V/V)，甘油5% (W/V)，其余為-巰基乙醇；
[0035] LB液體培養(yǎng)基：氯化鈉10g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/LpH值至 7. 4±0. 2 ;
[0036] LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基加入瓊脂糖至終濃度為15g/L;高壓滅菌后依次取 約10mL倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，冷卻后關(guān)蓋標(biāo)記保存；
[0037] 1000X氨節(jié)西林鈉溶液（Amp+):配制氨節(jié)西林鈉溶液100mg/mL，0. 22ym無(wú)菌過(guò) 濾器過(guò)濾，用時(shí)按1 :1000加入；
[0038]lmol/LIPTG:配制IPTG238. 3g/L，0. 22y無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾；
[0039]LB固體培養(yǎng)基（Amp+) :LB固體培養(yǎng)基，高壓滅菌后冷卻到40°C左右加入Amp+至 終濃度100yg/mL，依次取約10mL倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，冷卻后關(guān)蓋標(biāo)記保存；
[0040] 10mMPBS:取KH2P040. 2g，Na2HP04 ? 12H20 2. 9g，NaCl8. 0g，KC1 0? 2g，加水至 1000mL，此時(shí)pH值為 7. 4 ;
[0041] 20mMPB緩沖液：取KH2P040. 2g，Na2HP04 ? 12H20 2. 9g，KC1 0? 2g，加水至lOOOmL， 此時(shí)pH值為7. 0 ;
[0042] pH6. 0的疫苗稀釋液：由組氨酸、NaCl和泊洛沙姆188組成，將三組分共溶于水 即可；各組分的終濃度為組氨酸10mM，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 9%，泊洛沙姆188質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0? 01%〇
[0043] 實(shí)施例1表達(dá)A1S_0851蛋白的pGEX-6P-2-AlS_0851/XL-lblue重組工程菌的構(gòu) 建
[0044] 1、A1S_0851序列引物的設(shè)計(jì)與合成
[0045] 根據(jù)GeneBank收錄的鮑曼不動(dòng)桿菌的A1S_0851基因（GenbankID號(hào)：4916977) 信息，A1S_0851基因核苷酸序列全長(zhǎng)975bp，共324個(gè)氨基酸。使用SignalP4.lServer 進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，1-30個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。采用PrimerPremier5. 0軟件對(duì)去除信號(hào)肽的 保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物如下，通過(guò)該引物擴(kuò)增鮑曼不動(dòng)桿菌基因組，獲得A1S_0851基因長(zhǎng)度為 894bp，核苷酸序列見SEQIDNO. 1，蛋白為299個(gè)氨基酸，氨基酸序列見SEQIDNO. 2。
[0046] PCR克隆引物：
[0047]PA1S0851B1 :5'-cgcggatccgatattgactcagtccgtgcg-3'（SEQIDNO. 3);
[0048]PA1S0851N2 :5'_ttatgcggccgcttaaattgatgtcttttcggc_3'（SEQIDNO. 4)〇
[0049] 2、基因組DNA的提取
[0050] 挑取鮑曼不動(dòng)桿菌保種液，分別接種于無(wú)抗生素和含氨芐西林的LB平板中，37°C 培養(yǎng)12h，無(wú)抗生素的平板長(zhǎng)出大量菌落，含氨芐西林的平板無(wú)菌落長(zhǎng)出。挑取無(wú)抗性平板 上的單菌落接種于10mL的LB培養(yǎng)基中，并于37°C，80rpm振蕩培養(yǎng)12h，最后采用細(xì)菌基因 組提取試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書的說(shuō)明提取細(xì)菌基因組。
[0051] 3、PCR擴(kuò)增鮑曼不動(dòng)桿菌A1S_0851基因
[0052]PCR體系：模板為ATCC17978 基因組DNA2yL，引物PAlS0851Bl(10yM)lyL， PAlS0851N2(10yM)lyL，primeSTARHSDNA聚合酶 0.25yL，dNTP4yL，5XBuffer 10yL，滅菌雙蒸水31. 75yL，總體積50yL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性5min;94°C變 性10s;60°C退火，30s;72°C延伸1. 5min，30個(gè)循環(huán)；72°C完全延伸10min。反應(yīng)完畢后使用 1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1，PCR擴(kuò)增出大小約為900bp的基因片段，與 預(yù)期相符。
[0053] 4、凝膠回收A1S_0851PCR產(chǎn)物
[0054] 配制1 %的回收瓊脂糖凝膠：稱取l.Og瓊脂糖移入三角瓶中，加入IXTAE核酸 電泳緩沖溶液l〇〇mL，輕輕搖勻后放入微波爐中加熱；待瓊脂糖完全溶化后，加入核酸染料 EB8yL，輕輕搖勻，將溶液倒入制膠槽，用槍頭去掉氣泡，插上梳子，待膠凝固后即可上樣 電泳。
