擴(kuò)增結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施 例。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體使用的不同要求做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施 條件為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。
[0029] 下例實(shí)施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明，下列實(shí)施例通過檢測(cè)TB基因組中 IS6110基因的HDA擴(kuò)增，列舉了添加劑對(duì)于不同方法抽提的痰液核酸樣本目的基因擴(kuò)增的 促進(jìn)作用。IS6110是結(jié)核桿菌染色體DNA中的一段重復(fù)插入序列，含有1361bp的核苷酸 和28bp的反向末端重復(fù)序列，存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中，為檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的靶基 因之一，本實(shí)施例中的TB基因組DNA的獲得途徑為：應(yīng)用QIAampDNAmini試劑盒從培養(yǎng) 的結(jié)核桿菌中提取。
[0030] 上游引物、下游引物和探針具體可根據(jù)需要擴(kuò)增的基因進(jìn)行選擇，沒有特別限制 和要求。
[0031] 本實(shí)施例中，上游引物和下游引物的序列來自于Luoetal.，Comparisonof Single-CopyandMulticopyReal-TimePCRTargetsforDetectionofMycobacterium tuberculosisinParaffin-EmbeddedTissue,JClinMicrobiol(2010)48(7):2569-70〇 擴(kuò)增產(chǎn)物位于IS6110基因內(nèi)。
[0032] 探針序列為上述上下游引物擴(kuò)增產(chǎn)物中的一段序列，長(zhǎng)度為19nt，可形成莖環(huán)結(jié) 構(gòu)，5'端帶有TexasRed熒光基團(tuán)，3'端帶有BHQ2淬滅基團(tuán)。
[0033] 下列實(shí)施例中的解旋酶、DNA聚合酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白、MgS04、dNTP、dATPJlW 劑、添加劑的獲得途徑為：解旋酶，DNA聚合酶，單鏈DNA結(jié)合蛋白來自美國(guó)BioHelix公司， MgS04來自Sigma-Aldrich公司，dNTP和dATP來自新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司，緩沖劑中的 NaCl來自Ambion公司，KC1來自Fluka公司，Trix-HCl來自Sigma公司。
[0034] 實(shí)施例1 :利用市售結(jié)核桿菌檢測(cè)試劑盒中的DNA提取試劑提取DNA檢測(cè)IS6110 基因的HDA擴(kuò)增
[0035] (1)痰液經(jīng)過NaOH消化后，應(yīng)用市售結(jié)核桿菌檢測(cè)試劑盒中的DNA提取試劑提取 DNA，最終洗脫體積為100微升，即得DNA模板。
[0036] DNA模板包括：
[0037] 空白陰性對(duì)照模板：即采用雙蒸水代替從痰液中提取的DNA模板；
[0038] 陽性對(duì)照模板：10拷貝待擴(kuò)增DNA模板；
[0039] 已知陽性痰液核酸樣本；
[0040] 已知陰性痰液核酸樣本。
[0041] ⑵解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系：其中每25yLHDA擴(kuò)增體系包括：
[0042]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于痰液核酸的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增添加劑，其特征在于：所述的添加劑由 甜菜堿、二甲基亞砜、乙二醇二乙醚二胺四乙酸混合而成，所述的甜菜堿、所述的二甲基亞 砜、所述的乙二醇二乙醚二胺四乙酸的物質(zhì)的量比為0. 4~2:0. 8~3. 4:1。
2. -種解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增方法，所述方法采用的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng) 體系包含有添加劑，其特征在于：所述添加劑包含甜菜堿、二甲基亞砜和乙二醇二乙醚二 胺四乙酸，其中，甜菜堿在解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中的物質(zhì)的量濃度為0. 2mol/ L~0. 6mol/L，二甲基亞砜在所述的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中的體積濃度為3%~7%， 所述的乙二醇二乙醚二胺四乙酸在所述的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中的物質(zhì)的量 濃度為 〇? 3mol/L~0. 5mol/L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增方法，其特征在于：所述的解旋酶依 賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系還包含解旋酶、DNA聚合酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白、MgS04、dNTP、dATP、 探針、上游引物、下游引物、緩沖劑、DNA模板和雙蒸水。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增方法，其特征在于：在起始反應(yīng)體系 中，所述的解旋酶的添加量為14~20ng/yL，所述的DNA聚合酶的添加量為2. 6~4U/yL，所 述的單鏈DNA結(jié)合蛋白的添加量為1. 6~3. 2ng/yL，所述的MgS04添加量為4~6. 5mmol/L， 所述的dNTP的添加量為0. 4~0. 7mmol/L，所述的dATP的添加量為4. 5~6. 5mmol/L，所述的 探針的添加量為50~120nmol/L，所述的上游引物的添加量為50~120nmol/L，所述的下游引 物的添加量為150~360nmol/L，所述的添加劑占所述的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系總 體積的10~20 %，所述的DNA模板占所述的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系總體積的2~8%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增方法，其特征在于：所述的緩沖劑包 括在所述的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中的物質(zhì)的量濃度為30mmol/L~100mmol/L的 NaCl、在所述的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中的物質(zhì)的量濃度為8mmol/L~15mmol/L 的KC1、在所述的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中的物質(zhì)的量濃度為16mmol/L~25mmol/ L的Tris-HCl。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增方法，其特征在于：所述的探針的一 端帶有熒光基團(tuán)，另一端帶有淬滅基團(tuán)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增方法，其特征在于：所述的DNA模板 是自痰液中提取的DNA。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增方法，其特征在于：所述的痰液經(jīng) NaOH消化后，再進(jìn)行所述的DNA模板的提取。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2至8中任一項(xiàng)所述的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增方法，其特征在于： 所述方法具體實(shí)施如下：將組成解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系的各種成分混合后，置于 55°C~70°C下恒溫?cái)U(kuò)增 40min~60min。
10. 如權(quán)利要求1所述的添加劑在采用解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)痰液核酸中 的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于痰液核酸的解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增添加劑及解旋酶依賴性等溫?cái)U(kuò)增方法，所述的添加劑由甜菜堿、二甲基亞砜、乙二醇二乙醚二胺四乙酸混合而成，所述的甜菜堿、所述的二甲基亞砜、所述的乙二醇二乙醚二胺四乙酸的物質(zhì)的量比為0.4~2:0.8~3.4:1。應(yīng)用本發(fā)明中的添加劑及擴(kuò)增方法，可以減少痰液樣本DNA對(duì)HDA的抑制作用，成功擴(kuò)增痰液DNA中的目的基因片段，有效避免假陰性結(jié)果，可用于臨床檢測(cè)。
【IPC分類】C12N15-10, C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104711251
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510137865
【發(fā)明人】曹媛, 劉萍萍, 張亞飛
【申請(qǐng)人】凱杰（蘇州）轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究有限公司
【公開日】2015年6月17日
【申請(qǐng)日】2015年3月27日