適配體Macugen?_(見例如美國專利No. 6, 168, 778、美國專利 No. 6, 051，698、美國專利No. 6, 426, 335和美國專利No. 6, 962, 784,其均以全文援引加入 本文）用于治療黃斑變性，其由于對VEGF的特異性親和性而發(fā)揮功能。其它適配體已經(jīng) 被研宄和/或在用作治療劑的開發(fā)中。未選擇具有慢解離速率性質(zhì)的適配體也已經(jīng)用于 許多診斷和成像應(yīng)用（見例如美國專利No. 5, 843, 653、美國專利No. 5, 789, 163、美國專利 No. 5, 853, 984、美國專利No. 5, 874, 218、美國專利No. 6, 261，783、美國專利No. 5, 989, 823、 美國專利No. 6, 177, 555、美國專利No. 6, 531，286,其均以全文援引加入本文）、高通量篩 選（見例如美國專利No. 6, 329, 145、美國專利No. 6, 670, 132、美國專利No. 7, 258, 980， 其均以全文援引加入本文）以及PCR試劑盒（見例如美國專利No. 6, 183, 967、美國專利 No. 6, 020, 130、美國專利No. 5, 763, 173、美國專利No. 5, 874, 557、美國專利No. 5, 693, 502， 其均以全文援引加入本文）。本發(fā)明的慢解離速率適配體可用于任何診斷、治療、成像或者 使用抗體、適配體和配體結(jié)合對的任何其它應(yīng)用中。
[0022] 另一方面，本發(fā)明提供了通過本發(fā)明所述改良的方法鑒別的適配體和光適配體、 包括這種適配體和光適配體的診斷試劑盒以及這種適配體和光適配體的治療和診斷應(yīng)用。 使用所述方法鑒別的新的慢解離速率適配體和光適配體可用于多種測定中，包括使用平面 陣列、珠及其它類型固體支持物的測定。在各種情形中可以使用的測定包括生命科學(xué)研宄 應(yīng)用、臨床診斷應(yīng)用（例如疾病的診斷檢驗，或者預(yù)防性保健的"健康"檢測），ALONA和UPS 測定以及體內(nèi)成像應(yīng)用。對于一些應(yīng)用，可以使用應(yīng)用所述適配體和光適配體的多元測定。
[0023] 在一些實施方案中，本文描述的慢解離速率適配體（或者光適配體）可用作CAT 掃描及其它成像應(yīng)用的靜脈內(nèi)或者口服造影劑。CAT掃描用于診斷肌和骨病癥、定位血凝 塊、檢測內(nèi)部出血、監(jiān)測疾病如癌癥等。所述慢解離速率適配體可以用CAT掃描可檢測成分 如碘、鋇或者gastrograffin標記。除了具有可檢測成分之外，所述適配體可以被設(shè)計為使 所述成分定向于特異組織或者希望的靶。所述適配體可以濃縮或定位可檢測成分并因此通 過增加可利用的信號而改良信噪比。由于適配體的解離速率可以足夠低，因此可以增加掃 描的持續(xù)時間，且可以改良掃描的信噪比。在這些成像應(yīng)用中適配體對靶的特異性也可以 改良信噪比。
[0024] 在一個實施方案中，所述慢解離速率適配體用反磁性或者順磁性材料標記。在這 個實施方案中，標記的適配體可用于改良磁共振成像（MRI)的性能。MRI特別適于成像小 的、選擇性的具有高水含量的區(qū)域和組織或者適于監(jiān)測血流。慢解離速率適配體的特異性 可改良MRI試劑定位于希望的組織切片。相似地，慢解離速率適配體可用如氟、碳11、氧15 或者氮13等材料修飾以用于PET掃描中。在另一個實施方案中，適配體可以用可用于紅外 成像的IR活性材料標記。也預(yù)期可以標記慢解離速率適配體以與其它成像技術(shù)一起使用。
