本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及一種草魚出血病和敗血癥二聯(lián)亞單位疫苗的制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的重要組成部分。草魚作為較為最重要的淡水養(yǎng)殖品種，草魚出血病和細(xì)菌性敗血癥是目前養(yǎng)殖草魚的主要病害。

2、草魚出血病病原gcrv病毒顆粒組成主要包括蛋白質(zhì)和核酸，含少量糖類，不含類脂；反復(fù)凍融對(duì)病毒感染力有較大影響。gcrv病毒顆粒由多層排列，呈正二十面球體，直徑約55～80nm，無囊膜結(jié)構(gòu)，外衣殼由200個(gè)的三聚體按t＝13排列構(gòu)成，內(nèi)衣殼由120個(gè)單體按t＝1排列構(gòu)成。gcrv分離株主要可以分為3種基因型，包括gcrv-ⅰ型、gcrv-ⅱ型和gcrv-ⅲ型。由于毒株間基因組序列的差異，各毒株的細(xì)胞培養(yǎng)特性、毒力、致病性和抗原性各不相同。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，以gcrv?hunan1307和gcrvgd108為代表的ii型毒株是目前引起草魚出血病最主要的流行毒株。

3、維氏氣單胞菌(aeromonas)作為條件致病菌，是引發(fā)淡水魚類、蝦蟹、貝類細(xì)菌性敗血癥的主要病原菌，使其出現(xiàn)免疫力下降、出血、腹水、眼球突出及腸炎等癥狀，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。維氏氣單胞菌引起淡水魚類細(xì)菌性敗血癥的報(bào)道逐漸增多，維氏氣單胞菌的毒力表現(xiàn)在多方面，不僅與毒力基因有關(guān)，同時(shí)還包括表面相關(guān)分子、運(yùn)動(dòng)、生物活性細(xì)胞外產(chǎn)物和生物膜的形成。

4、草魚呼腸孤病毒和維氏氣單胞菌都可引起草魚出血死亡，常常伴隨混合感染或繼發(fā)感染，然而目前尚沒有能夠同時(shí)有效預(yù)防和控制兩種疫病發(fā)生都有效方法。

5、現(xiàn)有疫苗的類型及存在的問題：

6、草魚出血病組織勻漿滅活疫苗，通過將發(fā)病草魚組織勻漿滅活后制備的土法疫苗，雖然有效，但是存在疫苗成分和含量不穩(wěn)定的問題，此外還存在滅活不徹底的可能，以上問題造成草魚出血病組織勻漿滅活疫苗的使用保護(hù)效果不穩(wěn)定，使用后還存在大規(guī)模爆發(fā)疫病的風(fēng)險(xiǎn)。草魚出血病細(xì)胞培養(yǎng)病毒滅活疫苗雖然安全可靠，但是由于病毒滴度較低導(dǎo)致疫苗成本高、且無法實(shí)現(xiàn)多聯(lián)多價(jià)疫苗制備。

7、減毒疫苗又稱弱毒疫苗或活疫苗，是應(yīng)用減毒或無毒的活病原微生物制成。與滅活疫苗(死疫苗)相比，這類疫苗免疫力強(qiáng)、作用時(shí)間長(zhǎng)，但需冷凍保存、存在致病性、刺激性過強(qiáng)和回復(fù)致病性的潛在危險(xiǎn)。且查閱相關(guān)資料，目前獲批使用的為gcrv-i毒株制備的弱毒疫苗，并沒有關(guān)于gcrv-ii的減毒疫苗的研發(fā)。綜上，弱毒活疫苗，安全性較低，存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)；且獲得生產(chǎn)批號(hào)的草魚出血病活疫苗由于流行毒株發(fā)生變化，保護(hù)效果較差；維氏氣單胞菌由于存在多種血清型，因此目前的單價(jià)的草魚細(xì)菌性敗血癥減毒疫苗的交叉保護(hù)效果也不理想。

