關(guān)鍵限速酶基因，該基因可以調(diào)控ABA在植株體內(nèi)分布及水平，進(jìn)而調(diào)控旱地條件下根系發(fā)育等性狀，提高植物的陸生適應(yīng)性，在改良常規(guī)稻抗旱育種中具有重要的應(yīng)用價值。目前，應(yīng)對作物(特別是水稻)的抗旱問題，通過轉(zhuǎn)基因途徑過表達(dá)一些轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶等基因，可以達(dá)到相應(yīng)的抗旱目的，但商業(yè)化應(yīng)用尚需要較長的時間，而利用抗旱相關(guān)基因的分子標(biāo)記輔助選擇育種，有針對性的鑒定抗旱相關(guān)基因，能快速有效的選育抗旱稻作新品種。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了具有陸稻生態(tài)型分化SNP位點(Nced基因)檢測的酶切擴增多態(tài)性序列(Cleaved Amplified Polymorphic Sequences,CAPS)標(biāo)記，借助該標(biāo)記可以有效篩選帶有陸稻生態(tài)型分化(T型)Nced等位基因的個體，用于抗旱水稻新品種的培育。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

一種水稻抗旱基因的分子標(biāo)記引物，其序列為：

正向引物序列(NCED-SNP-F)：CACACCCCAAGAAGGACCC

反向引物序列(NCED-SNP-R)：AATCACCAGAGCCGACGAGA

所述水稻抗旱基因的分子標(biāo)記方法，包括以下步驟：

(1)提取待測水稻的基因組DNA；

(2)用分子標(biāo)記引物NCED-SNP-F/R對水稻基因組DNA進(jìn)行PCR擴增；

(3)以PCR擴增待測植株DNA，得到一條大小為657bp的片段，經(jīng)VspI酶切后，若得到兩條大小分別為200bp和457bp的片段，則表明樣品基因組中存在陸稻T型抗旱基因Nced，若酶切后只有一條657bp的帶型，則表明水稻樣品基因中沒有陸稻型(T型)抗旱等位基因Nced。

本發(fā)明還提供一種水稻抗旱基因的分子標(biāo)記在抗旱水稻新品種的培育中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明開發(fā)到的CAPs分子標(biāo)記是可以對陸稻T型抗旱基因(Nced)進(jìn)行基因型鑒定的共顯性分子標(biāo)記，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和效果：

(1)通過給基因標(biāo)記的篩選，可以篩選具有陸稻(T型)生態(tài)型Nced及抗旱性提高的育種材料。

(2)本發(fā)明的分子標(biāo)記可以用于育種群體的基因型選擇，有效地鑒別帶有T型Nced基因的個體，加快育種進(jìn)程。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1:分子標(biāo)記聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

M：DNA ladder；

1-45：分子標(biāo)記輔助選擇育種中間群體不同單株Nced基因型；

A：C型Nced；

B：T型Nced；

H：雜合型Nced。

圖2：抗旱育種表型分析

A：籽粒表型分析；B：旱田不同基因型越光根系表型分析

1,2：水田越光(C型)；3,4：旱田越光(C型)；5,6：旱田越光(T型)；7,8：旱田IRAT104(T型)；箭頭代表癟粒。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實施例1：

1設(shè)計開發(fā)水稻抗旱基因Nced的CAPs分子標(biāo)記引物，其序列為：

正向引物序列(NCED-SNP-F)：CACACCCCAAGAAGGACCC

反向引物序列(NCED-SNP-R)：AATCACCAGAGCCGACGAGA

2利用本發(fā)明提供的水稻抗旱基因Nced的CAPs分子標(biāo)記，培育抗旱水稻新品系(種)，包括以下步驟：

(1)以陸稻IRAT104為父本，以栽培稻越光為母本，進(jìn)行雜交，回交，得到不同世代分離群體；

(2)提取上述分離群體單個植株的基因組DNA，以其為模板，用引物NCED-SNP-F/R進(jìn)行擴增，得到一條大小為657bp的片段；

(3)利用VspI酶切PCR產(chǎn)物，通過8％的非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳分離片段，再用硝酸銀染色，參考雙親的擴增酶切條帶，對每代育種材料的基因型進(jìn)行鑒別。

實驗結(jié)果：在電泳分離、銀染后，得到3種基因型帶型，分別為陸稻生態(tài)型(T型Nced)，包含200bp和457bp兩個條帶，這些單株則在性狀上表現(xiàn)出較強的抗旱性；另兩種分別為水稻型(C型Nced)的一條657bp帶型和具有上述三條帶的雜合帶型。

結(jié)合基因型鑒定結(jié)果和田間綜合表現(xiàn)，篩選獲得抗旱型越光，暫命名為T-越光(圖1)。

野生型越光(C-越光)與培育的抗旱型越光稻(T-越光)的性能對比實驗：

1、在水田及旱地上按照隨機區(qū)組設(shè)計對C-越光、T-越光進(jìn)行田間試驗。

2、結(jié)果分析

表型鑒定發(fā)現(xiàn)，水田條件下，對照C-越光和T-越光結(jié)實率均表現(xiàn)正常，產(chǎn)量相當(dāng)；旱地條件下，對照C-越光結(jié)實率不正常(58％)，而T-越光結(jié)實率正常(87％)，并且T-越光產(chǎn)量(畝產(chǎn)459kg)顯著高于對照C-越光(畝產(chǎn)379kg)(圖2A)；根系表型分析發(fā)現(xiàn)，旱地條件下，T-越光根系明顯比對照C-越光發(fā)達(dá)(圖2B)，推測Nced等位基因替換(C型Nced替換為T型Nced)可以促進(jìn)水稻根系發(fā)育進(jìn)而提高抗旱性。

3、實驗結(jié)論：利用Nced基因水陸分化SNP位點開發(fā)的CAPs分子標(biāo)記培育抗旱型水稻在抗旱育種中具有現(xiàn)實意義，實用性強。

本發(fā)明中Nced(9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶)的基因編號為Os12g0435200，水稻型的基因在1009位的堿基為C，因此將水稻型的Nced基因命名為C型(互補堿基為G)，通過MAS技術(shù)將水稻中的Nced基因替換為具有抗旱作用的陸稻T型Nced等位基因，并賦予了水稻較強的抗旱能力。

綜上，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明借助該CAPs分子標(biāo)記可以有效篩選帶有陸稻生態(tài)分化型(T型)Nced基因的個體，有針對性的選擇該抗旱相關(guān)基因，快速有效的選育抗旱稻作新品種。

需要說明的是，在本文中，諸如第一和第二等之類的關(guān)系術(shù)語僅僅用來將一個實體或者操作與另一個實體或操作區(qū)分開來，而不一定要求或者暗示這些實體或操作之間存在任何這種實際的關(guān)系或者順序。而且，術(shù)語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設(shè)備所固有的要素。在沒有更多限制的情況下，由語句“包括一個……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的過程、方法、物品或者設(shè)備中還存在另外的相同要素。

以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的精神和范圍。