本發(fā)明屬生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種寡聚賴氨酸修飾的重組去鐵蛋白納米籠及其制備方法。

背景技術(shù)：

化學(xué)治療是常見的惡性腫瘤治療方法，但大多數(shù)抗腫瘤藥物因缺乏選擇性，在產(chǎn)生藥效的同時也會對機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用。因此，抗腫瘤藥物靶向遞送系統(tǒng)的開發(fā)有著極其重要的臨床應(yīng)用價值。去鐵蛋白作為一種天然蛋白質(zhì)，不僅有著良好的生物相容性及穩(wěn)定性，同時還能與腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(tfr1)發(fā)生特異性結(jié)合，并在該受體的介導(dǎo)作用下實(shí)現(xiàn)有效入胞，從而達(dá)到主動靶向的效果。去鐵蛋白通常由24個亞基自組裝而形成中空球形籠狀結(jié)構(gòu)，粒徑為12-13nm。利用其對ph的敏感性，可通過改變?nèi)芤簆h使蛋白籠發(fā)生解聚與復(fù)聚，從而進(jìn)行藥物的包載；同時可通過基因工程、化學(xué)方法等多種手段對該蛋白的內(nèi)外表面進(jìn)行修飾，使得該蛋白能有效地構(gòu)建新型多功能納米材料。這些優(yōu)越的性能使得去鐵蛋白成為了一種理想的多功能納米藥物載體。

然而，未經(jīng)修飾的去鐵蛋白納米籠在tfr1受體介導(dǎo)下，通過胞吞作用實(shí)現(xiàn)跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)后，其通常會在溶酶體中停留，而溶酶體內(nèi)存在的大量酶系會造成蛋白籠結(jié)構(gòu)的破壞，從而導(dǎo)致其包載的藥物同樣暴露在溶酶體環(huán)境中發(fā)生降解及破壞，對需要在胞漿內(nèi)特定細(xì)胞器或細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用的藥物來說，需設(shè)計(jì)一種具有溶酶體逃逸功能的去鐵蛋白納米遞藥系統(tǒng)。賴氨酸作為一種堿性氨基酸，在溶酶體酸性條件下可發(fā)生質(zhì)子化作用，引起氯離子和水大量進(jìn)入溶酶體，導(dǎo)致溶酶體內(nèi)滲透壓升高，最終破裂。故利用賴氨酸的這種“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，利用基因工程重組表達(dá)技術(shù)在蛋白亞基的n端修飾不同數(shù)目的賴氨酸，以獲得表面修飾寡聚賴氨酸的重組去鐵蛋白籠，使其具備溶酶體逃逸性質(zhì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服天然人去鐵蛋白籠作為藥物遞送載體入胞后易被溶酶體降解的不足，而提供一種具有溶酶體逃逸功能的寡聚賴氨酸修飾的重組去鐵蛋白納米籠及其制備方法。該重組蛋白籠不僅可實(shí)現(xiàn)藥物至腫瘤細(xì)胞的靶向遞送，降低對機(jī)體正常組織的毒副作用，同時還能保護(hù)籠內(nèi)的藥物不被溶酶體破壞，從而實(shí)現(xiàn)在胞漿內(nèi)特定細(xì)胞器或細(xì)胞核內(nèi)的遞送，達(dá)到更好的靶向治療效果。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案。

一種蛋白納米籠，通式為：n-lys-hfn，其中，lys表示賴氨酸，n為賴氨酸在單個蛋白亞基n端的修飾個數(shù)，n＝4、8，hfn指由24個人鐵蛋白h亞基(fth)自組裝而形成的蛋白籠。

上述寡聚賴氨酸修飾的鐵蛋白重鏈亞基納米籠，其制備方法主要包括以下步驟：

(1)重組蛋白籠表達(dá)工程菌的構(gòu)建：以fth編碼基因?yàn)榛A(chǔ)，在其5’端修飾不同數(shù)目的aag或aaa(lys的編碼基因)，并將得到的基因序列經(jīng)雙酶切后亞克隆至pet-30a(+)質(zhì)粒載體中，即得到待表達(dá)質(zhì)粒模板。將該模板經(jīng)熱休克法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并通過kanamycin抗性及基因測序等手段篩選出陽性單克隆，對陽性單克隆進(jìn)行大量培養(yǎng)，并保存其甘油菌。

(2)融合蛋白的表達(dá)和收菌：將步驟(1)得到的陽性工程菌接種于lb-kan+培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌液od600達(dá)到0.3-0.5時，加入iptg誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體。

(3)融合蛋白的分離純化：超聲破碎步驟(2)得到菌體，離心收集上清液，將上清置于水浴加熱后，再次離心獲得含有目的融合蛋白的上清液。將上清液上樣至ni⁺柱，用梯度咪唑緩沖液先后洗脫雜蛋白和目的融合蛋白，收集洗脫液并進(jìn)行sds-page分析，選擇含目的融合蛋白最多而雜蛋白最少的洗脫液，置于100kda超濾管中離心脫鹽，得到純化后的目的融合蛋白。