8、基因工程亞單位疫苗是利用基因重組技術(shù)，將抗原蛋白基因在體外表達(dá)并純化獲得只含有一種或幾種主要抗原成分而制備的疫苗。它的優(yōu)點(diǎn)是抗原成分比較單一，沒有毒力因子和其他遺傳信息，不會(huì)在機(jī)體內(nèi)復(fù)制，對(duì)宿主沒有感染性，安全性和穩(wěn)定性高。目前，已有很多研究報(bào)道了關(guān)于草魚出血病的亞單位疫苗，并且在實(shí)驗(yàn)條件下取得了良好的效果，但亞單位疫苗普遍存在保護(hù)率較低的情況，且目前尚無草魚重要病害多聯(lián)多價(jià)疫苗。

9、核酸疫苗利用編碼抗原蛋白的目的片段進(jìn)到動(dòng)物體內(nèi)，選擇其表達(dá)系統(tǒng)得到蛋白，誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答和較好的保護(hù)效果。dna疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比制備相對(duì)簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，使用時(shí)不需要添加佐劑，穩(wěn)定性好，免疫效率高且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。但dna?疫苗安全問題也存在爭(zhēng)議，如dna在體內(nèi)不可控，可能會(huì)整合到宿主基因組上，存在遺傳及免疫耐受的風(fēng)險(xiǎn)。

10、目前已有疫苗總結(jié)：

11、表1

12、

13、

14、

15、草魚呼腸孤病毒和維氏氣單胞菌都可引起草魚出血死亡，常常伴隨混合感染或繼發(fā)感染，對(duì)于草魚出血病、敗血癥來說，預(yù)防是最有效的方法之一。并且免疫防治不會(huì)出現(xiàn)藥物防治所帶來的破壞環(huán)境的問題，免疫防治不僅安全而且成效也好于藥物防治，所以研制有效的疫苗對(duì)草魚出血病、白血病的防治具有深遠(yuǎn)的意義。

16、因此為了有效控制草魚出血病的發(fā)生應(yīng)該同時(shí)控制兩種病原體的出現(xiàn)，本發(fā)明即以此為指導(dǎo)進(jìn)行二聯(lián)亞單位疫苗的研制，以期一針多防，聯(lián)防聯(lián)控同時(shí)控住草魚呼腸孤病毒和維氏氣單胞菌的發(fā)生，減少草魚出血病、敗血癥帶來的危害。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明第一方面的目的，在于提供一種融合基因。

2、本發(fā)明第二方面的目的，在于提供上述融合基因表達(dá)的融合蛋白。

3、本發(fā)明第三方面的目的，在于提供包含上述融合基因或表達(dá)上述融合蛋白的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒或重組菌。

4、本發(fā)明第四方面的目的，在于提供上述融合基因、融合蛋白、重組表達(dá)載體、表達(dá)盒或重組菌的應(yīng)用。

5、本發(fā)明第五方面的目的，在于提供一種產(chǎn)品。

6、本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

7、本發(fā)明的第一方面，提供一種融合基因，所述融合基因中含有草魚呼腸孤病毒的vp6基因序列和維氏氣單胞菌ompaⅱ基因序列。

8、優(yōu)選地，所述融合基因還包括接頭序列。

9、優(yōu)選地，所述接頭包括柔性接頭、剛性接頭或可剪切接頭。

10、優(yōu)選地，所述柔性接頭的序列為ggtggcggtggctca。

11、優(yōu)選地，所述融合基因的核苷酸序如seq?id?no.1所示。

12、本發(fā)明的第二方面，提供一種融合蛋白，所述融合蛋白由本發(fā)明第一方面所述的融合基因編碼。

13、本發(fā)明的第三方面，提供含有如本發(fā)明第一方面所述的融合基因或本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒或重組菌。