[0025] 在一個實施方案中，慢解離速率適配體可用作非常靈敏的和特異的試劑，以摻入 各種體外診斷方法或試劑盒中。在一些實施方案中，慢解離速率適配體在許多感染性或者 其它類型疾病檢測方法中用作抗體的替代物，其中感興趣的靶的適配體包括可檢測材料和 固定或捕獲成分任一或二者。在這些實施方案中，在將試劑盒中的適配體與臨床樣本混合 后，可以利用各種測定形式。在一個實施方案中，適配體也包括可檢測標記如熒光團。在其 它實施方案中，測定形式可包括熒光猝滅、雜交方法、流式細胞術(shù)、質(zhì)譜分析、抑制或競爭方 法、酶聯(lián)寡核苷酸測定、SPR、倏逝波法（evanescentwavemethod)等。在一些實施方案中， 適配體在試劑盒中在溶液中提供。在其它實施方案中，試劑盒中適配體固定于固體支持物 上，與檢測樣本的測定聯(lián)合使用。在多個實施方案中，所述固體支持物被設(shè)計為檢測一或多 個感興趣的靶。在其它實施方案中，試劑盒可進一步包括提取感興趣的靶的試劑、擴增適配 體的試劑、洗滌試劑、檢測試劑等。
[0026] 在另一個實施方案中，慢解離速率適配體可用于治療性成像研宄中。在新的治 療化合物的開發(fā)期間，通常難以評估化合物的某些特征，如生物分布、洗脫率（washout rate)、生物利用率、體內(nèi)藥物/靶相互作用等。在許多情況中，如果使用合適的可檢測材料 修飾所述治療化合物，則可以使用成像研宄評估所有這些特征。盡管直接修飾治療化合物 通常抑制其與其靶的相互作用能力并因此降低效力，但是適配體的小規(guī)格和可定制的特異 性使其潛在地非常適于與治療化合物（例如抗體或其它基于蛋白質(zhì)的治療劑）反應(yīng)，同時 使得對于化合物的治療效力的任何不希望的作用最小化。為了評估這種特征如生物分布和 洗脫率，可以使適配體/治療復(fù)合物保持一段時間。這些類型的研宄在治療化合物是慢解 離速率適配體的情況中可簡化。在多個實施方案中，治療性、成像和診斷應(yīng)用中使用的適配 體可包括各種修飾如2'氟及其它修飾以在暴露于檢測樣品中可能存在的各種成分或者體 內(nèi)如核酸酶及其它樣品或者體液成分時增加適配體的穩(wěn)定性。
[0027] 附圖簡述
[0028] 圖1A例證了舉例的SELEX方法，圖1B例證了舉例的SELEX方法，其包括摻入慢解 離速率富集過程的步驟。
[0029]圖2例證了本發(fā)明中使用的代表性適配體模板、引物和互補寡核苷酸序列。所述 寡核苷酸通過標準固相合成技術(shù)制備。B=dT-生物素。
[0030] 圖3例證了如實施例2所述不用（圖3A)和用（圖3B)慢解離速率富集過程選擇 的親和性適配體的解離速率常數(shù)的柱狀圖。
[0031] 圖4A和B示出用于如實施例2所述制備候選混合物或者進行選擇過程中的各個 步驟的寡核苷酸。所述寡核苷酸通過標準固相合成技術(shù)制備。BrdU(5-溴-dUTP)、蒽醌（AQ) 和補骨脂素（Psor)生色團以亞磷酰胺形式購買，并在合成期間加入正向引物的5'末端。 4_疊氮-2-硝基-苯胺（ANA)制備成對-硝基-苯基碳酸鹽/酯衍生物且在合成后與5' 己胺亞磷酰胺偶聯(lián)。這個實施例中使用兩個候選混合物序列，稱作1和2。B=dT-生物素。 (圖4A)模板1僅與含有5' -BrdU、AQ和ANA的候選混合物一起使用；（圖4B)模板2僅與 含有5' -Psor的用于實施例2的候選混合物一起使用。
[0032] 圖5例證了與如圖4A和4B例證的正向引物的5'末端偶聯(lián)的生色團的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0033] 圖6例證了使用實施例3所述的5'-固定光SELEX對TMP-35'ANA/BndU富集的 文庫的交聯(lián)活性的PAGE分析。凝膠例證了游離適配體（Af)、分子內(nèi)交聯(lián)的適配體（Af*)以 及交聯(lián)的蛋白質(zhì)：適配體復(fù)合物（P:A)的分離。
