專利名稱：Apoe基因檢測(cè)試劑盒及擴(kuò)增方法和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)SNP位點(diǎn)的試劑盒及其PCR擴(kuò)增方法和檢測(cè)方法，尤其是利用多重PCR結(jié)合分子開關(guān)技術(shù)檢測(cè)APOE酶活性相關(guān)的SNP位點(diǎn)的試劑盒及其多重PCR擴(kuò)增方法和檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
載脂蛋白E(apolipoproteinE, apoE)是血衆(zhòng)載脂蛋白一個(gè)重要組成部分，是1973年首先在正常人的極低密度脂蛋白(VLDL)中發(fā)現(xiàn)的，由299個(gè)氨基酸組成的單一多肽鏈，相對(duì)分子量為34kD的糖蛋白。人類apoE主要存在于VLDL、LDL、CM和CM殘骸(Chy1micronremm-ants)中，也存在于β -VLDL和HDL的亞類HDL1和HDLc中。它主要在肝臟合成，約占血漿apoE的2/3-3/4。ApoE是血漿中重要的載脂蛋白之一，對(duì)血脂代謝起重要的調(diào)節(jié)作用，近年來研究發(fā)現(xiàn)，APOE基因多態(tài)與冠心病、老年性癡呆(Alzheimer’ s, AD)及老化等疾病有關(guān)。Apo E是一個(gè)多態(tài)性蛋白，有三個(gè)常見的異構(gòu)體，即E2、E3和E4，其基因APOE上存在 2 個(gè) SNP 位點(diǎn):Cysl 12Arg(rs429358)和 Argl58Cys (rs7412)，野生型基因?yàn)?Cysll2、Argl58，表達(dá)為E3蛋白；E4蛋白為rs429358突變，即Argl 12 ;E2蛋白為rs7412突變，即Cysl58。ApoE的主要生理功能是通過與LDL受體結(jié)合并參與LDL代謝過程，APOE基因的變異可影響LDL受體結(jié)合活性而影響脂質(zhì)代謝，進(jìn)而影響疾病的發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容
APOE基因上兩個(gè)中國(guó)人常見SNP直接影響APOE酶的活性，影響多疾病的發(fā)生。本發(fā)明提供一種利用多重PCR結(jié)合分子開關(guān)技術(shù)對(duì)APOE基因進(jìn)行基因檢測(cè)的試劑盒及其多重PCR擴(kuò)增方法和檢測(cè) 方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案:一種APOE基因檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括檢測(cè)基因APOE rs429358位點(diǎn)和rs7412位點(diǎn)的引物及內(nèi)參引物。所述試劑盒包括檢測(cè)APOE基因rs429358位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物、APOE基因rs7412位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物、APOE基因內(nèi)參上游引物及一個(gè)反向共用引物。所述檢測(cè)APOE基因rs429358位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示:正向野生型引物:TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGT正向突變型引物:TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGC所述檢測(cè)APOE基因rs7412位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示:正向野生型引物:TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGC正向突變型引物:TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGT所述APOE基因內(nèi)參上游引物和共用下游引物:正向內(nèi)參引物:CCGCAGGGCGCTGATGGACGAGACCATG反向共用弓I物:CCCGCACGCGGCCCTGTTCCACCA。
所述的APOE基因檢測(cè)試劑盒所采用的檢測(cè)方法，對(duì)受檢樣本DNA分別用野生型和突變擴(kuò)增緩沖液進(jìn)行擴(kuò)增，在每個(gè)反擴(kuò)增反應(yīng)中同時(shí)對(duì)2個(gè)目的片段和I個(gè)內(nèi)參片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段由大到小依次是:內(nèi)對(duì)照398bp，rs429358264bp，rs7412129bp ;擴(kuò)增后經(jīng)凝膠電泳在紫外光下見到根據(jù)片段大小區(qū)分開的產(chǎn)物條帶，根據(jù)條帶的有無判斷2個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型。