TGTACTCA ；
下游引物 M16-R (SEQ ID N0.29):TCGACGGTAGATAACC。
[0060]上游引物M17-F (SEQ ID N0.30):TCTGATAAATCGCCTTGT ；
下游引物 M17-R (SEQ ID N0.31):CGACGGTAGATAACCACAT。
[0061](2)通過大量的特異性和靈敏性檢測，最終選取了相對較好的7對引物，即MC-F和MC-R、2047-F 和 2047-R、M6_F 和 M6_R、M7_F 和 M7_R、M13_F 和 M13_R、M16_F 和 M16_R、M17_F和 M17-R。
[0062]2、PCR擴增方法的建立 (I)樣品總DNA的提取
采用QIAGEN公司生產(chǎn)的植物DNA快捷迷你型抽提試劑盒(DNeasy Plant mini kit試劑盒)抽提樣品DNA，步驟如下(按照說明書進行):
取20g樣品放入研缽中，液氮充分研磨，將研磨后的粉末收集至1.5mL的離心管中。加Λ 400 μ L裂解緩沖液API和4 μ L Rnase Α，渦旋混勻(400 μ L裂解緩沖液APl和4 μ LRnase A勿在使用前混合)；混勻后的溶液，65°C，孵育10 min (期間上下顛倒試管2~3次)；加130 μ L緩沖液ΑΡ2，混合后冰浴5 min ;然后14，000 rpm,離心5 min ;吸取上清于過濾柱(QIAshredder spin column)中的收集管，14，OOOrpm,離心2min ;將離心管中上清液移至新管(勿攪動出現(xiàn)的殘渣)，加入1.5倍體積的AP3/E，移液器混合；將650 μ L混合液移至吸附柱(DNeasy Mini spin column)中，4200 rpm,離心I min ;剩下的液體重復(fù)此步驟；將吸附柱放入新收集管中，加入500 μ L緩沖液AW, 4200 rpm,離心I min ;棄上清；再加入500μ L緩沖液AW，14000 rpm，離心2 min(保證收集管不接觸到底部上清);移收集管至1.5 mL或2 mL離心管中；加入40 μ L緩沖液AE洗脫,室溫放置5 min ;4200 rpm離心I min ;重復(fù)上一步(即加入40 μ L緩沖液AE洗脫，室溫放置5 min, 4200 rpm離心I min);將提取好的總DNA置于_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0063](2) PCR擴增方法
以樣品總DNA為模板，用上述引物進行PCR擴增。
[0064]所述PCR反應(yīng)體系(總體積20 μ L): 2 X Taq Master Mix (反應(yīng)緩沖液)10 μ L
10 μ M上游引物0.5 yL
10 μ M下游引物0.5 yL
模板 DNAI μ L ；
ddH20補至 20 μ L0
[0065]其中，2XTaq Master Mix (反應(yīng)緩沖液)的組分為Taq DNA聚合酶，160 mMTris-HCl, 40 mM(NH4)2SO4, 3.0 mM MgCl2,400 μ M dNTP。
[0066]PCR 反應(yīng)程序為:94°C 5 min ；94°C 30 s，53°C 45 s，72°C 90 s，32 個循環(huán)；72°C10 min。
[0067](3)結(jié)果判斷
將PCR反應(yīng)結(jié)束后的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)是否擴增到目的條帶(DNA片段)判定樣品是否感染了微孢子蟲。當能特異性地擴增出目的條帶，即可判斷該樣品感染了微孢子蟲。
[0068]實施例3引物特異性檢測
1、分別以家蠶微孢子蟲、桑螟微孢子蟲、桑尺蠖微孢子蟲、斜紋夜蛾微孢子蟲、小菜蛾微孢子蟲、菜粉蝶微孢子蟲、柞蠶微孢子蟲、浙江小孢子微孢子蟲、玉米螟微孢子蟲或山東大孢子微孢子蟲的DNA為模板，利用實施例2的PCR方法，對實施例2篩選的7對引物的檢測特異性進行研究。
[0069]2、結(jié)果顯示，只有 MC-F 和 MC-R、2047-F 和 2047-R、M5-F 和 M5-R、M6-F 和 M6-R、M7-F和M7-R這五對引物能夠檢測到的微孢子蟲種類較多，分別能檢測到7種、6種、5種、5種、4種微孢子蟲。具體如附圖3?6所示。
[0070]其中，MC-F和MC-R所檢測的微孢子蟲種類最多，能同時檢測到家蠶微孢子蟲、桑螟微孢子蟲、桑尺蠖微孢子蟲、斜紋夜蛾微孢子蟲、小菜蛾微孢子蟲、菜粉蝶微孢子蟲和柞蠶微孢子蟲7種常見的桑園主要微孢子蟲，檢測通用性最好，在實際樣品的微孢子蟲檢測中有很好的應(yīng)用前景。
[0071]實施例4引物靈敏性檢測
1、分別以家蠶微孢子蟲、桑螟微孢子蟲、桑尺蠖微孢子蟲、斜紋夜蛾微孢子蟲、小菜蛾微孢子蟲、菜粉蝶微孢子蟲、柞蠶微孢子蟲、浙江小孢子微孢子蟲、玉米螟微孢子蟲或山東大孢子微孢子蟲的DNA為模板，利用實施例2的PCR方法，對實施例2篩選的7對引物的檢測靈敏性進行研究。
[0072]2、檢測結(jié)果
(I)引物MC-F/MC-R對7種桑園主要微孢子蟲的檢測靈敏度結(jié)果分別如附圖7?13所示。其中，對桑尺蠖微孢子蟲、斜紋夜蛾微孢子蟲和柞蠶微孢子蟲的檢測靈敏度最高，分別可達到1.64X 10_4、1.21X 10_4、2.87X 10_4 μ g/mL，對家蠶微孢子蟲的檢測靈敏度亦可達到1.85Χ1(Γ2μ g/mL。
