專利名稱：：基因的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及采用探針聚合物制備方法檢測基因的方法，所述探針聚合物的制備方法是使用復(fù)數(shù)對由n(n≥3)個互補(bǔ)堿基序列區(qū)域構(gòu)成的成對探針(以下，有時稱為HoneyCombProbeHCP)，使之雜交達(dá)到相互交錯的狀態(tài)，從而形成雙鏈聚合物的方法(USP6261846、特開2000-201687號以及特愿2000-98797號，以下，稱為PALSAR(Probealternationlinkself-assemblyreaction)法)。
背景技術(shù)：
：已開發(fā)出通過進(jìn)行雜交使之與目標(biāo)基因或單核苷酸多態(tài)性互補(bǔ)的二個低聚核苷酸鄰接從而連接二個低聚核苷酸的連接反應(yīng)，檢測目標(biāo)基因或單核苷酸多態(tài)性的方法。上述連接反應(yīng)大致分為使用連接酶(Ligase)的方法和不使用酶而使用特殊低聚核苷酸的方法。使用連接酶(Ligase)的方法中包括一般基因操作中使用的T4DNA連接酶或LCR(Ligasechainreaction)法中使用的耐熱性DNA連接酶(ThermusthermophilusDNAligase)(USP5792607和USP5494810)。另外，不使用酶的自動連接反應(yīng)(Autoligationreaction)法(YanzhengXuandEricT.Kool.(1999)NucleicAcidsRes.，27.875-881)，是預(yù)先使硫代磷酸(phosphorothioate)結(jié)合在相鄰的二個低聚核苷酸的3’末端，并使碘代胸腺嘧啶核甙(iodothymidine)結(jié)合在5’末端，進(jìn)行5’-橋連硫代磷酸連接(5’-bridgingphosphorothioatelinkage)，從而連接二個低聚核苷酸的方法。如上所述，連接二個低聚核苷酸的方法有各種各樣的方法，但用于檢測連接后的低聚核苷酸的方法如LCRTM所代表的那樣，通過特殊的裝置僅僅捕獲連接的低聚核苷酸，如果不通過采用洗滌的B/F分離操作除去多余的低聚核苷酸，則不能進(jìn)行基因檢測。另外，通過分離猝滅劑使能夠通過猝滅劑抑制熒光的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光的方法中，包括TaqManPCR法和轉(zhuǎn)化法，TaqmanPCR法是通過利用TaqDNA聚合酶的5’核酸酶活性，切斷結(jié)合有熒光物質(zhì)的探針，分離猝滅劑使之發(fā)出熒光的方法，另外，轉(zhuǎn)化法是通過使用具有識別DNA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行切割的特殊內(nèi)切核酸酶活性的酶(cleavase)，切斷結(jié)合有熒光物質(zhì)的探針，分離猝滅劑使之發(fā)出熒光的方法，兩種方法均為需要特殊酶的方法。另一方面，本發(fā)明人發(fā)明了不使用酶或分支DNA但能夠有效進(jìn)行探針聚合的劃時代的方法，即PALSAR法，并已經(jīng)提出申請(參見USP6261846、特開2000-201687號以及特愿2000-98797號)。
發(fā)明內(nèi)容鑒于上述已有技術(shù)的現(xiàn)狀，本發(fā)明人為了創(chuàng)造出采用上述PALSAR法的新型基因檢測方法，反復(fù)悉心研究后發(fā)現(xiàn)如下述試驗例1所示，不切斷圖25所示PALSAR法中使用的成對探針與目標(biāo)基因互補(bǔ)的區(qū)域時，如圖27中箭頭所示，依賴于雜交反應(yīng)溫度形成聚合物，但是另一方面，切斷圖26所示PALSAR法中使用的成對探針與目標(biāo)基因互補(bǔ)的區(qū)域時，如圖28所示在任意的雜交反應(yīng)溫度下均不會形成聚合物。發(fā)現(xiàn)通過利用這種PALSAR法中使用的成對探針的性質(zhì)，不用分離與目標(biāo)基因連接的低聚核苷酸和未反應(yīng)的多余的低聚核苷酸，僅在目標(biāo)基因存在的場合就可以獲得形成聚合物的探針，能夠簡單地檢測出基因，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明的目的在于提供一種基因的檢測方法，通過利用PALSAR法，不需要捕獲連接的低聚核苷酸和洗滌多余的低聚核苷酸的操作，能夠通過聚合物的形成檢測基因，另外通過在PALSAR法中使用的成對探針的5’末端標(biāo)記熒光物質(zhì)，并使猝滅劑結(jié)合在3’末端，不需要特殊的酶，采用PALSAR法形成雙鏈聚合物時，能夠根據(jù)熒光由于猝滅劑消失來檢測基因。為了解決上述課題，本發(fā)明的基因檢測方法的第1種方式是一種采用通過使用復(fù)數(shù)對由n(n≥3)個互補(bǔ)堿基序列區(qū)域構(gòu)成的成對探針，使之雜交達(dá)到相互交錯的狀態(tài)，從而形成雙鏈聚合物的探針聚合物制備方法的基因檢測方法，其特征在于，使上述成對的探針中任意一個探針的一個以上互補(bǔ)區(qū)域成為具有與目標(biāo)基因的一部分互補(bǔ)的堿基序列的區(qū)域，預(yù)先切斷上述成對探針與目標(biāo)基因互補(bǔ)區(qū)域的單側(cè)或兩側(cè)的一個部位或數(shù)個部位，通過控制溫度，使之進(jìn)行雜交反應(yīng)、連接反應(yīng)和解離反應(yīng)，使上述切斷的探針連接，形成完全探針，通過上述探針聚合物的制備方法形成雙鏈聚合物，檢測出上述目標(biāo)基因。而且，具體而言，具有與目標(biāo)基因互補(bǔ)的區(qū)域并切斷了這一部位的探針，在存在目標(biāo)基因時，與目標(biāo)基因雜交后，通過連接反應(yīng)連接，之后通過熱使雙鏈解離。其次，尚未切斷的探針與目標(biāo)基因或連接的探針進(jìn)行雜交后，通過連接反應(yīng)進(jìn)行連接，通過熱使雙鏈解離。