一種用于痰液核酸的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增添加劑及解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于痰液核酸的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增 添加劑及解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 體外核酸擴(kuò)增被廣泛用在研宄、醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，其中最為廣泛被研 宄和使用的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)。然而PCR反應(yīng)依賴于提高和降低反應(yīng)混合物的溫度 循環(huán)，需要配備專用的熱循環(huán)儀器才能進(jìn)行，并且擴(kuò)增時(shí)間長(zhǎng)，一般需要幾個(gè)小時(shí)，難以在 基層尤其是一些偏遠(yuǎn)地區(qū)或條件較差的實(shí)驗(yàn)室推廣使用。針對(duì)常規(guī)PCR反應(yīng)的不足，以核 酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)得到了迅猛的發(fā)展。多種機(jī)制的等溫技術(shù)完成了從實(shí)驗(yàn) 室到實(shí)際應(yīng)用的過渡，正逐步在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、法學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛運(yùn)用。特別是在臨 床和現(xiàn)場(chǎng)（point-of-care)快速診斷技術(shù)方面，核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)顯示了其突出的優(yōu) 越性。更為重要的是，核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)由于不需要溫度變化的時(shí)間且擺脫了對(duì)精良儀器 設(shè)備的依賴，使得我們對(duì)病原體的檢測(cè)診斷得以快速并高通量的實(shí)現(xiàn)。一個(gè)此類例子是新 英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司發(fā)明（專利號(hào)03824150)的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增（HDA)，該技術(shù) 的特點(diǎn)在于通過解旋酶打開雙鏈核酸，從而不需要加熱或熱循環(huán)，在恒定的溫度如55°C~ 70°C下即可進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，因此反應(yīng)可在常見的基礎(chǔ)裝置如水浴鍋中進(jìn)行，避免使 用昂貴的熱循環(huán)儀器，具有更高的靈活性。HDA也可使用序列特異性探針來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物， 實(shí)現(xiàn)多重實(shí)時(shí)定量的效果。
[0003] 體外擴(kuò)增技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用當(dāng)中常見抑制現(xiàn)象。采樣方法、樣本類型、提取試 劑和提取方法均會(huì)影響得到的DNA模板的質(zhì)量，導(dǎo)致不同程度的擴(kuò)增抑制。PCR反應(yīng) 中的抑制現(xiàn)象已經(jīng)過大量研宄，并積累了多種優(yōu)化手段（如MarkWilks(ed.)，PCR DetectionofMicrobialPathogens:SecondEdition,MethodsinMolecular Biology,vol. 943,Chapter2中的報(bào)道），而HDA技術(shù)由于反應(yīng)溫度溫和恒定，反應(yīng)體系中 關(guān)鍵的酶組分有2~3種，使反應(yīng)體系相對(duì)PCR更易受到抑制因子的干擾。此外因?yàn)镠DA 的反應(yīng)原理和條件與PCR不同，現(xiàn)有的PCR抑制消除劑并不都適用于HDA。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于痰液核酸的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增 添加劑，該添加劑能夠改善抑制因子對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的抑制。
[0005] 本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是提供一種解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增方法，抑制因 子對(duì)該方法的影響較小。
[0006] 為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：
[0007] -種用于痰液核酸的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增添加劑，所述的添加劑由甜菜堿、二 甲基亞砜、乙二醇二乙醚二胺四乙酸混合而成，所述的甜菜堿、所述的二甲基亞砜、所述的 乙二醇二乙醚二胺四乙酸的物質(zhì)的量比為0. 4~2:0. 8~3. 4:1。