[0073](2 )引物2047-F/2047-R對家蠶微孢子蟲和菜粉蝶微孢子蟲的檢測靈敏度最好，分別達到l.SSXlO'l.SXKTig/mL，對斜紋夜蛾微孢子蟲和小菜蛾微孢子蟲的檢測靈敏度均為1.21 μ g/mL，對桑螟微孢子蟲和桑尺蠖微孢子蟲的檢測靈敏度分別為18、16.4μ g/mL，具體分別如附圖14?18所示。
[0074](3)引物M5-F/M5-R對家蠶微孢子蟲的檢測靈敏度最好，為18.5 μ g/mL。
[0075]引物M6-F/M6-R對菜粉蝶微孢子蟲、家蠶微孢子蟲、斜紋夜蛾微孢子蟲、桑尺蠖微孢子蟲和小菜蛾微孢子蟲的檢測靈敏度分別為1.21X10^,1.85X10^,1.21X10^,1.64X10'12.1 μ g/mL ο
[0076]引物M7-F/M7-R對柞蠶微孢子蟲、家蠶微孢子蟲、斜紋夜蛾微孢子蟲、桑尺蠖微孢子蟲的檢測靈敏度分別為2.87X 10_2、1.85、1.21、16.4 μ g/mL。
[0077](4)另外，引物 M13-F/M13-R、M16-F/M16-R、M17-F/M17-R 等不僅檢測通用性差，檢測靈敏性也很差，能檢測到的微孢子蟲DNA的濃度基本都大于1.0X ΙΟ—1 μ g/mL。
[0078]綜上所述，MC-F和MC-R所檢測的微孢子蟲種類最多，能同時檢測到家蠶微孢子蟲、桑螟微孢子蟲、桑尺蠖微孢子蟲、斜紋夜蛾微孢子蟲、小菜蛾微孢子蟲、菜粉蝶微孢子蟲和柞蠶微孢子蟲7種常見的桑園主要微孢子蟲，檢測通用性最好，而且檢測靈敏性也最好，在實際樣品的微孢子蟲檢測中有很好的應(yīng)用前景。
【主權(quán)項】
1.家蠶微孢子蟲Met-AP2基因，其特征在于，其DNA核苷酸序列如SEQID N0.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述家蠶微孢子蟲Met-AP2基因，其特征在于，其cDNA核苷酸序列如 SEQ ID N0.2 所示。
3.權(quán)利要求1所述家蠶微孢子蟲Met-AP2基因編碼的具有生物活性的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
4.權(quán)利要求1所述家蠶微孢子蟲Met-AP2基因在微孢子蟲檢測方面的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于，以Met-AP2基因為靶基因設(shè)計引物進行PCR擴增，根據(jù)擴增DNA片段的結(jié)果判定樣品中是否含有微孢子蟲。
6.一組微孢子蟲通用檢測引物，其特征在于，包括上游引物MC-F和下游引物MC-R，上游引物MC-F的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，下游引物MC-R的核苷酸序列如SEQ IDN0.5所示。
7.權(quán)利要求6所述微孢子蟲通用檢測引物在微孢子蟲檢測方面的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求4、5或7所述應(yīng)用，其特征在于，所述微孢子蟲為家蠶微孢子蟲、桑螟微孢子蟲、桑尺蠖微孢子蟲、斜紋夜蛾微孢子蟲、小菜蛾微孢子蟲、菜粉蝶微孢子蟲或柞蠶微孢子蟲中的一種或幾種。
9.一種微孢子蟲通用檢測試劑盒，其特征在于，包括上游引物MC-F和下游引物MC-R，上游引物MC-F的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，下游引物MC-R的核苷酸序列如SEQ IDN0.5所示。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的使用方法如下: 以樣品DNA或cDNA為模板，利用引物MC-F和MC-R進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，根據(jù)擴增產(chǎn)物判定結(jié)果，當瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)特異性1077bp的DNA片段產(chǎn)物，即該樣品感染了微孢子蟲。
【專利摘要】本發(fā)明公開了家蠶微孢子蟲Met-AP2基因及其在微孢子蟲檢測方面的應(yīng)用，以及一組微孢子蟲通用檢測引物及試劑盒。所述通用檢測引物包括上游引物MC-F和下游引物MC-R，上游引物MC-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物MC-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。該檢測引物以基因Met-AP2為靶基因，能夠同時應(yīng)用于多種微孢子蟲的檢測，檢測結(jié)果可靠、易于操作、靈敏度高，尤其是對于實際檢驗檢疫工作中，對于樣品中各種微孢子蟲的早期檢測，具有重要的實際應(yīng)用意義。
【IPC分類】C12Q1-04, C07K14-44, C12N15-30, C12Q1-68
【公開號】CN104651375
【申請?zhí)枴緾N201510029801
【發(fā)明人】劉吉平, 楊思佳
【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2015年1月21日