通過控制溫度，反復(fù)進(jìn)行上述雜交反應(yīng)→連接反應(yīng)→解離反應(yīng)，使探針連接，形成完全探針。連接的探針通過PALSAR法形成雙鏈聚合物。不存在目標(biāo)基因時，切斷的探針不連接，切斷的探針不形成聚合物。因此，根據(jù)聚合物的形成，能夠檢測出目標(biāo)基因。優(yōu)選采用DNA連接酶、耐熱性DNA連接酶或不使用酶的自動連接法進(jìn)行上述連接反應(yīng)。上述目標(biāo)基因可以使用單鏈DNA或RNA。上述目標(biāo)基因可以使用雙鏈DNA或RNA。優(yōu)選設(shè)計成上述預(yù)選切斷的探針部分與單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms以下稱為SNPs)互補(bǔ)。上述方法中，最好使用控制反應(yīng)溫度的儀器。優(yōu)選使猝滅劑(Quencher使熒光消失的物質(zhì))和熒光物質(zhì)(Fluorophore)結(jié)合在上述使用的成對探針的單側(cè)或兩側(cè)的末端，通過熒光的消失確認(rèn)形成的雙鏈聚合物。圖1是表示通過1個部位被切斷的PALSAR法中使用的成對探針的連接反應(yīng)檢測單鏈目標(biāo)基因的一個實例的示意圖，(a)表示單鏈目標(biāo)基因，(b)表示具有與目標(biāo)基因的Y區(qū)域互補(bǔ)的區(qū)域的一對探針，而且(c)表示將與目標(biāo)基因互補(bǔ)的區(qū)域切斷1處后的一對探針。圖2是表示通過1個部位被切斷的PALSAR法中使用的成對探針的連接反應(yīng)檢測單鏈目標(biāo)基因的一個實例的示意圖，(d)表示與目標(biāo)基因互補(bǔ)的Y區(qū)域被切斷1處后的探針，(e)表示單鏈目標(biāo)基因，(f)表示切斷的探針與目標(biāo)基因的雜交反應(yīng)，而且(g)表示切斷的探針的連接反應(yīng)。圖3是表示通過1個部位被切斷的PALSAR法中使用的成對探針的連接反應(yīng)檢測單鏈目標(biāo)基因的一個實例的示意圖，(h)表示連接的探針，(i)表示成對的HCP的另一個探針，(j)表示復(fù)數(shù)對連接的成對探針，而且(k)表示根據(jù)PALSAR法的原理形成聚合物。圖4是表示通過1個部位被切斷的PALSAR法中使用的成對探針的連接反應(yīng)檢測雙鏈目標(biāo)基因的一個實例的示意圖，(a)表示雙鏈目標(biāo)基因，(b)表示具有與雙鏈目標(biāo)基因的Y區(qū)域和Y’區(qū)域互補(bǔ)的區(qū)域的一對探針，而且(c)表示將與雙鏈目標(biāo)基因互補(bǔ)的區(qū)域切斷1處后的一對探針。圖5是表示通過1個部位被切斷的PALSAR法中使用的成對探針的連接反應(yīng)檢測雙鏈目標(biāo)基因的一個實例的示意圖，(d)表示與目標(biāo)基因互補(bǔ)的Y區(qū)域和Y’區(qū)域被切斷1處后的探針，(e)表示雙鏈解離的目標(biāo)基因，(f)表示切斷的探針與解離的目標(biāo)基因的雜交反應(yīng)，而且(g)表示切斷的探針的連接反應(yīng)。圖6是表示通過1個部位被切斷的PALSAR法中使用的成對探針的連接反應(yīng)檢測雙鏈目標(biāo)基因的一個實例的示意圖，(h)表示連接的探針，(i)表示切斷的探針，而且(j)表示連接的探針與切斷的探針的雜交反應(yīng)。圖7是表示通過1個部位被切斷的PALSAR法中使用的成對探針的連接反應(yīng)檢測雙鏈目標(biāo)基因的一個實例的示意圖，(k)表示復(fù)數(shù)對連接的成對探針，而且(l)表示根據(jù)PALSAR法的原理形成聚合物。圖8是表示通過3個部位被切斷的PALSAR法中使用的成對探針的連接反應(yīng)檢測雙鏈目標(biāo)基因的一個實例的示意圖，(a)表示雙鏈目標(biāo)基因，(b)表示具有與雙鏈目標(biāo)基因上的X區(qū)域和X’區(qū)域、Y區(qū)域和Y’區(qū)域、Z區(qū)域和Z’區(qū)域互補(bǔ)的區(qū)域的一對探針，而且(c)表示將與目標(biāo)基因互補(bǔ)的3個區(qū)域分別切斷1處(共計3處)后的一對探針。圖9是表示通過3個部位被切斷的PALSAR法中使用的成對探針的連接反應(yīng)檢測雙鏈目標(biāo)基因的一個實例的示意圖，(d)表示目標(biāo)基因的Y區(qū)域與切斷的探針的Y’區(qū)域的雜交反應(yīng)，(e)表示目標(biāo)基因的X區(qū)域與切斷的探針的X’區(qū)域的雜交反應(yīng)，而且(f)表示目標(biāo)基因的Z區(qū)域與切斷的探針的Z’區(qū)域的雜交反應(yīng)。圖10是表示通過3個部位被切斷的PALSAR法中使用的成對探針的連接反應(yīng)檢測雙鏈目標(biāo)基因的一個實例的示意圖，(g)表示連接的一對探針，(h)表示切斷的探針，(i)表示連接的探針的Z區(qū)域與切斷的探針的Z’區(qū)域以及連接的探針的X’區(qū)域與切斷的探針的X區(qū)域的雜交反應(yīng)，(j)表示連接的探針的Y區(qū)域與切斷的探針的Y’區(qū)域的雜交反應(yīng)，以及連接的探針的Y’區(qū)域與切斷的探針的Y區(qū)域的雜交反應(yīng)，(k)表示連接的探針的X區(qū)域與切斷的探針的X’區(qū)域的雜交反應(yīng)，以及連接的探針的Z’區(qū)域與切斷的探針的Z區(qū)域的雜交反應(yīng)。圖11是表示通過3個部位被切斷的PALSAR法中使用的成對探針的連接反應(yīng)檢測雙鏈目標(biāo)基因的一個實例的示意圖，(l)表示復(fù)數(shù)對連接的成對探針，而且(m)表示根據(jù)PALSAR法的原理形成聚合物。圖12是表示通過1個部位被切斷的PALSAR法中使用的成對探針的連接反應(yīng)檢測SNPs的一個實例的示意圖，(a)表示具有與包含SNPs的目標(biāo)基因互補(bǔ)的區(qū)域(Y區(qū)域)，并將這一區(qū)域切斷1處后的一對探針，(b1)表示使包含SNPs的目標(biāo)基因的SNPs與切斷了1處的探針的連接部分完全一致(Completematch)進(jìn)行雜交時的雜交反應(yīng)和連接反應(yīng)，而且(b2)表示包含SNPs的目標(biāo)基因的SNPs與切斷了1處的探針的連接部分不匹配(Mismatch)時的雜交反應(yīng)和連接反應(yīng)。