[0008] -種解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增方法，所述方法采用的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體 系包含有添加劑，所述添加劑包含甜菜堿、二甲基亞砜和乙二醇二乙醚二胺四乙酸，其中， 甜菜堿在解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中的物質(zhì)的量濃度為〇. 2mol/L~0. 6mol/L， 二甲基亞砜在所述的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中的體積濃度為3%~7 %，所述的 乙二醇二乙醚二胺四乙酸在所述的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中的物質(zhì)的量濃度為 0? 3mol/L~0? 5mol/L〇
[0009] 具體地，所述的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系還包含解旋酶、DNA聚合酶、單鏈 DNA結(jié)合蛋白、MgS04、dNTP、dATP、探針、上游引物、下游引物、緩沖劑、DNA模板和雙蒸水。
[0010] 更具體地，在起始反應(yīng)體系中，所述的解旋酶的添加量為14~20ng/yL，所述的 DNA聚合酶的添加量為2. 6~4U/yL，所述的單鏈DNA結(jié)合蛋白的添加量為1. 6~3. 2ng/ UL，所述的MgS04添加量為4~6. 5mmol/L，所述的dNTP的添加量為0. 4~0. 7mmol/L，所 述的dATP的添加量為4. 5~6. 5mmol/L，所述的探針的添加量為50~120nmol/L，所述的 上游引物的添加量為50~120nmol/L，所述的下游引物的添加量為150~360nmol/L，所述 的添加劑占所述的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系總體積的10~20 %，所述的DNA模板占 所述的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系總體積的2~8%。
[0011] 更具體地，所述的緩沖劑包括在所述的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中的物質(zhì) 的量濃度為30mmol/L~100mm〇l/L的NaCl、在所述的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中的 物質(zhì)的量濃度為8mmol/L~15mmol/L的KC1、在所述的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中 的物質(zhì)的量濃度為16mmol/L~25mmol/L的Tris-HCl。
[0012] 更具體地，所述的探針的一端帶有熒光基團(tuán)，另一端帶有淬滅基團(tuán)。
[0013] 更具體地，所述的探針的5'端帶有熒光基團(tuán)，3'端帶有淬滅基團(tuán)，所述的熒光基團(tuán) 為TexasRed、Cy5等，所述的淬滅基團(tuán)為BHQ2、BHQ3等。
[0014] 更具體地，所述的DNA模板是自痰液中提取的DNA。
[0015] 更具體地，所述的痰液經(jīng)NaOH消化后，再進(jìn)行所述的DNA模板的提取。
[0016] 更具體地，所述方法具體實(shí)施如下：將組成解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系的各 種成分混合后，置于55°C~70°C下恒溫?cái)U(kuò)增40min~60min。
[0017] 具體地，所述的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系在60°C~65°C下進(jìn)行。
[0018] 上述添加劑在采用解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)痰液核酸中的應(yīng)用。
[0019] 由于以上技術(shù)方案的實(shí)施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0020] 1)在解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中加入添加劑，能夠顯著提高痰液核酸中目 的基因的擴(kuò)增效率，原有體系不能正常擴(kuò)增的已知陽(yáng)性樣本加入添加劑后成功擴(kuò)增；
[0021] 2)在解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中加入添加劑，可以消除不同方法抽提的痰 液核酸中可能存在的不同抑制因子的抑制作用；
[0022] 3)解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中加入添加劑，在提高檢測(cè)靈敏度的同時(shí)并未 降低反應(yīng)特異性，已知陰性樣本檢測(cè)顯示為陰性；
[0023] 總之，應(yīng)用本發(fā)明中的添加劑及擴(kuò)增方法，可以減少痰液樣本對(duì)HDA的抑制作用， 成功擴(kuò)增痰液DNA中的目的基因片段，有效避免假陰性結(jié)果，可用于臨床檢測(cè)。
【附圖說明】
[0024] 附圖1為實(shí)施例1和對(duì)比例1的擴(kuò)增結(jié)果圖；
[0025] 附圖2為實(shí)施例2和對(duì)比例2的擴(kuò)增結(jié)果圖；
[0026] 附圖3為實(shí)施例3和對(duì)比例3的擴(kuò)增結(jié)果圖；
[0027] 附圖4為實(shí)施例4和對(duì)比例4的