(4)融合蛋白的腸激酶切：向步驟(3)得到的目的融合蛋白中加入重組腸激酶，作用于融合蛋白中的腸激酶位點(diǎn)，以切除組氨酸標(biāo)簽，然后將反應(yīng)產(chǎn)物置于100kda超濾管中離心，最終得到所述目的蛋白(n-lys-hfn)。

通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)和透射電子顯微鏡(tem)對產(chǎn)物進(jìn)行表征。

本發(fā)明得到的寡聚賴氨酸修飾的鐵蛋白重鏈亞基納米籠(n-lys-hfn)可與高表達(dá)tfr1的腫瘤細(xì)胞發(fā)生特異性識別，并在受體介導(dǎo)的作用下實(shí)現(xiàn)有效入胞而進(jìn)入溶酶體。在溶酶體中，n-lys-hfn通過質(zhì)子海綿效應(yīng)發(fā)生溶酶體逃逸，保護(hù)籠內(nèi)的藥物免受降解，增加藥物在胞漿內(nèi)特定細(xì)胞器或細(xì)胞核內(nèi)的濃度，提高藥物的治療效果。所述重組蛋白遞藥系統(tǒng)不僅具有良好的生物相容性和穩(wěn)定性，還可實(shí)現(xiàn)藥物至腫瘤部位的主動靶向，降低對正常組織的毒副作用，為基因藥物及其他抗腫瘤藥物的靶向遞送提供了一種理想的多功能納米藥物載體。

附圖說明

圖1：實(shí)施例2中pet-30a(+)/4-lys-fth(a)和pet-30a(+)/8-lys-fth(b)在arcticexpress^tm中表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析結(jié)果。

圖2：實(shí)施例4中4-lys-hfn(a)和8-lys-hfn(b)在鎳柱親和層析法純化過程中各流出液的sds-page圖。

圖3：實(shí)施例5中4-lys-hfn和8-lys-hfn酶切前后產(chǎn)物的sds-page圖，其中以酶切前后的hfn作為對照，a)為酶切前產(chǎn)物，b)為酶切后產(chǎn)物。

圖4：實(shí)施例5中酶切后終產(chǎn)物4-lys-hfn(b)和8-lys-hfn(c)的透射電鏡圖，其中以酶切后的hfn(a)作為對照。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步解釋和說明，但應(yīng)理解，所給出的實(shí)施例只作為舉例說明，其不以任何方式對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。

實(shí)施例1.pet-30a(+)/n-lys-fth表達(dá)工程菌的構(gòu)建

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的待全合成的fth基因編碼序列，為了使fth亞基n端能夠修飾有不同數(shù)目的lys，在該基因編碼序列的5’端加上aagaaaaagaaa(4-lys)及aagaaaaagaaaaagaaaaagaaa(8-lys)，然后在該修飾后的基因編碼序列的5’端和3’端分別加上ccatggct和gcggccgc以獲得ncoi和noti酶切識別位點(diǎn)，最后對基因序列進(jìn)行優(yōu)化，使該序列在大腸桿菌系統(tǒng)內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)正確表達(dá)。兩條序列長度分別為580bp和592bp，編碼所述的4-lys-hfn和8-lys-hfn蛋白亞基的核苷酸序列分別如seqidno.1，seqidno.2所示。采用ncoi和noti對合成的序列進(jìn)行雙酶切，并對質(zhì)粒載體pet-30a(+)進(jìn)行同樣的雙酶切，通過t4dna連接酶4℃過夜連接兩種酶切產(chǎn)物，該產(chǎn)物由南京金斯瑞公司合成。同時根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》用cacl2法制備宿主菌arcticexpress^tm(ae菌)的感受態(tài)細(xì)胞，并通過熱休克法將連接產(chǎn)物在42℃轉(zhuǎn)化至該感受態(tài)細(xì)胞。在37℃下采用不含抗性的lb培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物，孵育1h后，再涂布至kan⁺-lb平板，37℃下放置30min后，倒置平板，培養(yǎng)過夜。挑取陽性單克隆轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)并保存菌種。即獲得分別轉(zhuǎn)化pet-30a(+)/4-lys-fth和pet-30a(+)/8-lys-fth的工程表達(dá)菌arcticexpress^tm。

