白胨 12g/L，酵母粉 24g/L，甘油 5g/L，K2HP042. 31g/L，KH2P0416 . 43g/L，氨芐青霉素 0?lg/L， pH7. 0)，37°C培養(yǎng) 2h后用終濃度 0. 4mMIPTG誘導(dǎo) 34-36h。
[0038] 結(jié)果顯示，對照菌株B的發(fā)酵上清中ADI酶活為1. 53U/ml，破壁上清中ADI酶活為 8. 78U/ml，胞外酶活占總酶活的14. 8%。而經(jīng)過角質(zhì)酶基因序列優(yōu)化的重組菌A，其發(fā)酵上 清中ADI酶活為7. 69U/ml，破壁上清中ADI酶活為0. 77U/ml，胞外酶活占總酶活的90. 9 %。 說明經(jīng)角質(zhì)酶基因序列優(yōu)化能夠顯著提高重組菌株的ADI的胞外分泌表達(dá)量。
[0039]實施例3發(fā)酵條件對重組菌株表達(dá)ADI的影響
[0040] 以實施例2中含有SEQIDNO. 1所示序列的重組大腸桿菌為生產(chǎn)菌株，采用3L發(fā) 酵罐進(jìn)行發(fā)酵，并比較了不同發(fā)酵條件對菌株表達(dá)ADI的影響。
[0041] 不同誘導(dǎo)溫度對ADI表達(dá)量的影響：
[0042] 發(fā)酵培養(yǎng)基1.2L(工業(yè)級蛋白胨1.2g，工業(yè)級酵母粉2.4g，（NH4)2HP044. 8g， KH2P0416 . 24g，檸檬酸2. 04g，無水硫酸鎂0. 824g，甘油9. 6g，微量元素液12ml，pH7. 0)，接 種量10%，以35-38°C恒溫培養(yǎng)，溶氧控制在30%左右，流加氨水控制pH在6. 8-7. 0。0D6QQ 達(dá)到45-55時（約12-16h)，pH調(diào)至6. 5,以終濃度0?lg?I71 ?IT1恒速流加乳糖，終濃度 0. 04mMIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度分別采用37°C及30°C。ADI胞外酶活如圖1所示（時間 從接種發(fā)酵開始算起）。結(jié)果顯示：誘導(dǎo)溫度為30°C時，胞外酶活最高達(dá)101U?mL'胞外 分泌率高達(dá)95%。圖2為發(fā)酵上清的SDS-PAGE分析，可以看出隨著發(fā)酵時間的延長，ADI 胞外分泌量顯著增加。
[0043] 不同乳糖濃度對ADI表達(dá)量的影響：
[0044] 在28-32°C的誘導(dǎo)溫度下，其余發(fā)酵條件保持不變，以終濃度0. 05、0. 1、0. 2、 0. 5g七1七1恒速流加乳糖，ADI胞外酶活如圖3所示（時間從接種發(fā)酵開始算起）。結(jié)果顯 示：乳糖終濃度為0.05-0.lg.L-1 .h-1時，胞外酶活可達(dá)90U.H1L-1以上，最高達(dá)lOlU.mL-1， 胞外分泌率高達(dá)95%以上。
[0045] 實施例4重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)ADI
[0046] 以實施例2中含有SEQIDNO. 1所示序列的重組大腸桿菌為生產(chǎn)菌株，進(jìn)行發(fā)酵 培養(yǎng)。
[0047] 發(fā)酵培養(yǎng)的條件是：發(fā)酵罐裝液量為40%，重組大腸桿菌種子液接種量為8%， 在38°C恒溫培養(yǎng)，并控制溶氧35%、控制pH6. 8-7. 2,當(dāng)0D6QQ達(dá)到40左右時，將溫度調(diào)至 28°C，pH調(diào)至6. 3,以終濃度0. 05-0.lg?L-1 ?h-1流加乳糖，并添加終濃度為0. 02mMIPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)45_55h。
[0048] 發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為每L含有：蛋白胨0. 9g，酵母粉2.lg， (NH4)2HP043. 9g，KH2P0414g，檸檬酸 1. 5g，無水硫酸鎂 0? 7g，甘油 7. 5g，微量元素液 10. 5ml， pH7. 1 ;所述微量元素液的配方：以5MHC1為母液，F(xiàn)eS04 ? 7H20 9. 5-10. 5g?L-1， ZnS04 ? 7H20 2. 0-2. 5g?I71，CuS04 ? 5H20 0? 9-1.lg?I71，MnS04 ? 4H20 0? 45-0. 55g?I71， Na2B407 ? 10H20 0? 2-0. 25g?I71，CaCl2l. 9-2.lg?I71，（NH4)6M〇70240. 09-0.llg?I71 發(fā)酵得 到的ADI胞外產(chǎn)量為95-105U/mL。