14、優(yōu)選地，所述表達(dá)載體包括但不限于pet系列、duet系列、pgex系列、phy300、phy300plk、ppic系列。

15、優(yōu)選地，所述表達(dá)載體為pet32a載體。

16、優(yōu)選地，所述重組菌包括但不限于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌。

17、優(yōu)選地，所述重組菌為重組大腸桿菌，分類命名為大腸氏菌pet32a-vp6-ompa?ii/bl21(escherichia?coli?pet32a-vp6-ompa?ii/bl21)，保藏于位于中國(guó)武漢.武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏時(shí)間為2024年05月17日；保藏編號(hào)是cctcc?no：m?2024974。

18、本發(fā)明還提供上述融合蛋白的制備方法，包括以下步驟：構(gòu)建含有編碼上述融合基因的重組載體；將所述的重組載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆后進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)，提取、純化蛋白，得到融合蛋白。

19、本發(fā)明的第四方面，提供本發(fā)明第一方面所述的融合基因或本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白或本發(fā)明第三方面的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒或轉(zhuǎn)基因重組菌在制備防治草魚呼腸孤病毒和/或維氏氣單胞菌引起的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

20、優(yōu)選地，所述草魚呼腸孤病毒和/或維氏氣單胞菌引起的疾病包括草魚出血病和/或草魚敗血癥。

21、優(yōu)選地，所述產(chǎn)品還包括佐劑。

22、優(yōu)選地，所述產(chǎn)品為藥物。

23、優(yōu)選地，所述藥物為疫苗。

24、優(yōu)選地，所述疫苗為亞單位疫苗。

25、優(yōu)選地，所述藥物的給藥途徑包括腹腔注射、肌肉注射。

26、優(yōu)選地，所述佐劑包括isa763a、氫氧化鋁、卵磷脂、弗氏佐劑、mpltm、il-12、isa51vg、isa720vg、mf59、qs21、as03佐劑中的至少一種。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以根據(jù)實(shí)際使用需求，選擇其他的免疫佐劑用于制備適合使用的疫苗。

27、本發(fā)明的第五方面，提供一種產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括本發(fā)明第一方面所述的融合基因或本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白或本發(fā)明第三方面的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因重組菌。

28、優(yōu)選地，所述產(chǎn)品還包括佐劑。

29、優(yōu)選地，所述產(chǎn)品為藥物。

30、優(yōu)選地，所述藥物為疫苗。

31、優(yōu)選地，所述疫苗為亞單位疫苗。

32、優(yōu)選地，所述藥物的給藥途徑包括腹腔注射、肌肉注射。

33、優(yōu)選地，所述佐劑包括isa763a、氫氧化鋁、卵磷脂、mpltm、il-12、isa51vg、isa720vg、mf59、qs21、as03佐劑中的至少一種。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以根據(jù)實(shí)際使用需求，選擇其他的免疫佐劑用于制備適合使用的疫苗。

34、本發(fā)明還提供上述亞單位疫苗的制備方法，包括將純化后的融合蛋白與佐劑混合。

35、優(yōu)選地，所述融合蛋白與佐劑的質(zhì)量比為1:0.5～2。

36、本發(fā)明的有益效果是：

37、本發(fā)明提供了一種由gcrv的vp6蛋白和維氏氣單胞菌的外膜蛋白o(hù)mpaii連接獲得的融合基因，將該融合基因表達(dá)融合蛋白對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行腹腔注射免疫，采集脾臟和腎組織，通過qpcr測(cè)定各組織中免疫相關(guān)基因的表達(dá)量水平；結(jié)果表明所制備的二聯(lián)亞單位疫苗通過注射免疫能夠刺激魚體不同免疫組織產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)；在免疫后第28d，腹腔注射gcrv強(qiáng)毒及維氏氣單胞菌進(jìn)行魚體攻毒實(shí)驗(yàn)，攻毒后15天，對(duì)維氏氣單胞菌和草魚呼腸孤病毒感染相對(duì)存活率(rps)分別為85％和55％，表明本發(fā)明二聯(lián)亞單位疫苗對(duì)養(yǎng)殖草魚重要病害均具有較好的保護(hù)效果。