實(shí)施例2.n-lys-hfn目的融合蛋白可溶性表達(dá)形式的分析

將陽性重組菌加入至新鮮的kan⁺-lb培養(yǎng)基中，37℃下，220r/min，振蕩過夜以活化。以1％的接種量轉(zhuǎn)接至5mlkan⁺-lb培養(yǎng)基，37℃下，220r/min，培養(yǎng)至菌液od600達(dá)到0.5。向試管內(nèi)加入終濃度為0.1mm的iptg，同樣條件下誘導(dǎo)表達(dá)約6h。取1ml菌液4℃，8000×g，離心3min。棄去上清后，加入200μl結(jié)合緩沖液(20mmtris，5mm咪唑，0.5mnacl，ph7.9)進(jìn)行重懸，重懸后再次相同條件下離心，棄上清收集菌體，再次重懸于200μl結(jié)合緩沖液，-20℃凍存過夜。取出菌體融化后超聲破菌，取出樣品作為總菌；離心后收集上清，取出樣品作為上清。以宿主菌的菌體總蛋白和破菌后上清作為對照，每種陽性重組菌平行選擇四個樣品，經(jīng)sds-page電泳分析蛋白可溶性表達(dá)情況及表達(dá)量。sds-page結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明，兩種重組工程菌的總菌和破菌上清均能觀察到分子量約為29kda的條帶，與重組蛋白4-lys-hfn單個亞基分子量(26.8kda)及8-lys-hfn單個亞基分子量(27.32kda)基本相當(dāng)，同時空宿主菌的自身表達(dá)蛋白中無此條帶，因此可判斷29kda處的條帶分別為兩種重組蛋白的亞基。此外，陽性重組菌的總菌和破菌上清中目的蛋白條帶面積相當(dāng)，表明重組蛋白主要以可溶性形式表達(dá)。

實(shí)施例3.n-lys-hfn目的融合蛋白的大量表達(dá)與收菌

將過夜復(fù)蘇的陽性重組菌以1％的接種量轉(zhuǎn)接至100mlkan⁺-lb培養(yǎng)基，37℃下，220r/min，培養(yǎng)至菌液od600達(dá)到0.5。向試管內(nèi)加入終濃度為0.1mm的iptg，同樣條件下誘導(dǎo)表達(dá)約6h。4℃，8000×g，離心3min以收集菌體，加入30ml結(jié)合緩沖液進(jìn)行重懸，重懸后再次相同條件下離心，棄上清收集菌體，再次重懸于30ml結(jié)合緩沖液，加入終濃度為100μg/ml的溶菌酶，-20℃凍存。

實(shí)施例4.n-lys-hfn目的融合蛋白的分離純化

取出凍存菌液融化后超聲破菌，超聲條件為：功率600w，超聲開1s，停2s，共超聲12min。4℃，10000×g，離心35min。收集上清置于60℃水浴，加熱20min以去除不耐熱的雜蛋白。再次4℃，10000×g，離心35min，獲得含有目的蛋白的上清液。由于目的融合蛋白中含有組氨酸標(biāo)簽，故可采用鎳柱親和層析法對目的蛋白進(jìn)行純化。向?qū)游鲋屑尤?ml樹脂，用無菌水清洗后再加入niso4溶液進(jìn)行結(jié)合，待樹脂充分變藍(lán)后，用結(jié)合緩沖液清洗以洗掉多余的niso4。以緩慢流速上樣上清液，使蛋白充分與鎳柱結(jié)合。上樣結(jié)束后用結(jié)合緩沖液平衡層析柱，再用梯度咪唑溶液(30、50、70、90及300mm)先后洗脫雜蛋白及目的蛋白，并收集洗脫液經(jīng)sds-page法分析洗脫液組成。sds-page結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明，兩種重組蛋白均在300mm咪唑洗脫液表現(xiàn)出最大含量，并且此時雜蛋白含量也最少。因此選擇300mm咪唑洗脫液進(jìn)行超濾(100kda，4℃，12000×g，6min)除鹽，最終產(chǎn)物保存于儲存緩沖液中(20mmtris，0.15mnacl，ph8.0)。

實(shí)施例5.n-lys-hfn目的融合蛋白的腸激酶切

向1.5mg/ml的目的蛋白溶液中加入適量的重組腸激酶，37℃水浴下，反應(yīng)16h，以切除組氨酸標(biāo)簽。將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至100kda超濾管，4℃，12000×g，離心6min，以去除重組腸激酶及切割的組氨酸標(biāo)簽，最終得到酶切后的終產(chǎn)物，即高純度的目的蛋白。酶切前hfn、4-lys-hfn、8-lys-hfn的亞基分子量分別為26.29kda、26.80kda、27.32kda，而經(jīng)酶切后則分別降低至21.50kda、22.00kda、22.53kda。故采用sds-page分析酶切前后的目的蛋白，結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酶切后hfn、4-lys-hfn、8-lys-hfn的亞基分子量明顯降低，且三種蛋白之間呈現(xiàn)分子量遞增趨勢，與各蛋白亞基相應(yīng)理論分子量相符合。酶切后4-lys-hfn、8-lys-hfn蛋白亞基的氨基酸序列分別如seqidno.3，seqidno.4所示。此外，從電泳圖中可看出，酶切并超濾后的目的蛋白純度較高，幾乎無其他雜蛋白條帶。因此可判斷目的蛋白4-lys-hfn、8-lys-hfn已成功表達(dá)并純化。最后通過tem對目的蛋白的形態(tài)進(jìn)行表征，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，寡聚賴氨酸修飾的重組鐵蛋白亞基在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)仍能夠成功自組裝，與未修飾的hfn形態(tài)無明顯差別，都表現(xiàn)為粒徑小且均一的中空籠結(jié)構(gòu)。