[0049] 實施例5重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)ADI
[0050] 以實施例2中含有SEQIDNO. 1所示序列的重組大腸桿菌為生產(chǎn)菌株，進(jìn)行發(fā)酵 培養(yǎng)。
[0051] 發(fā)酵培養(yǎng)的條件是：發(fā)酵罐裝液量為70%，重組大腸桿菌種子液接種量為10%， 在35°C恒溫培養(yǎng)，并控制溶氧25%、控制pH6. 8-7. 2,當(dāng)0D6QQ達(dá)到60時，將溫度調(diào)至32°C， pH調(diào)至6. 7,以終濃度0. 05-0.lg?L-1 ?h-1恒速流加乳糖，并添加終濃度為0. 02-0. 05mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)45-55h。
[0052] 發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為每L含有：蛋白胨1.lg，酵母粉1. 9g， (NH4) 2HP044.lg，KH2P0413g，檸檬酸 2g，無水硫酸鎂 0? 6g，甘油 8. 5g，微量元素液 9. 5-10ml， pH6. 8-7. 1 ;所述微量元素液的配方：以5MHC1為母液，F(xiàn)eS04 ? 7H20 9. 5-10. 5g?r1， ZnS04 ? 7H20 2. 0-2. 5g?I71，CuS04 ? 5H20 0? 9-1.lg?I71，MnS04 ? 4H20 0? 45-0. 55g?I71， Na2B407 ? 10H20 0? 2-0. 25g?I71，CaCl2l. 9-2.lg?I71，（NH4)6M〇70240. 09-0.llg?I71 發(fā)酵得 到的ADI胞外產(chǎn)量為95-105U/mL。
[0053] 實施例6胞外ADI的酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用
[0054] 以實施例2中含有SEQIDNO. 1所示序列的重組大腸桿菌為生產(chǎn)菌株，在3L罐中 進(jìn)行發(fā)酵，對胞外ADI進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其最適溫度為37°C，最適pH為6. 0,在 37°C條件下半衰期為15h，在pH6. 5-7. 0之間穩(wěn)定性良好，與單獨表達(dá)ADI酶學(xué)性質(zhì)一致。
[0055] 利用得到的ADI制備L-瓜氨酸：當(dāng)?shù)孜風(fēng)-精氨酸鹽酸鹽濃度100_106g/l，反應(yīng)初 始pH6. 0左右，溫度35-38°C，加酶量22-25U/g底物，轉(zhuǎn)速100-200r/min，轉(zhuǎn)化時間2. 5h， L_瓜氨酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，與單獨表達(dá)ADI制備L-瓜氨酸無差異。
[0056] 以上結(jié)果說明，通過共表達(dá)T.fusca角質(zhì)酶，提高大腸桿菌細(xì)胞膜通透性，在不引 起細(xì)胞裂解的情況下實現(xiàn)ADI的胞外表達(dá)，并且與單獨表達(dá)在酶學(xué)性質(zhì)方面一致，利用其 制備L-瓜氨酸的轉(zhuǎn)化率也無影響。