圖13是表示通過1個部位被切斷的PALSAR法中使用的成對探針的連接反應(yīng)檢測SNPs的一個實例的示意圖，(c)表示與連接反應(yīng)無關(guān)的探針通過堿性磷酸酶脫磷酸化，(d)表示連接的探針，(e)表示一對HCP中未切斷的另一個探針，而且(f)表示根據(jù)PALSAR法的原理形成聚合物。圖14是表示Sephide公司的I-CORETM(SmartCyclerTM)的原理的說明圖，(a)表示反復(fù)通過側(cè)面大致呈五角形狀的容器以及側(cè)壁冷卻和加熱，另外(b)表示確認(rèn)有無熒光物質(zhì)存在的方法。圖15是表示使用Sephide公司的I-CORETM(SmartCyclerTM)通過1個部位被切斷的PALSAR法中使用的成對探針的連接反應(yīng)檢測雙鏈目標(biāo)基因時的示意圖，(a)表示雙鏈目標(biāo)基因，(b)表示將具有與雙鏈目標(biāo)基因的Y區(qū)域和Y’區(qū)域互補(bǔ)的區(qū)域的一對探針的互補(bǔ)區(qū)域切斷1處后的探針，而且(c)表示使用Sephide公司的I-CORETM(SmartCyclerTM)的連接反應(yīng)。圖16是表示使用Sephide公司的I-CORETM(SmartCyclerTM)通過1個部位被切斷的PALSAR法中使用的成對探針的連接反應(yīng)檢測雙鏈目標(biāo)基因時的示意圖，(d)表示雙鏈目標(biāo)基因，(e)表示雙鏈解離后的目標(biāo)基因，(f)表示目標(biāo)基因與切斷的探針的雜交反應(yīng)，而且(g)表示切斷的探針的連接反應(yīng)。圖17是表示使用Sephide公司的I-CORETM(SmartCyclerTM)通過1個部位被切斷的PALSAR法中使用的成對探針的連接反應(yīng)檢測雙鏈目標(biāo)基因時的示意圖，(h)表示連接的一對探針，(i)表示切斷的一對探針，而且(j)表示連接的探針與切斷的探針的雜交反應(yīng)。圖18是表示使用Sephide公司的I-CORETM(SmartCyclerTM)通過1個部位被切斷的PALSAR法中使用的成對探針的連接反應(yīng)檢測雙鏈目標(biāo)基因時的示意圖，(k)表示復(fù)數(shù)對連接的成對探針，而且(l)表示根據(jù)PALSAR法的原理形成聚合物。圖19是表示使用Sephide公司的I-CORETM(SmartCyclerTM)通過1個部位被切斷的PALSAR法中使用的成對探針的連接反應(yīng)檢測雙鏈目標(biāo)基因時的示意圖，(m)表示根據(jù)PALSAR法的原理形成的聚合物，而且(n)表示使用Sephide公司的I-CORETM(SmartCyclerTM)通過熒光檢測聚合物的方法。圖20是通過分子標(biāo)記(MolecularBeacons)檢測按PALSAR法形成的聚合物時(不一致)的示意圖，(a)表示將PALSAR法中使用的探針與目標(biāo)基因互補(bǔ)的區(qū)域(Y區(qū)域)切斷后的一對HCP，而且(b)表示在HCP的5’末端標(biāo)記熒光物質(zhì)，并使猝滅劑結(jié)合在3’末端的一對切斷的探針。圖21是通過分子標(biāo)記檢測按PALSAR法形成的聚合物時(完全一致)的示意圖，(a)表示將PALSAR法中使用的探針與目標(biāo)基因互補(bǔ)的區(qū)域(Y區(qū)域)切斷后的一對HCP，而且(b)表示在HCP的5’末端標(biāo)記熒光物質(zhì)，并使猝滅劑結(jié)合在3’末端的一對切斷的探針。圖22是通過分子標(biāo)記檢測按PALSAR法形成的聚合物時(完全一致)的示意圖，(c)表示通過連接反應(yīng)連接的一對探針，而且(d)表示根據(jù)PALSAR法的原理形成的聚合物引起的熒光消失。圖23是表示實施例1、比較例1、比較例2、比較例4和比較例5的結(jié)果的照片，(a)表示PAGE的結(jié)果，而且(b)表示瓊脂糖凝膠電泳法的結(jié)果。圖24是表示實施例2～實施例4以及比較例3～比較例5的結(jié)果的照片，(a)表示PAGE的結(jié)果，而且(b)表示瓊脂糖凝膠電泳法的結(jié)果。圖25是表示試驗例1中所使用的未將PALSAR法中使用的成對探針與目標(biāo)基因互補(bǔ)的區(qū)域切斷時的DNA探針的示意圖。圖26是表示試驗例1中所使用的將PALSAR法中使用的成對探針與目標(biāo)基因互補(bǔ)的區(qū)域切斷時的DNA探針的示意圖。圖27是表示未將PALSAR法中使用的成對探針與目標(biāo)基因互補(bǔ)的區(qū)域切斷時的試驗例1的結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳法照片。圖28是表示將PALSAR法中使用的成對探針與目標(biāo)基因互補(bǔ)的區(qū)域切斷時的試驗例1的結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳法照片。具體實施例方式以下結(jié)合本發(fā)明的實施方式，但是這些實施方式是示例性的，當(dāng)然只要不脫離本發(fā)明的技術(shù)思想，能夠進(jìn)行各種變形。另外，以下所示的實施方式中使用的連接反應(yīng)并不限定于使用連接酶(Ligase)的方法和不使用酶而使用特殊低聚核苷酸的方法中的任意一種。圖1～圖3是表示通過1個部位被切斷的PALSAR法中使用的成對探針的連接反應(yīng)檢測單鏈目標(biāo)基因的一個實例的示意圖。如圖1(a)(b)所示，由單鏈目標(biāo)基因制作具有與目標(biāo)基因互補(bǔ)的區(qū)域(Y’區(qū)域)的HCP及其對的HCP〔圖1(b)〕，如圖1(c)所示，預(yù)先將具有與目標(biāo)基因的Y區(qū)域互補(bǔ)的區(qū)域的探針〔圖1(b)〕的Y’區(qū)域的一處切斷。