本發(fā)明一種結構可控高支化α-葡聚糖的合成方法及其應用，屬于食品、藥品和淀粉糖生產(chǎn)領域。

背景技術：

1、糖原是一種高分支度的葡聚糖，由α-1,4糖苷鍵連接的直鏈和α-1,6糖苷鍵連接的支鏈構成，其主要來源為植物或動物中提取獲得。提取工藝復雜、昂貴且影響糖原形態(tài)結構，因此限制了糖原做為功能性納米材料的應用。此外，天然提取糖原普遍不具有生物學活性。通過體外酶促合成途徑可以根據(jù)不同需求獲得結構可調(diào)控的具有類糖原結構、特殊生物學活性的葡聚糖。

2、酶法體外合成是高分支葡聚糖的主要來源方式。淀粉可以通過糖原分支酶的修飾獲得高分支葡聚糖，但存在葡聚糖結構調(diào)控弱的缺陷，只能合成固定結構的葡聚糖(li,cheng,and?robert?g.gilbert."progress?in?controlling?starch?structure?bymodifying?starch-branching?enzymes."planta?243.1(2016):13-22.)。蔗糖磷酸化酶、葡聚糖磷酸化酶和糖原分支酶能夠以蔗糖為底物合成高分支葡聚糖，此方法雖然能對葡聚糖結構進行調(diào)控，但存在反應體系復雜、成本高和產(chǎn)率低等缺陷(cn113481261a)。因此，亟需要開發(fā)高效、結構可控的高支化葡聚糖合成新方法。

3、淀粉蔗糖酶和糖原分支酶法(as-gbe法)能夠以蔗糖為底物合成高支化α-葡聚糖，由于其無毒、良好的生物相容性和生物可降解性成為了生物醫(yī)學合成功能性納米顆粒的理想替代品。florent?grimaud等人發(fā)明了利用淀粉蔗糖酶和糖原分支酶合成高支化葡聚糖的方法，但該方法僅提出合成的可能性，未對產(chǎn)物的精細結構進行調(diào)控，也沒有對產(chǎn)物的生物學活性進行開發(fā)與應用(grimaud,florent,et?al."in?vitro?synthesis?ofhyperbranchedα-glucans?using?a?biomimetic?enzymatic?toolbox."biomacromolecules?14.2(2013):438-447.)。

技術實現(xiàn)思路

1、為了改善上述技術問題，本發(fā)明提供一種體外合成不同結構高支化葡聚糖的方法，通過構建淀粉蔗糖酶(as)和糖原分支酶(gbe)體外催化蔗糖合成高支化葡聚糖的雙酶反應體系，對底物濃度和雙酶比例進行調(diào)控，提供了一種體外成合成結構可控高支化葡聚糖hbg的新方法，達到了對其結構進行精確調(diào)控的效果，同時創(chuàng)新性的將其應用于機體免疫調(diào)節(jié)。

2、第一方面，本發(fā)明提供一種體外合成不同分子量的高支化葡聚糖的方法，反應體系以磷酸鹽溶液為緩沖液，以蔗糖為底物，添加糖原分支酶和淀粉蔗糖酶進行反應；所述蔗糖濃度為0.05m～5m，糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量的比例(比酶活比例)為(0.05～12)：1；蔗糖濃度與hbg的分子量成正相關；通過調(diào)節(jié)蔗糖濃度有效控制hbg的分子量。

3、在一些技術方案中，所述蔗糖濃度為0.05m～1m，

4、和/或，糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量(比酶活比例)為(0.05～4)：1。

5、第二方面，本發(fā)明提供一種體外合成不同平均鏈長的高支化葡聚糖的方法，反應體系以磷酸鹽溶液為緩沖液，以蔗糖為底物，添加糖原分支酶和淀粉蔗糖酶進行反應；所述蔗糖濃度為0.05m～5m，糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量的比例(比酶活比例)為(0.05～12)：1；糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量的比例與hbg的平均鏈長成負相關，通過調(diào)節(jié)糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量的比例有效控制hbg的平均鏈長。

6、在一些技術方案中，所述蔗糖濃度為0.05m～1m，

7、和/或，糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量(比酶活比例)為(0.05～4)：1。

8、第三方面，本發(fā)明提供一種體外合成不同分支度的高支化葡聚糖的方法，反應體系以磷酸鹽溶液為緩沖液，以蔗糖為底物，添加糖原分支酶和淀粉蔗糖酶進行反應；所述蔗糖濃度為0.05m～5m，糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量的比例(比酶活比例)為(0.05～12)：1；蔗糖濃度與hbg的分支度成正相關，通過調(diào)節(jié)蔗糖濃度有效控制hbg的分支度。

9、在一些技術方案中，所述蔗糖濃度為0.05m～1m，

10、和/或，糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量(比酶活比例)為(0.05～4)：1。

11、第四方面，本發(fā)明提供一種體外合成不同分子量的高支化葡聚糖的方法，反應體系以磷酸鹽溶液為緩沖液，以蔗糖為底物，添加糖原分支酶和淀粉蔗糖酶進行反應，反應時間為0-24h；所述蔗糖濃度為0.05m～5m，糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量的比例(比酶活比例)為(0.05～12)：1；反應時間與hbg的分子量成正相關，通過調(diào)節(jié)反應時間有效控制hbg的分子量。

12、在一些技術方案中，反應時間為2-24h，

13、和/或，蔗糖濃度為0.05m～1m，

14、和/或，糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量(比酶活比例)為(0.05～4)：1。

