本發(fā)明屬于生物化學(xué)和分子免疫學(xué)，具體涉及到一種雞p4hb蛋白多克隆抗體的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、雞p4hb蛋白，也被稱為蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(protein?disulfide?isomerase,pdi)，是一種在雞體內(nèi)廣泛存在的蛋白質(zhì)。主要存在于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmicreticulum,er)中,也可以被釋放到細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)中。其生物學(xué)功能是促進(jìn)二硫鍵(sgs)的形成、破裂和重排。而sgs是連接兩個半胱氨酸殘基的共價鍵,是維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的重要組成元件,其變化能夠影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。研究證明p4hb在蛋白質(zhì)產(chǎn)生、釋放過程中起到氧化還原酶、異構(gòu)酶和分子伴侶的作用。除此之外，p4hb蛋白在蛋白質(zhì)折疊和功能性修飾中扮演著關(guān)鍵角色。它能幫助蛋白質(zhì)正確折疊并形成功能性結(jié)構(gòu)，這對于維持細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。p4hb蛋白還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞和細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程。這對于維持細(xì)胞間通訊和協(xié)調(diào)細(xì)胞行為具有重要意義。

2、自蛋白二硫鍵異構(gòu)酶被發(fā)現(xiàn)以來，國內(nèi)外研究者對其結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能進(jìn)行了大量研究,發(fā)現(xiàn)其與血栓性疾病、腫瘤和神經(jīng)退行性疾病有密切聯(lián)系，提示了其具有作為新治療靶點的潛力,以及作為疾病診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的潛能。雞作為我國重要的經(jīng)濟(jì)家畜和人們動物蛋白的主要來源，保證雞的健康，提高雞的生產(chǎn)性能是畜牧獸醫(yī)工作的重要責(zé)任。同時，雞作為一種重要的模型動物，開展雞的研究也為進(jìn)一步研究人類疾病提供重要的參考價值。但是，由于市場上檢測雞蛋白抗體的缺乏，嚴(yán)重制約了對雞p4hb蛋白功能的研究。因此，制備用于雞p4hb蛋白檢測的抗體就顯得特別重要，既能用于研究p4hb在雞體內(nèi)的生理功能，又能彌補(bǔ)市場上對此抗體的需求。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本部分的目的在于概述本發(fā)明的實施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實施例。在本部分以及本申請的說明書摘要和發(fā)明名稱中可能會做些簡化或省略以避免使本部分、說明書摘要和發(fā)明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發(fā)明的范圍。

2、鑒于上述和/或現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提出了本發(fā)明。

3、因此，本發(fā)明的目的是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種雞his-p4hb修飾多肽。

4、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：所述雞his-p4hb修飾多肽的氨基酸序列如seq?id?no.3所示。

5、所述雞his-p4hb修飾多肽由如seq?id?no.1所示的雞p4hb多肽的氨基酸序列篩選肽段進(jìn)行組氨酸標(biāo)簽修飾后原核表達(dá)得來。

6、本發(fā)明的另一個目的是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種雞his-p4hb修飾多肽的多克隆抗體,所述雞his-p4hb修飾多肽的多克隆抗體通過雞his-p4hb修飾多肽作為抗原免疫獲得。

7、本發(fā)明的另一個目的是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種雞his-p4hb修飾多肽的多克隆抗體的制備方法。

8、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：pcr擴(kuò)增雞p4hb基因，并將其同源重組至表達(dá)載體中，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pcoldii-p4hb；

9、將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化e.coli?bl21并用iptg進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，然后利用ni-nta親和層析方法進(jìn)行蛋白純化，將純化的his-p4hb蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化后免疫再分離血清，經(jīng)proteina+g親和層析純化后凍存于-80℃得到多克隆抗體。

10、作為本發(fā)明所述制備方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述免疫條件為采用頸背部多點皮下注射，首免后第3周和第5周分別進(jìn)行二免和三免，均采用弗氏不完全佐劑乳化，方法和劑量與首免相同。

11、作為本發(fā)明所述制備方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述免疫劑量為200μg/只。

12、作為本發(fā)明所述制備方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述三免后第9天，通過耳緣靜脈采血分離血清。首免后第7周進(jìn)行第四次免疫，一周后心臟采血。

13、作為本發(fā)明所述制備方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述原核重組表達(dá)的his-p4hb蛋白表達(dá)在e.coli?bl21細(xì)胞上清中，分子質(zhì)量約為25kda。

14、本發(fā)明的另一個目的是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種雞his-p4hb修飾多肽的多克隆抗體在檢測雞p4hb蛋白表達(dá)以及研究p4hb蛋白功能及作用機(jī)制中的應(yīng)用。

15、作為本發(fā)明所述應(yīng)用的一種優(yōu)選方案，其中：所述多克隆抗體通過western?blot和間接免疫熒光鑒定雞原代巨噬細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源p4hb蛋白的表達(dá)與細(xì)胞定位情況。