切斷的探針〔圖2(d)〕如圖2(f)所示，與目標(biāo)基因雜交后，如圖2(g)所示，通過連接反應(yīng)連接。其次，該連接的探針〔圖3(h)〕和切斷的探針〔圖2(d)〕通過將溫度控制在94℃～25℃的范圍內(nèi)反復(fù)進(jìn)行解離、雜交和連接反應(yīng)后〔圖2(f)、圖2(g)、圖3(h)〕，連接的探針〔圖3(h)〕與另外加入的對的另一個HCP〔圖3(i)(j)〕反應(yīng)，如圖3(k)所示，根據(jù)PALSAR法的原理形成聚合物。這里形成的聚合物能夠通過一般的瓊脂糖凝膠電泳法或下述檢測方法(圖20～圖22)簡單地確認(rèn)。另外，也可以使用同時在互補(bǔ)區(qū)域?qū)⒊蓪μ结樓袛嗟奶结?。圖4～圖7是表示通過1個部位被切斷的PALSAR法中使用的成對探針的連接反應(yīng)檢測雙鏈目標(biāo)基因的一個實例的示意圖。如圖4(a)(b)所示，由雙鏈目標(biāo)基因制作具有與目標(biāo)基因互補(bǔ)的區(qū)域的一對HCP，如圖4(c)所示，預(yù)先將具有與圖4(a)所示雙鏈目標(biāo)基因上的Y區(qū)域和Y’區(qū)域互補(bǔ)的區(qū)域的探針〔圖4(b)〕的Y’區(qū)域和Y區(qū)域的一處切斷。切斷的探針〔圖5(d)〕如圖5(f)所示與雙鏈解離的目標(biāo)基因〔圖5(e)〕雜交后，如圖5(g)所示，通過連接反應(yīng)連接。其次，該連接的探針〔圖6(h)〕和圖6(i)的切斷的探針雜交后，如圖6(j)所示，通過連接反應(yīng)連接。連接的的探針〔圖6(h)〕和切斷的探針〔圖5(d)〕通過將溫度控制在94℃～25℃的范圍內(nèi)反復(fù)進(jìn)行解離、雜交和連接反應(yīng)后〔圖6(j)、圖7(k)〕，如圖7(l)所示，根據(jù)PALSAR法的原理形成聚合物。這里形成的聚合物能夠通過一般的瓊脂糖凝膠電泳法或下述檢測方法(圖20～圖22)簡單地確認(rèn)。圖8～圖11是表示通過3個部位被切斷的PALSAR法中使用的成對探針的連接反應(yīng)檢測雙鏈目標(biāo)基因的一個實例的示意圖。如圖8(a)(b)所示，由雙鏈目標(biāo)基因制作具有與目標(biāo)基因3處互補(bǔ)的區(qū)域的一對HCP，如圖8(c)所示，預(yù)先分別將具有與圖8(a)所示雙鏈目標(biāo)基因上的X區(qū)域和X’區(qū)域、Y區(qū)域和Y’區(qū)域、Z區(qū)域和Z’區(qū)域互補(bǔ)的區(qū)域的探針〔圖8(b)〕的各區(qū)域的一處(共計3處)切斷。切斷的探針〔圖8(c)〕如圖9(d)(e)(f)所示，與解離的目標(biāo)基因雜交后，通過連接反應(yīng)連接。其次，該連接的探針〔圖10(g)〕和預(yù)先將3處切斷的探針〔圖10(h)〕通過將溫度控制在94℃～25℃的范圍內(nèi)反復(fù)進(jìn)行解離、雜交和連接反應(yīng)后〔圖10(i)(j)(k)、圖11(1)〕，如圖11(m)所示，根據(jù)PALSAR法的原理形成聚合物。這里形成的聚合物能夠通過一般的瓊脂糖凝膠電泳法或下述檢測方法(圖20～圖22)簡單地確認(rèn)。圖12～圖13是表示通過1個部位被切斷的PALSAR法中使用的成對探針的連接反應(yīng)檢測SNPs的一個實例的示意圖。圖12(a)表示將PALSAR法中使用的一對探針中與包含SNPs的目標(biāo)基因互補(bǔ)的區(qū)域(Y)切斷1處后的探針。如圖12(b1)所示，使包含SNPs的目標(biāo)基因的SNPs與切斷了1處的探針的連接部分完全一致(Completematch)進(jìn)行雜交時，切斷的探針通過連接反應(yīng)連接，而包含SNPs的目標(biāo)基因的SNPs與切斷了1處的探針的連接部分不匹配(Mismatch)時，即使進(jìn)行雜交反應(yīng)，也不能進(jìn)行連接反應(yīng)，因此探針仍然斷開〔圖12(b2)〕。之后，與連接反應(yīng)無關(guān)的探針如圖13(c)所示通過堿性磷酸酶進(jìn)行脫磷酸化，能夠形成對連接反應(yīng)不能應(yīng)答的形態(tài)。連接的探針〔圖13(d)〕與另外加入的對的另一個HCP〔圖13(e)〕反應(yīng)，如圖13(f)所示，根據(jù)PALSAR法的原理形成聚合物。這里形成的聚合物能夠通過一般的瓊脂糖凝膠電泳法或下述檢測方法(圖20～圖22)簡單地確認(rèn)。圖14是表示本發(fā)明方法中優(yōu)選使用的控制反應(yīng)溫度的儀器的說明圖。該圖表示Sephide公司的I-CORETM(SmartCyclerTM)，該反應(yīng)溫度控制儀器具有側(cè)面大致呈五角形狀的容器主體，該容器主體具備具有高熱傳導(dǎo)性的一對側(cè)壁以及互相傾斜接合的傾斜底板。因此，如圖14(a)所示，能夠通過側(cè)壁反復(fù)進(jìn)行冷卻和加熱。另外，如圖14(b)所示，為了確認(rèn)有無熒光物質(zhì)的存在，能夠通過由一側(cè)的傾斜底板投射激發(fā)光，由另一側(cè)的傾斜底板觀察發(fā)光狀態(tài)進(jìn)行。圖15～圖19是表示使用Sephide公司的I-CORETM(SmartCyclerTM)通過上述1個部位被切斷的PALSAR法中使用的成對探針的連接反應(yīng)檢測雙鏈目標(biāo)基因時的示意圖。向圖15(c)的反應(yīng)池中加入目標(biāo)基因〔圖15(a)〕和1處被切斷的PALSAR法中使用的成對探針〔圖15(b)〕。只有在能夠控制溫度的反應(yīng)池中存在檢測的目標(biāo)基因〔圖16(d)〕時，解離的目標(biāo)基因〔圖16(e)〕和切斷的聚合物發(fā)生雜交反應(yīng)〔圖16(f)〕，探針通過連接反應(yīng)連接〔圖16(g)〕。連接的探針〔圖17(h)〕和切斷的探針〔圖17(i)〕通過將溫度控制在94℃～25℃的范圍內(nèi)反復(fù)進(jìn)行解離、雜交和連接反應(yīng)后〔圖17(j)、圖18(k)〕，如圖18(l)所示，根據(jù)PALSAR法的原理形成聚合物。