15、在一些技術方案中，反應時間為2-12h，優(yōu)選為2-8h，更優(yōu)選為2-4h；

16、和/或，蔗糖濃度為0.5m，

17、和/或，糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量(比酶活比例)為2：1。

18、第五方面，本發(fā)明提供一種體外合成不同鏈長分布的高支化葡聚糖的方法，反應體系以磷酸鹽溶液為緩沖液，以蔗糖為底物，添加糖原分支酶和淀粉蔗糖酶進行反應，反應時間為0-24h；所述蔗糖濃度為0.05m～5m，糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量的比例(比酶活比例)為(0.05～12)：1；反應時間增長，hbg中dp≤5的鏈比例增加，dp6-12的鏈比例下降；通過調(diào)節(jié)反應時間有效控制hbg的鏈長分布。

19、在一些技術方案中，反應時間為2-24h，

20、和/或，蔗糖濃度為0.05m～1m，

21、和/或，糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量(比酶活比例)為(0.05～4)：1。

22、在一些技術方案中，反應時間為2-12h，優(yōu)選為2-8h，更優(yōu)選為2-4h；

23、和/或，蔗糖濃度為0.5m，

24、和/或，糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量(比酶活比例)為2：1。

25、第六方面，本發(fā)明提供一種體外合成不同分支度的高支化葡聚糖的方法，反應體系以磷酸鹽溶液為緩沖液，以蔗糖為底物，添加糖原分支酶和淀粉蔗糖酶進行反應，反應時間為0-24h；所述蔗糖濃度為0.05m～5m，糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量的比例(比酶活比例)為(0.05～12)：1；反應時間與hbg的分支度成正相關，通過調(diào)節(jié)反應時間有效控制hbg的分支度。

26、在一些技術方案中，反應時間為2-24h，

27、和/或，蔗糖濃度為0.05m～1m，

28、和/或，糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量(比酶活比例)為(0.05～4)：1。

29、在一些技術方案中，反應時間為2-12h，優(yōu)選為2-8h，更優(yōu)選為2-4h；

30、和/或，蔗糖濃度為0.5m，

31、和/或，糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量(比酶活比例)為2：1。

32、第七方面，本發(fā)明提供一種體外合成不同抗降解能力的高支化葡聚糖的方法，反應體系以磷酸鹽溶液為緩沖液，以蔗糖為底物，添加糖原分支酶和淀粉蔗糖酶進行反應；所述蔗糖濃度為0.05m～5m，糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量的比例(比酶活比例)為(0.05～12)：1；糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量的比例與hbg的抗降解能力成正相關；糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量的比例增加，慢消化組分sdg降低，抗消化rg含量增加；通過調(diào)節(jié)原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量的比例有效控制hbg的抗降解能力。

33、在一些技術方案中，所述蔗糖濃度為0.05m～1m，

34、和/或，糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量(比酶活比例)為(0.05～4)：1，優(yōu)選為(0.05～2)：1，更優(yōu)選為(0.05～0.5)：1。

35、第八方面，本發(fā)明提供一種高支化葡聚糖，制備方法為：

36、反應體系以磷酸鹽溶液為緩沖液，以蔗糖為底物，添加糖原分支酶和淀粉蔗糖酶進行反應；所述蔗糖濃度為0.05m～5m，糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量的比例(比酶活比例)為(0.05～12)：1。

37、在一些技術方案中，所述蔗糖濃度為0.05m～1m，

38、和/或，糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量(比酶活比例)為(0.05～4)：1。

39、在一些技術方案中，所述蔗糖濃度為0.5m，

40、和/或，糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量(比酶活比例)為2：1。

41、在一些技術方案中，高支化葡聚糖的鏈長分布：dp≤5為36.55％、dp?6-12為61.40％，dp?13-24為1.77％；

42、和/或，平均鏈長為6.49；

43、和/或，分支度為12.3％；

44、和/或，分子量mw為6.7×105g/mol。

45、第九方面，本發(fā)明提供上述高支化葡聚糖在制備免疫調(diào)節(jié)的產(chǎn)品中的應用。

46、在一些技術方案中，免疫調(diào)節(jié)為促巨噬細胞增殖。

47、在一些技術方案中，產(chǎn)品為食品、藥品和/或保健品。

48、在一些技術方案中，高支化葡聚糖的制備方法為：

49、反應體系以磷酸鹽溶液為緩沖液，以蔗糖為底物，添加糖原分支酶和淀粉蔗糖酶進行反應；所述蔗糖濃度為0.05m～5m，糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量的比例(比酶活比例)為(0.05～12)：1。

50、在一些技術方案中，所述蔗糖濃度為0.05m～1m，

51、和/或，糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量(比酶活比例)為(0.05～4)：1。

52、在一些技術方案中，所述蔗糖濃度為0.5m，

53、和/或，糖原分支酶和淀粉蔗糖酶的添加量(比酶活比例)為2：1。

54、在一些技術方案中，高支化葡聚糖的鏈長分布：dp≤5為36.55％、dp?6-12為61.40％，dp?13-24為1.77％；

55、和/或，平均鏈長為6.49；

56、和/或，分支度為12.3％；

57、和/或，分子量mw為6.7×105g/mol。

58、有益效果

59、本發(fā)明通過構建淀粉蔗糖酶(as)和糖原分支酶(gbe)體外催化蔗糖合成高支化葡聚糖的雙酶反應體系，對底物濃度和雙酶比例進行調(diào)控，提供了一種體外成合成結構可控高支化葡聚糖的新方法，達到了對其結構進行精確調(diào)控的效果，同時創(chuàng)新性的將其應用于機體免疫調(diào)節(jié)。