所述的APOE基因檢測(cè)試劑盒的多重PCR擴(kuò)增方法，包括以下步驟:預(yù)變性由1次循環(huán)構(gòu)成，其條件為:溫度為94°C，時(shí)間為5分鐘；PCR擴(kuò)增由30次循環(huán)構(gòu)成，其條件為:變性:溫度為94 °C，時(shí)間為30秒；退火:溫度為65°C，時(shí)間為30秒；延伸:溫度為72°C，時(shí)間為90秒；擴(kuò)增結(jié)束后于4°C保存至電泳檢測(cè)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果:(I)本發(fā)明采用多重PCR擴(kuò)增技術(shù)，在一次PCR反應(yīng)中對(duì)2個(gè)包含SNP位點(diǎn)的DNA片段和I個(gè)內(nèi)參片段同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，提高檢測(cè)效率降低檢測(cè)成本。(2)本發(fā)明采用SNP敏感性分子開關(guān)技術(shù)，使3’端不能與模板互補(bǔ)的引物所引發(fā)的擴(kuò)增非成熟性終止，無法形成產(chǎn)物，避免假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。(3)引入內(nèi)參，為陰性結(jié)果的判讀提供依據(jù)，避免假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。(4)本發(fā)明擴(kuò)增后只需通過DNA凝膠電泳及凝膠成像系統(tǒng)即可完成檢測(cè)，不需添置貴重設(shè)備，快速，準(zhǔn)確，靈敏，特異，重復(fù)性好，大幅降低了檢測(cè)成本和操作復(fù)雜程度，適合臨床和科研使用。(5)無需DNA提取，只需裂解全血細(xì)胞，將細(xì)胞裂解后的懸液加入反應(yīng)體系即可完成擴(kuò)增，免去DNA提取的步驟和成本并避免氣溶膠污染。(6)本發(fā)明的試劑盒，分別提供野生型和突變型的2X擴(kuò)增緩沖液，使用者只要全血裂解懸液和聚合酶即可進(jìn)行擴(kuò)增，減少了操作步驟，提高勞動(dòng)速率，可以實(shí)現(xiàn)高效率檢測(cè)。(7)本發(fā)明的試劑盒所提供的野生型和突變型2X擴(kuò)增緩沖液，使用了不同顏色的擴(kuò)增指示染料，方便加樣時(shí)區(qū)分，避免人為錯(cuò)誤。擴(kuò)增后即可直接進(jìn)行凝膠電泳，無需加A loading buffer,操作方便快捷。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。本發(fā)明APOE基因檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒可同時(shí)對(duì)APOE基因上的rs429358位點(diǎn)和rs7412位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增分型檢測(cè)，以APOE基因?yàn)閮?nèi)參來檢測(cè)擴(kuò)增條件；野生型2X緩沖包含上述2個(gè)SNP位點(diǎn)的野生型正向序列特異性引物、共用反向引物和上游內(nèi)參引物，通過擴(kuò)增后DNA電泳條帶的有無判斷是否攜帶對(duì)應(yīng)SNP位點(diǎn)的野生型表型；突變型2 X緩沖液包含上述2個(gè)SNP位點(diǎn)的突變型正向序列特異性引物、共用反向引物和上游內(nèi)參引物，通過擴(kuò)增后DNA電泳條帶的有無判斷是否攜帶對(duì)應(yīng)SNP位點(diǎn)的突變型表型；當(dāng)其中一個(gè)SNP位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的片段長(zhǎng)度條帶僅在野生型擴(kuò)增中得出陽性結(jié)果，突變型擴(kuò)增對(duì)應(yīng)位置條帶為陰性時(shí)判讀為野生純合型，相反為突變純合型，野生型和突變型擴(kuò)增都出現(xiàn)陽性條帶其結(jié)果為雜合型，通過野生型和突變型的特異性擴(kuò)增經(jīng)過DNA凝膠電泳綜合分析確認(rèn)受試者的基因型。所述檢測(cè)APOE基因rs429358位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示:正向野生型引物:TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGT正向突變型引物:TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGC所述檢測(cè)APOE基因rs7412位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示:正向野生型引物:TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGC正向突變型引物:TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGT所述APOE基因內(nèi)參上游弓丨物和共用下游引物:正向內(nèi)參引物:CCGCAGGGCGCTGATGGACGAGACCATG反向共用引物:CCCGCACGCGGCCCTGTTCCACCA本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括:野生型2 X擴(kuò)增緩沖混合液，突變型2 X擴(kuò)增緩沖混合液，高保真聚合酶。本試劑盒共40人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_20°C。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。實(shí)施例步驟1:全血細(xì)胞裂解液的制備取受檢者外周靜脈血300 μ 1，加入700 μ I細(xì)胞裂解液，顛倒混勻5次，12000rpm離心I分鐘，倒去上清，并將離心管倒置在干凈的吸水紙上停留2分鐘，確保沉淀在管中，加Λ 300 μ I雙蒸水，渦旋震蕩混勻成細(xì)胞裂解懸液。步驟2 =PCR擴(kuò)增反應(yīng)1、配置野生型反應(yīng)體系:PCR管內(nèi)加入細(xì)胞裂解懸液4.8 μ 1、加入5 μ 12Χ野生型擴(kuò)增緩沖液和0.2 μ I聚合酶(2.5U/ μ I)混合構(gòu)成獨(dú)立的反應(yīng)體系，加樣后充分混勻，短暫離心，具體見下表:
權(quán)利要求
1.一種APOE基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測(cè)基因APOE rs429358位點(diǎn)和rs7412位點(diǎn)的引物及內(nèi)參引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的APOE基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測(cè)APOE基因rs429358位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物、APOE基因rs7412位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物、APOE基因內(nèi)參上游引物及一個(gè)反向共用引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的APOE基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)APOE基因rs429358位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示: 正向野生型引物:TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGT 正向突變型引物:TGGGCGCGGACATGGAGGACGTGC 所述檢測(cè)APOE基因rs7412位點(diǎn)的引物堿基序列如下所示: 正向野生型引物:TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGC 正向突變型引物:TCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGT 所述APOE基因內(nèi)參上游引物和共用下游引物: 正向內(nèi)參引物:CCGCAGGGCGCTGATGGACGAGACCATG 反向共用弓 I 物:CCCGCACGCGGCCCTGTTCCACCA
4.一種權(quán)利要求1所述的APOE基因檢測(cè)試劑盒所采用的檢測(cè)方法，其特征在于，對(duì)受檢樣本DNA分別用野生型和突變擴(kuò)增緩沖液進(jìn)行擴(kuò)增，在每個(gè)反擴(kuò)增反應(yīng)中同時(shí)對(duì)2個(gè)目的片段和I個(gè)內(nèi)參片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段由大到小依次是:內(nèi)對(duì)照398bp，rs429358264bp，rs7412 129bp ;擴(kuò)增后經(jīng)凝膠電泳在紫外光下見到根據(jù)片段大小區(qū)分開的產(chǎn)物條帶，根據(jù)條帶的有無判斷2個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型。
5.一種權(quán)利要求1所述的APOE基因檢測(cè)試劑盒的多重PCR擴(kuò)增方法，其特征在于，包括以下步驟: 預(yù)變性由I次循環(huán)構(gòu)成，其條件為:溫度為94°C，時(shí)間為5分鐘； PCR擴(kuò)增由30次循環(huán)構(gòu)成，其條件為: 變性:溫度為94°C，時(shí)間為30秒； 退火:溫度為65°C，時(shí)間為30秒； 延伸:溫度為72°C，時(shí)間為90秒； 擴(kuò)增結(jié)束后于4°C保存至電泳檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種APOE基因檢測(cè)試劑盒及擴(kuò)增方法和檢測(cè)方法。所述試劑盒對(duì)APOE基因上明顯改變其產(chǎn)物活性的兩個(gè)常見的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分型，包括rs429358SNP位點(diǎn)和rs7412SNP位點(diǎn)。試劑盒包含野生型2×擴(kuò)增緩沖液、突變型2×擴(kuò)增緩沖液、聚合酶，兩種緩沖液中分別含有對(duì)應(yīng)SNP野生型和突變型表型的序列特異性引物和內(nèi)參引物，可在兩個(gè)多重PCR反應(yīng)中完成對(duì)上述兩個(gè)SNP位點(diǎn)的分型，從而對(duì)APOE基因進(jìn)行基因分型，為該基因所表達(dá)的酶的活性的預(yù)測(cè)提供分子生物學(xué)依據(jù)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103184266SQ20111044618
公開日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者韓俊領(lǐng), 杜宏偉, 周毓玲, 崔麗娟 申請(qǐng)人:協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司, 天津?yàn)I海協(xié)和基因科技有限公司