形成的聚合物〔圖19(m)〕可以通過添加插入到低聚核苷酸的雙鏈中發(fā)出熒光的色素，使用Sephide公司的I-CORETM(SmartCyclerTM)，觀察熒光的發(fā)光狀態(tài)進(jìn)行檢測〔圖19(n)〕。這里形成的聚合物能夠通過一般的瓊脂糖凝膠電泳法或下述檢測方法(圖20～圖22)簡單地確認(rèn)。圖20～圖22是通過分子標(biāo)記(MolecularBeacons)檢測按PALSAR法形成的聚合物時的示意圖。它是將圖20(a)和圖21(a)所示的PALSAR法中使用的探針與目標(biāo)基因互補(bǔ)的區(qū)域(Y區(qū)域和Y’區(qū)域)切斷，在其HCP的5’末端標(biāo)記熒光物質(zhì)，并使猝滅劑結(jié)合在3’末端〔圖20(b)、圖21(b)〕，從而與目標(biāo)基因互補(bǔ)的區(qū)域(Y區(qū)域和Y’區(qū)域)不匹配時〔圖20(b)〕，不能通過PALSAR法形成聚合物，保持發(fā)出熒光的狀態(tài)，而與目標(biāo)基因互補(bǔ)的區(qū)域(Y區(qū)域和Y’區(qū)域)完全一致時〔圖21(b)〕，能夠通過連接反應(yīng)獲得HCP〔圖22(c)〕，如圖22(d)所示，通過PALSAR法形成聚合物，而且5’末端和3’末端鄰接，從而根據(jù)熒光由于猝滅劑消失能夠檢測基因的方法。另外，也可以采用用增強(qiáng)子代替猝滅劑的方法。另外，圖中，前端銳角部分表示3’末端，起始端黑圓圈表示5’末端。實施例以下結(jié)合本發(fā)明的實施例進(jìn)行說明，但是本發(fā)明當(dāng)然并不限于這些實施例。實施例1～4和比較例1～5中使用的DNA探針和目標(biāo)基因a)探針1(INT-1)(5’-X’-Y’-Z’-3’)5’-ACGCAGAAAGCGTCTAGC-CGCTCACAGTTAACGTGAGATTTCAC-GTACTGCCTGATAGGGTG-3’b)探針2(INT-2)(5’-X-Y-Z-3’)5’-GCTAGACGCTTTCTGCGT-GTGAAATCTCACGTTAACTGTGAGCG-CACCCTATCAGGCAGTAC-3’c)探針3(INT-1-A)(5’-X’-Y’(切斷)-3’)5’-ACGCAGAAAGCGTCTAGC-CGCTCACAGTTAA-3’d)探針4(INT-1-B)(5’-Y’(切斷)-Z’-3’)5’(磷酸化)-CGTGAGATTTCAC-GTACTGCCTGATAGGGTG-3’e)探針5(INT-2-C)(5’-X-Y(切斷)-3’)5’-GCTAGACGCTTTCTGCGT-GTGAAATCTCACG-3’f)探針6(INT-2-D)(5’-Y(切斷)-Z-3’)5’(磷酸化)-TTAACTGTGAGCG-CACCCTATCAGGCAGTAC-3’g)目標(biāo)基因(INT-①)(5’--Y--3’)5’-GGTTTGTCGCGTTGTTC-GTGAAATCTCACGTTAACTGTGAGCG-TGCGGGCGATACGGG-3’h)目標(biāo)基因(INT-①S1)(5’--Y--3’)5’-GGTTTGTCGCGTTGTTC-GTGAAATCTCACGCTTAACTGTGAGCG-TGCGGGCGATACGGG-3’i)目標(biāo)基因(INT-①S2)(5’--Y--3’)5’-GGTTTGTCGCGTTGTTC-GTGAAATCTCACGGTTAACTGTGAGCG-TGCGGGCGATACGGG-3’j)目標(biāo)基因(INT-①R)(5’--Y’--3’)5’-CCCGTATCGCCCGCA-CGCTCACAGTTAAGCCGTGAGATTTCAC-GAACAACGCGACAAACC-3’(實施例1、比較例1和比較例2)HCP中的連接反應(yīng)(目標(biāo)基因雙鏈)1、目的嘗試通過1處被切斷的HCP的連接反應(yīng)檢測雙鏈目標(biāo)基因。2、材料1)關(guān)于目標(biāo)基因，制作源于Mycobacteriumintracellulare16srRNA基因的60個堿基的合成低聚核苷酸(以下稱為INT-①)以及與目標(biāo)基因INT-①互補(bǔ)序列的合成低聚核苷酸(以下稱為INT-①R)，使兩者形成雙鏈，進(jìn)行以下的實驗。2)制作由具有與目標(biāo)基因INT-①的Y區(qū)域互補(bǔ)的區(qū)域的探針1(以下稱為INT-1)以及各區(qū)域與該探針1互補(bǔ)的探針2(以下稱為INT-2)構(gòu)成的成對HCP。并且準(zhǔn)備分別將其1處切斷后得到的探針(以下分別稱為INT-1-A、INT-1-B、INT-2-C、INT-2-D)。3)作為耐熱性DNA連接酶，使用將TscDNAligase，thermostable(RocheMolecularBiochemicals)添加到培養(yǎng)緩沖液(Incubationbuffer)中的物質(zhì)。4)作為緩沖液使用20×SSC(3M-NaCl，0.3M-C6H5O7Na3·2H2O，pH7.0)。3、方法a)反應(yīng)液的配制將分別配制成100pmol/μL的INT-1-A、INT-1-B、INT-2-C以及INT-2-D0.5μL分別加入0.2mL的滅菌后的微管中，加入連接酶1μL、培養(yǎng)緩沖液2μL，加入配制成100pmol/μL的由INT-①和INT-①R構(gòu)成雙鏈的目標(biāo)基因1μL，通過DW2制成20μL的反應(yīng)液(實施例1)。另外，作為對照，制作相對于上述反應(yīng)液未添加目標(biāo)基因的反應(yīng)液(比較例1)，以及連接酶和目標(biāo)基因均未添加的反應(yīng)液(比較例2)。b)連接反應(yīng)之后，使用熱循環(huán)裝置(Parkinermar公司制)，使上述各種反應(yīng)液在94℃下反應(yīng)2分鐘，然后循環(huán)進(jìn)行〔94℃/30秒→50℃/2分鐘→55℃/5分鐘〕的反應(yīng)30次，使之分別進(jìn)行連接反應(yīng)。