[0057] 雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1. 一種精氨酸脫亞胺酶的胞外表達(dá)方法，其特征在于，是構(gòu)建能夠共表達(dá)核苷酸序列 如SEQIDNO. 1所示的角質(zhì)酶與氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示的精氨酸脫亞胺酶的重 組大腸桿菌，在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)后收集發(fā)酵上清液；所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件 是：發(fā)酵罐裝液量為40-70%，重組大腸桿菌種子液接種量為8-10%，在35-38°C恒溫培養(yǎng)， 并控制溶氧25-35 %、控制pH6. 8-7. 2，當(dāng)OD6tltl達(dá)到40-60時，將溫度調(diào)至28-32 °C，pH調(diào)至 6. 3-6. 7,以終濃度0. 05-0.Ig?L-1 ?h-1恒速流加乳糖，并添加終濃度為0. 02-0. 05mMIPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為每L含 有：蛋白胨〇? 9-1. lg，酵母粉I. 9-2. lg，（NH4)2HP043. 9-4. lg，KH2P0413-14g，檸檬酸I. 5-2g， 無水硫酸鎂〇. 6-0. 7g，甘油7. 5-8. 5g，微量元素液9. 5-10. 5ml，pH6. 8-7;所述微量元素 液的配方：以5M HCl為母液，F(xiàn)eSO4 ? 7H20 9. 5-10. 5g ? L' ZnSO4 ? 7H20 2. 0-2. 5g ? I71， CuSO4 ? 5H20 0? 9-1. Ig ? I71，MnSO4 ? 4H20 0? 45-0. 55g ? L' Na2B4O7 ? IOH2O 0? 2-0. 25g ? I71， CaCl2L 9-2. Ig ? I71，（MM)6Mo7O240.0 9-0.1 lg ? I71。
3. 根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述重組大腸桿菌的構(gòu)建方法是：將編碼 精氨酸脫亞胺酶的基因和編碼角質(zhì)酶的基因克隆到PETDuet-I上得到重組質(zhì)粒Tfu_0883/ ADI/pETDuet-1，然后將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌宿主，即得到重組大腸桿菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述宿主為E.coliBL21 (DE3)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基I. 2L中含有：工業(yè)級蛋 白胨I. 2g，工業(yè)級酵母粉2. 4g，（NH4)2HP044. 8g，KH2P0416 . 24g，檸檬酸2. 04g，無水硫酸鎂 0? 824g，甘油 9. 6g，微量元素液 12ml，pH7. 0。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述方法得到的精氨酸脫亞胺酶。
7. 權(quán)利要求6所述精氨酸脫亞胺酶在制備L-瓜氨酸方面的應(yīng)用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是將在底物濃度為100-106g/ L的L-精氨酸鹽酸鹽或L-精氨酸中，按每g底物添加22-25U的精氨酸脫亞胺酶，在初始 pH5. 9-6. 1，溫度 35-38°C，轉(zhuǎn)速 100_200r/min下進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種精氨酸脫亞胺酶的胞外表達(dá)方法及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明是將T.fusca角質(zhì)酶與惡臭假單胞菌ADI在大腸桿菌中共表達(dá)，通過控制發(fā)酵條件，在不引起細(xì)胞裂解的情況下成功實現(xiàn)ADI的胞外表達(dá)，采用分批補料的方式進(jìn)行3L罐發(fā)酵試驗，發(fā)酵培養(yǎng)66h，發(fā)酵上清ADI酶活為101U/mL，可達(dá)到總酶活的95％以上。利用3L罐胞外ADI制備L-瓜氨酸，可簡化后提取工藝，具有較高的學(xué)術(shù)意義和應(yīng)用價值。
【IPC分類】C12N9-80, C12P13-10, C12R1-19
【公開號】CN104694523
【申請?zhí)枴緾N201510124550
【發(fā)明人】吳敬, 宿玲恰, 馬越
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月21日