[0055] 目的基因上樣量50yL，120V電泳20min分離DNA片段。電泳完畢，紫外照射條件 下切下目的條帶并裝入1. 5mL離心管中。用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行DNA回收，操作步驟 按說(shuō)明書進(jìn)行，具體如下：
[0056] DNA回收：加入400yLPB溶液，于57°C孵育7min至膠完全融化，將DNA凝膠融 解物到吸附柱中，室溫l〇〇〇〇g離心lmin;棄濾液，將吸附柱放回收集管中加300yLPB溶 液到柱內(nèi)，室溫l〇〇〇〇g離心lmin;棄濾液，將吸附柱放回收集管中加入700yL無(wú)水乙醇稀 釋過(guò)的WashBuffer，室溫12000g離心lmin;棄濾液，再次加入700yL無(wú)水乙醇稀釋過(guò)的 WashBuffer，室溫12000g離心lmin;棄濾液，空管13000g離心2min;將吸附柱放入干凈的 1. 5mL離心管中，室溫放置5min，再加入30yL滅菌水，放置2min后13000g離心2min洗脫 DNA，收集洗脫液，置于-20°C保存。1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純化的A1S_0851PCR產(chǎn)物。
[0057] 5、pGEX-6p_2 質(zhì)粒的提取
[0058] 三線法將pGEX-6P-2/XLlblue大腸桿菌接種于AmpLB平板，置于37°C培養(yǎng)12h。 挑取平板上的單菌落接種于10mL含氨芐西林的LB培養(yǎng)液中，置于37°C，250rpm振蕩培養(yǎng) 8h。用EP管取菌液，1. 5mL/支，用于提取質(zhì)粒。用OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行pGEX-6p-2 質(zhì)粒提取，操作步驟按說(shuō)明書進(jìn)行，具體如下：
[0059] 質(zhì)粒提?。喝【?2000g離心2min，棄去上清液收集菌體，菌體中加入250yL Solution1(已加入RNaseA)并重懸，然后加入250yLSolutionII，顛倒混勾，然后加入 350yLSolutionIII，顛倒混勾，室溫放置5min，13000g離心10min;離心完畢后將上清液 轉(zhuǎn)入HiBindDNAMiniColumns收集管中，室溫10000g離心lmin;棄去收集管中濾液，加入 500yLBufferHB，室溫10000g離心lmin;棄濾液，加入700yL含乙醇的WashBuffer，室 溫13000g離心lmin;重復(fù)用含乙醇的WashBuffer洗滌；洗滌完畢后棄濾液，室溫13000g 離心2min。將柱子放入1. 5mL滅菌EP管中，65°C放置5min，待乙醇揮發(fā)完后加入80yL 65°C預(yù)熱的EB到柱內(nèi)濾膜上，室溫放置3min，13000g離心2min洗脫，收集洗脫液，-80°C保 存質(zhì)粒備用。1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的PGEX-6質(zhì)粒。
[0060] 6、重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及重組工程菌的篩選、鑒定
[0061] (1)雙酶切和回收：分別對(duì)pGEX-6P-2質(zhì)粒和A1S_0851PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行BamHI 和NotI雙酶切，酶切反應(yīng)體系為：BamHI2yL，NotI2yL，10XKBuffer2yL，0.1% (w/w)BSA4yL，質(zhì)?；騊CR純化產(chǎn)物30yL，總體積40yL;37°C條件下酶切3h，酶切后膠回 收PGEX-6P-2質(zhì)粒和A1S_0851的酶切產(chǎn)物。
[0062] (2)連接：回收后將PGEX-6P-2質(zhì)粒和A1S_0851的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接。連接反 應(yīng)體系為：SolutionI5yL，AlS_0851酶切回收產(chǎn)物4. 5yL，PGEX-6P-2酶切回收產(chǎn)物 0. 5yL，總體積10yL。將各組分混勻后于16°C條件下連接2h。
[0063] (3)轉(zhuǎn)化：取連接產(chǎn)物10yL加入到100yLXLl-blue感受態(tài)中，冰浴45min后， 42°C熱擊90s，然后再迅速冰浴2min;冰浴完畢后加入600uLLB空白培養(yǎng)基，混勻并置于 37°C，220rpm振蕩培養(yǎng)lh;培養(yǎng)完畢后于4000rpm離心5min.，棄去200yL上清液，重懸菌 體，并取200yL涂布于氨芐西林抗性LB平板上，將平板倒置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。
[0064] 感受態(tài)的制備化&(：12法）：在LB平板上用接種環(huán)挑取新復(fù)蘇的XLlblue單菌落， 接種于10mLLB液體培養(yǎng)基中，37°C，lOOrprn振蕩培養(yǎng)12h;取培養(yǎng)后的菌液0. 8mL加入到 50mLLB液體培養(yǎng)基中，于37°C，220rpm振蕩培養(yǎng)2-3h，測(cè)定0D600為0. 4~0. 5 ;將菌液冰 水浴10min后于4°C，1600g離心7min，棄去上清液收集細(xì)胞；向細(xì)胞中加入10mL，0.lmol/ L的CaCl2溶液，重懸細(xì)胞；4°C，1100g離心5min，棄去上清液收集細(xì)胞。再向細(xì)胞中加入 2mL，0.lmol/L的CaCl2溶液，重懸細(xì)胞，將制