之后，通過99℃/10分鐘，進(jìn)行用于使連接酶惰化的反應(yīng)。c)通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)確認(rèn)連接在連接反應(yīng)之后，對各反應(yīng)液進(jìn)行PAGE。使用反應(yīng)液5μL，用16％PAGE(30％Acrylamide/BisSolution29∶1，10％AmmoniumPersulfate，TEMED，Bio-RadLaboratories，10％TBE，H2O)在90分鐘、130V的條件下進(jìn)行電泳。作為對照使用INT-①、INT-①R、以及INT-①和INT-①R構(gòu)成的雙鏈目標(biāo)基因。作為分子尺寸標(biāo)記使用10bpDNA梯(DNALadder，GIBCOBRL公司制)。電泳90分鐘后，用溴化乙錠(EtBrSolution，株式會社NIPPONGEN制)將凝膠染色。d)聚合物形成反應(yīng)分別向0.2mL微管中的上述連接反應(yīng)后的反應(yīng)液10μL中加入20×SSC10μL，使用熱循環(huán)裝置(Parkinermar公司制)，使之在66℃反應(yīng)16小時。e)通過瓊脂糖凝膠電泳法確認(rèn)聚合物對于聚合物形成反應(yīng)后的反應(yīng)液8μL，用2％Nusieve3∶1瓊脂糖凝膠(BioWhittakerMolecularApplications公司制)在100V電泳30分鐘。作為分子尺寸標(biāo)記使用1kbDNA延伸梯(DNAExtensionLadder，GIBCOBRL公司制)。瓊脂糖凝膠電泳后，用溴化乙錠將凝膠染色。4、結(jié)果結(jié)果如圖23(a)和(b)所示。根據(jù)圖23(a)的用于確認(rèn)連接的PAGE的結(jié)果，添加目標(biāo)基因時(實施例1、泳道1)檢測出對照(比較例2、泳道2)中未見到的用箭頭表示的較高位置的條帶。認(rèn)為該條帶是連接反應(yīng)的結(jié)果得到的已連接探針的條帶。另外，在圖中沒有顯示，比較例1也得到了與比較例2同樣的結(jié)果。如圖23(b)所示，通過瓊脂糖凝膠電泳法確認(rèn)聚合物形成時，僅在添加了目標(biāo)基因的場合(實施例1、泳道1)中能夠觀察到聚合物的形成，比較例1(泳道2)和比較例2(泳道3)中觀察不到聚合物。上述內(nèi)容表明，切斷的HCP通過雙鏈目標(biāo)基因連接，連接的HCP形成聚合物，從而能夠檢測出雙鏈目標(biāo)基因。(實施例2～4以及比較例3)通過HCP的連接反應(yīng)檢測SNPs1、目的討論通過1處被切斷的HCP的連接反應(yīng)是否能夠檢測單鏈目標(biāo)基因和SNPs。2、材料除實施例1中使用的探針、連接酶、連接緩沖液、緩沖液以及目標(biāo)基因INT-①之外，重新制作INT-①的Y區(qū)域僅1個堿基不同的目標(biāo)基因INT-①S1(與切斷HCP的Y區(qū)域5’末端互補(bǔ)的部分的1個堿基不同)和INT-①S2(與切斷HCP的Y區(qū)域3’末端互補(bǔ)的部分的1個堿基不同)。3、方法a)反應(yīng)液的配制將分別配制成100pmol/μL的INT-1-A、INT-1-B、INT-2-C以及INT-2-D0.5μL分別加入0.2mL的滅菌后的微管中，加入連接酶1μL、培養(yǎng)緩沖液2μL，加入配制成100pmol/μL的目標(biāo)基因0.5μL，通過DW2分別制成20μL的反應(yīng)液。作為目標(biāo)基因，在實施例2中選擇INT-①，在實施例3中選擇INT-①S1，在實施例4中選擇INT-①S2。另外，作為對照，制作相對于上述反應(yīng)液未添加目標(biāo)基因(INT-①、INT-①S1和INT-①S2)的反應(yīng)液(比較例3)。b)連接反應(yīng)之后，使用熱循環(huán)裝置(Parkinermar公司制)，對于上述各種反應(yīng)液，循環(huán)進(jìn)行〔94℃/30秒→50℃/90秒→55℃/3分鐘〕的反應(yīng)30次，使之分別進(jìn)行連接反應(yīng)。之后，通過99℃/10分鐘，進(jìn)行用于使連接酶惰化的反應(yīng)。c)通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)的確認(rèn)采用與實施例1同樣的步驟和條件，對于各反應(yīng)液通過PAGE進(jìn)行確認(rèn)。作為對照，使用INT-①、INT-①S1和INT-①S2。作為分子尺寸標(biāo)記，除10bpDNA梯以外，還使用50bpDNA梯(DNALadder，GIBCOBRL公司制)。d)聚合物形成反應(yīng)采用與實施例1同樣的步驟和條件，對上述連接反應(yīng)后的反應(yīng)液進(jìn)行聚合物形成反應(yīng)。e)通過瓊脂糖凝膠電泳法確認(rèn)聚合物采用與實施例1同樣的步驟和條件，對于聚合物形成反應(yīng)后的反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。4、結(jié)果結(jié)果如圖24(a)和(b)所示。根據(jù)圖24(a)的用于確認(rèn)連接的PAGE的結(jié)果，添加了INT-①的實例(實施例2、泳道1)中，由于目標(biāo)基因和切斷探針的Y區(qū)域的序列完全匹配，因此進(jìn)行連接反應(yīng)，在高于約350bp的位置可見用箭頭表示的濃條帶。與此相對，添加了SNPs即INT-①S1(實施例3、泳道2)和INT-①S2(實施例4、泳道3)的實例中，由于目標(biāo)基因和切斷探針的Y區(qū)域的序列有1個堿基不同(不匹配)，因此不發(fā)生連接反應(yīng)，確認(rèn)沒有泳道1中看見的條帶。另一方面，僅有連接酶而未添加目標(biāo)基因的泳道3(比較例3)中，僅可以確認(rèn)切斷的4根探針連結(jié)成環(huán)狀得到的濃條帶。