16、本發(fā)明有益效果：

17、(1)本發(fā)明利用pcr方法擴(kuò)增了雞p4hb基因，并將其同源重組至pcoldii載體中，構(gòu)建了原核重組表達(dá)質(zhì)粒pcoldii-p4hb。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化e.coli?bl21(de3)并用iptg進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)的his-p4hb重組蛋白經(jīng)sds-page方法鑒定，sds-page結(jié)果顯示約25kda處有一條明顯的條帶。然后利用ni-nta親和層析方法進(jìn)行蛋白純化，將純化的his-p4hb蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化后，將純化的蛋白免疫新西蘭大白兔，采用頸背部多點皮下注射，免疫劑量為200μg/只，首免后第3周和第5周分別進(jìn)行二免和三免，均采用弗氏不完全佐劑乳化，方法和劑量與首免相同。三免后第9天，通過耳緣靜脈采血分離血清。首免后第7周進(jìn)行第四次免疫，一周后心臟采血。該抗體經(jīng)proteina+g親和層析純化后凍存于-80℃冰箱。通過western?blot和間接免疫熒光染色技術(shù)(if)鑒定雞原代巨噬細(xì)胞(hd11)表達(dá)的內(nèi)源p4hb蛋白的表達(dá)與細(xì)胞定位情況進(jìn)而驗證其應(yīng)用。

18、(2)本發(fā)明原核表達(dá)的his-p4hb蛋白表達(dá)在e.coli?bl21細(xì)胞上清中，分子質(zhì)量約為25kda；實驗兔4次免疫p4hb重組蛋白后采血并分離血清，經(jīng)過純化，該抗體能夠用于westernblot和if鑒定雞內(nèi)源p4hb蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位。

19、(3)本發(fā)明通過預(yù)測抗原決定簇，使用原核表達(dá)技術(shù)制備了his-p4hb多肽，免疫新西蘭大白兔，成功制備其多克隆抗體，該抗體經(jīng)驗證可用于雞p4hb線性或天然構(gòu)象蛋白的定性、定量和細(xì)胞定位等應(yīng)用方向，這為進(jìn)一步探究雞蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的生物學(xué)功能，以及該酶產(chǎn)生的催化反應(yīng)所發(fā)揮的生物學(xué)功能打下了基礎(chǔ)。

技術(shù)特征：

1.一種雞his-p4hb修飾多肽，其特征在于：所述雞his-p4hb修飾多肽的氨基酸序列如seq?id?no.3所示。

2.如權(quán)利要求1所述的雞his-p4hb修飾多肽，其特征在于：所述雞his-p4hb修飾多肽由如seq?id?no.1所示的雞p4hb多肽的氨基酸序列篩選肽段進(jìn)行組氨酸標(biāo)簽修飾后原核表達(dá)得來。

3.一種雞his-p4hb修飾多肽的多克隆抗體，其特征在于：所述雞his-p4hb修飾多肽的多克隆抗體通過雞his-p4hb修飾多肽作為抗原免疫獲得。

4.如權(quán)利要求3所述的雞his-p4hb修飾多肽的多克隆抗體的制備方法，其特征在于：包括：

5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述免疫條件為采用頸背部多點皮下注射，首免后第3周和第5周分別進(jìn)行二免和三免，均采用弗氏不完全佐劑乳化，方法和劑量與首免相同。

6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：所述免疫劑量為200μg/只。

7.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：所述三免后第9天，通過耳緣靜脈采血分離血清。首免后第7周進(jìn)行第四次免疫，一周后心臟采血。

8.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述原核重組表達(dá)的his-p4hb蛋白表達(dá)在e.coli?bl21細(xì)胞上清中，分子質(zhì)量約為25kda。

9.如權(quán)利要求3所述的雞p4hb蛋白修飾多肽的多克隆抗體在檢測雞p4hb蛋白表達(dá)以及研究p4hb蛋白功能及作用機(jī)制中的應(yīng)用。

10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于：所述多克隆抗體通過western?blot和間接免疫熒光鑒定雞原代巨噬細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源p4hb蛋白的表達(dá)與細(xì)胞定位情況。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種兔抗雞P4HB蛋白多克隆抗體的制備方法及其應(yīng)用，包括，利用PCR方法擴(kuò)增了雞P4HB基因，并將其同源重組至pCOLDII載體中，構(gòu)建了原核重組表達(dá)質(zhì)粒pCOLDII?P4HB。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli?BL21(DE3)并用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用Ni?NTA親和層析方法進(jìn)行蛋白純化，將純化的HIS?P4HB蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化后，將純化的蛋白免疫新西蘭大白兔，采用頸背部多點皮下注射，該抗體經(jīng)ProteinA+G親和層析純化后凍存于?80℃冰箱。原核表達(dá)的HIS?P4HB蛋白表達(dá)在感受態(tài)細(xì)胞上清中，分子質(zhì)量約為25KDa；實驗兔4次免疫P4HB重組蛋白后采血并分離血清，經(jīng)過純化，該抗體能夠通過Western?blot和IF鑒定天然構(gòu)象和線性化的P4HB蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位。

技術(shù)研發(fā)人員：宋瑞龍,芮舒顏,彭韻雯,張宛,羊揚,何麗霞,蔣寧,仝錫帥,鄒輝,馬勇剛,劉宗平
受保護(hù)的技術(shù)使用者：揚州大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/5