[0034] 圖7是已經(jīng)鑒別了適配體的500個以上的靶的圖表。許多這些適配體已被設(shè)計為 與其各自靶具有慢解離速率。
[0035] 圖8A-8D例證了含有多種不同及任選功能性包括固定標簽、標記、光交聯(lián)部分、間 隔序列和可釋放部分的適配體構(gòu)建體。
[0036] 圖9A-9F例證了包括可裂解或可釋放元件、標簽（例如生物素）、間隔序列和標記 (例如Cy3)的適配體構(gòu)建體的實例。
[0037] 圖10例證了本發(fā)明所述的適配體和引物構(gòu)建體。Cy3表示花菁3染料，PC表示 光可裂解接頭，ANA表示光反應(yīng)性交聯(lián)基團，（AB)2表示由dA殘基分開的一對生物素殘基， (T)8表示聚dT接頭。引物構(gòu)建體與適配體構(gòu)建體的完整3'固定區(qū)互補。
[0038] 圖11A-11C例證了慢解離速率適配體對傳統(tǒng)適配體與三個不同靶的劑量應(yīng)答曲 線。
[0039] 圖12A和12B例證了慢解離速率適配體的性能曲線，其中靶是肽。
[0040] 圖13例證了許多慢解離速率適配體的測量的解鏈溫度相對于預(yù)測的解鏈溫度的 圖示。
[0041] 圖14描述了本發(fā)明中包括的核苷酸的堿基修飾。除了在核苷酸附著點與R基團 之間可以使用接頭（X)之外，還描述了可以使用的R基團。在各自R基團上還標出了不同 "R"基團的附著位置。
[0042] 圖15例證了用于確定凝血酶的含有C-5修飾嘧啶的慢解離速率適配體的結(jié)合常 數(shù)的圖示。
[0043] 發(fā)明詳述
[0044] 除非特別指出，則實施本發(fā)明應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)化學(xué)、微生物學(xué)、分 子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。這種技術(shù)在文獻中充分闡述。見例如Sambrook,etal.Molecular Cloning:ALaboratoryManual(CurrentEdition)；DNACloning:APractical Approach,vol.I&II(D.Glover,ed. ) ；01igonucleotideSynthesis(N.Gait,ed. ,Current Edition)；NucleicAcidHybridization(B.Hames&S.Higgins,eds. ,CurrentEdition)； TranscriptionandTranslation(B.Hames&S.Higgins,eds. ,CurrentEdition)。
[0045] 本說明書中引用的所有出版物、公開的專利文獻和專利申請均表示本發(fā)明所屬領(lǐng) 域技術(shù)人員知識水平。本文引用的所有出版物、公開的專利文件和專利申請均以如每篇出 版物、公開的專利文件或?qū)＠暾埻ㄟ^特異和單獨的援引加入形式相同的程度援引加入本 文。
[0046] 如在本說明書包括所附權(quán)利要求書中所用，除非特別指出，則單數(shù)形式"一個"、 "一種"、"所述……"包括復(fù)數(shù)引用，且可與"至少一個/種"及"一或多個/種"互換使用。 因此，"一種適配體"包括適配體混合物，"一種探針"包括探針混合物等。
[0047] 如本文所用，術(shù)語"大約"代表數(shù)值的非顯著修改或改變，從而數(shù)值涉及的項目的 基本功能不變。
[0048] 如本文所用，術(shù)語"包含"、"包括"、"