如圖24(b)所示，通過瓊脂糖凝膠電泳法確認(rèn)聚合物形成時，也只有添加了目標(biāo)基因和切斷探針的Y區(qū)域的序列完全匹配的INT-①的實例(實施例2、泳道1)形成了聚合物，實施例3(泳道2)和實施例4(泳道3)沒有觀察到聚合物。另外，圖中沒有顯示，比較例3也與實施例3和4同樣沒有觀察到聚合物。以上內(nèi)容表明，切斷的HCP通過序列完全匹配的單鏈目標(biāo)基因連接，連接的HCP形成聚合物，從而能夠檢測出單鏈目標(biāo)基因。而且，SNPs的場合，切斷的HCP不能連接，也不能形成聚合物，因此能夠通過1處被切斷的HCP的連接反應(yīng)檢測出SNPs。(比較例4和比較例5)1、目的比較切斷HCP的場合和不切斷HCP的場合下通過PALSAR法形成聚合物的反應(yīng)。2、材料1)作為比較例4的探針，使用INT-1和INT-2，作為比較例5的探針，使用INT-1-A、INT-1-B、INT-2-C和INT-2-D。2)作為緩沖液使用20×SSC(3M-NaCl，0.3M-C6H5O7Na3·2H2O，pH7.0)。3、方法a)反應(yīng)液的配制分別在0.2mL的滅菌后的微管中加入20×SSC20μL、分別配制成100pmol/μL的探針0.5μL，通過DW2分別制成20μL的反應(yīng)液。作為探針，在比較例4中選擇INT-1和INT-2，在比較例5中選擇INT-1-A、INT-1-B、INT-2-C和INT-2-D。b)聚合物形成反應(yīng)使用熱循環(huán)裝置(Parkinermar公司制)，使各反應(yīng)液在94℃下反應(yīng)30秒后，在66反應(yīng)16小時。c)通過瓊脂糖凝膠電泳法確認(rèn)聚合物采用與實施例1同樣的步驟和條件，對反應(yīng)后的反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。4、結(jié)果如圖23(b)和圖24(b)所示，使用未切斷的探針的比較例4中，觀察到聚合物的形成，使用切斷的探針的比較例5中，沒有觀察到聚合物的形成。(試驗例1)通過PALSAR法使用HCP的形成聚合物的反應(yīng)1、目的比較在將PALSAR法中使用的成對探針切斷1處的場合以及未切斷的場合溫度變化時的聚合物的形成反應(yīng)。2、材料1)聚合時使用以下的成對HCP(探針7、探針8)以及將探針7切斷1處得到的探針，即探針9、探針10。a)探針7(HCP-1)5’-GAATAAGTCATAGCTCATA-AAGGACTGGTCGCTCGAC-ATCGTCCTAGGGAGATTCG-3’b)探針8(HCP-2)5’-TATGAGCTATGACTTATTC-GTCGAGCGACCAGTCCTT-CGAATCTCCCTAGGACGAT-3’c)探針9(HCP-1-1)5’-GAATAAGTCATAGCTCATA-AAGGACTGG-3’d)探針10(HCP-1-2)5’(磷酸化)-TCGCTCGAC-ATCGTCCTAGGGAGATTCG-3’2)作為緩沖液使用20×SSC(3M-NaCl，0.3M-C6H5O7Na3·2H2O，pH7.0)。3、方法分別向0.2mL的滅菌后的微管中加入配制成1013拷貝/μL的探針7和探針8，或者探針9、探針10和探針85μL，加入40μL的20×SSC，加蓋后，在94℃下煮沸30秒，在52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、70℃下分別加熱30分鐘。加熱后，使用0.5％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，通過溴化乙錠染色，確認(rèn)聚合的效果。4、結(jié)果圖27和圖28用照片表示使用0.5％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行100V、30分鐘的電泳得到的試驗例1的結(jié)果。圖27是表示未將PALSAR法中使用的成對探針切斷時的結(jié)果的照片。如圖27中箭頭所示，未切斷的HCP依賴于雜交溫度形成雙鏈聚合物。圖28是表示將PALSAR法中使用的成對探針切斷1處時的結(jié)果的照片。如圖28所示，在任何雜交溫度下均不形成聚合物。工業(yè)實用性如上所述，按照本發(fā)明的基因檢測方法，通過利用PALSAR法，不需要捕獲連接的低聚核苷酸和洗滌多余的低聚核苷酸的操作，能夠通過聚合物的形成檢測基因，另外通過在PALSAR法中使用的成對探針的5’末端標(biāo)記熒光物質(zhì)，并使猝滅劑結(jié)合在3’末端，從而不需要特殊的酶，采用PALSAR法形成雙鏈聚合物時，能夠根據(jù)熒光由于猝滅劑消失來檢測基因，產(chǎn)生了顯著的效果。序列表<110>SankoJunyakuCo.，Ltd.<120>Genedetectingmethod<130>76014-PCT-CN<140>PCT/JP01/07020<141>2001-08-14<150>JP2000-261687<151>2000-08-30<160>14<210>1<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探針1<400>1acgcagaaagcgtctagccgctcacagttaagccgtgagatttcacgtactgcctgatag60ggtg64<210>2<211>64<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探針2<400>2gctagacgctttctgcgtgtgaaatctcacggcttaactgtgagcgcaccctatcaggca60gtac64<210>3<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探針3<400>3acgcagaaagcgtctagccgctcacagttaag32<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><221>miscfeature<222>(1)<223>連接在5′末端的磷酸<220><223>人工序列的描述探針4<400>4ccgtgagatttcacgtactgcctgatagggtg32<210>5<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探針5<400>5gctagacgctttctgcgtgtgaaatctcacgg32<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><221>miscfeature<222>(1)<223>連接在5′末端的磷酸<220><223>人工序列的描述探針6<400>6cttaactgtgagcgcaccctatcaggcagtac32<210>7<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述目標(biāo)基因-1<400>7ggtttgtcgcgttgttcgtgaaatctcacggcttaactgtgagcgtgcgggcgatacggg60<210>8<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述目標(biāo)基因-S1<400>8ggtttgtcgcgttgttcgtgaaatctcacgtcttaactgtgagcgtgcgggcgatacggg60<210>9<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述目標(biāo)基因-S2<400>9ggtttgtcgcgttgttcgtgaaatctcacgggttaactgtgagcgtgcgggcgatacggg60<210>10<211>54<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述目標(biāo)基因-1R<400>10cccgtatcgcccgcacgctcacagttaagccgtgagatttcacgaacaacgcgacaaacc60<210>11<211>54<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探針7<400>11gaataagtcatagctcataaaggactggtcgctcgacatcgtcctagggagattcg56<210>12<211>56<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探針8<400>12tatgagctatgacttattcgtcgagcgaccagtccttcgaatctccctaggacgat56<210>13<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探針9<400>13gaataagtcatagctcataaaggactgg28<210>14<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><221>miscfeature<222>(1)<223>連接在5′末端的磷酸<220><223>人工序列的描述探針10<400>14tcgctcgacatcgtcctagggagattcg28權(quán)利要求1.一種基因檢測方法，它是采用通過使用復(fù)數(shù)對由n(n≥3)個互補(bǔ)堿基序列區(qū)域構(gòu)成的成對探針，使之雜交達(dá)到相互交錯的狀態(tài)，從而形成雙鏈聚合物的探針聚合物制備方法的基因檢測方法，其特征在于，使上述成對的探針中任意一個探針的一個以上的互補(bǔ)區(qū)域成為具有與目標(biāo)基因的一部分互補(bǔ)的堿基序列的區(qū)域，預(yù)先切斷上述成對探針與目標(biāo)基因互補(bǔ)區(qū)域的單側(cè)或兩側(cè)的一個部位或數(shù)個部位，通過控制溫度，使之進(jìn)行雜交反應(yīng)、連接反應(yīng)和解離反應(yīng)，使上述切斷的探針連接，形成完全探針，通過上述探針聚合物的制備方法形成雙鏈聚合物，檢測出上述目標(biāo)基因。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，采用DNA連接酶、耐熱性DNA連接酶或不使用酶的自動連接法進(jìn)行上述連接反應(yīng)。3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，上述目標(biāo)基因使用單鏈DNA或RNA。4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，上述目標(biāo)基因使用雙鏈DNA或RNA。5.如權(quán)利要求1～4中任意一項所述的方法，其特征在于，設(shè)計成上述預(yù)選切斷的探針部分與SNPs互補(bǔ)。6.如權(quán)利要求1～5中任意一項所述的方法，其特征在于，使用控制反應(yīng)溫度的儀器。7.如權(quán)利要求1～6中任意一項所述的方法，其特征在于，使猝滅劑和熒光物質(zhì)結(jié)合在上述使用的成對探針的單側(cè)或兩側(cè)的末端，通過熒光的消失確認(rèn)形成的雙鏈聚合物。全文摘要本發(fā)明提供一種基因的檢測方法,通過利用PALSAR法,不需要捕獲連接的低聚核苷酸和洗滌多余的低聚核苷酸的操作,能夠通過聚合物的形成檢測基因。使用復(fù)數(shù)對由n(n≥3)個互補(bǔ)堿基序列區(qū)域構(gòu)成的成對探針,預(yù)先切斷上述成對探針與目標(biāo)基因互補(bǔ)區(qū)域的單側(cè)或兩側(cè)的一個部位或數(shù)個部位,通過控制溫度,使之進(jìn)行雜交反應(yīng)、連接反應(yīng)和解離反應(yīng),使上述切斷的探針連接,形成完全探針,使用探針聚合物的制備方法形成雙鏈聚合物,檢測出上述目標(biāo)基因。文檔編號C12Q1/70GK1388831SQ01802491公開日2003年1月1日申請日期2001年8月14日優(yōu)先權(quán)日2000年8月30日發(fā)明者薄井貢,三塚真理,波木井千雅子申請人:三光純藥株式會社