專利名稱：羅布麻dna解旋酶基因apdh1序列及其克隆與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及羅布麻DNA解旋酶基因APDH1的克隆、重組、耐鹽性功能分析及其轉(zhuǎn)基因耐鹽堿棉花的選育，屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在我國耕地中，鹽堿地分布廣泛，另外，還有未被開發(fā)利用的鹽堿荒地。由于灌溉地排水不良和海水入侵，耕地中次生鹽堿地面積逐年擴大，僅黃淮海平原各種類型的鹽堿地占耕地鹽堿地的50％以上。對鹽堿地的土壤進行改良耗資巨大，成本昂貴。選育耐鹽堿作物品種，不僅經(jīng)濟有效的提高鹽堿地作物產(chǎn)量，擴大作物種植面積，而且，可改良鹽堿地、改善生態(tài)環(huán)境，這對實現(xiàn)我國資源節(jié)約型農(nóng)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略、降低農(nóng)業(yè)成本、改善農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，具有十分重要意義。
鹽脅迫可導(dǎo)致非鹽生植物的原初危害是滲透脅迫和離子毒害，植物則通過兩種途徑減輕鹽脅迫造成的危害，一是通過滲透調(diào)節(jié)基因(如甜菜堿脫氫酶基因)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，降低滲透脅迫；二是通過細胞膜離子通道基因(如Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白基因)維持細胞內(nèi)外離子的平衡，減輕離子的毒害。目前，耐鹽堿植物基因工程主要集中在這兩個方面，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，獲得了耐鹽堿轉(zhuǎn)基因植物，但是，這些轉(zhuǎn)基因耐鹽植物耐鹽性提高是有限的，一方面是由于這些基因來自非鹽生植物，其耐鹽性功能低于鹽生植物；另一方面，植物的耐鹽是多基因參與的生物化學(xué)代謝過程，而目前應(yīng)用的基因僅參與其中的一步生物化學(xué)代謝過程，因此，從鹽生植物中克隆參與多種代謝途徑的基因，轉(zhuǎn)化非鹽生的農(nóng)作物，可進一步提高農(nóng)作物的耐鹽性。所以，本發(fā)明的目的就是從鹽生植物-羅布麻中克隆參與多種代謝途徑的基因，轉(zhuǎn)化棉花，以提高轉(zhuǎn)基因棉花的耐鹽性。
羅布麻是我國特有的鹽生植物，廣泛分布于我國的西北內(nèi)陸和濱海鹽堿地，它可以在1％-1.5％的鹽堿地正常生長，其耐鹽性遠遠高于非鹽生的農(nóng)作物。在鹽脅迫條件下，發(fā)明人利用抑制差減雜交技術(shù)，從羅布麻葉片中分離得到了一個鹽誘導(dǎo)過量表達DNA解旋酶基因的中間片段，然后進行3′和5′末端快速擴增獲得編碼羅布麻DNA解旋酶全長cDNA，將其命名為APDH1。DNA解旋酶的作用是打開DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，它參與DNA復(fù)制、修復(fù)、重組和轉(zhuǎn)錄等重要的過程，是一個參與多種代謝途徑的基因。目前的研究表明，鹽脅迫可影響DNA復(fù)制、修復(fù)、重組和轉(zhuǎn)錄，提高DNA解旋酶活性是鹽生細菌(Briolat，V.& Reysset，G.，2002，J.Bacteriol.184，2333-2343.)和抗鹽酵母(Liu & H.Y.Nefsky，等，2002，J.Biol.Chem.277，2637-2643.)適應(yīng)鹽脅迫的反應(yīng)機制。因此，發(fā)明人進一步構(gòu)建正義表達載體，轉(zhuǎn)化棉花，結(jié)果獲得的轉(zhuǎn)基因棉花可以在0.45％的鹽堿地正常出苗、開花和吐絮，而非轉(zhuǎn)基因棉花則不能出苗或者在生長過程中死亡。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明從鹽生植物羅布麻中克隆得到編碼DNA解旋酶基因APDH1的全長cDNA，然后構(gòu)建正義表達載體，通過花粉管通道轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)化棉花，結(jié)果獲得的轉(zhuǎn)基因棉花可以在0.45％的鹽堿地正常出苗、開花和吐絮。
該基因的全長cDNA為1621bp，它包含一個1218bp的開放閱讀框，編碼起始于序列的77位，終止于1294位，編碼405個氨基酸，將此氨基酸序列與國際基因庫中其它植物編碼DNA解旋酶基因的氨基酸序列相比較表明，羅布麻DNA解旋酶與擬南芥、水稻、煙草和菜豆氨基酸的同源性分別為91％、89％、88％和86％，這說明利用抑制差減雜交技術(shù)、3′和5′末端快速擴增技術(shù)獲得了編碼羅布麻DNA解旋酶基因。該基因的序列如下序列表(1)SEQ.ID.NO 1的信息(a)序列特征*長度1621堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源羅布麻(f)序列描述SEQ.ID.NO 11 attcttgtgc gaaaaccttt cttatccacc ttatctatat ctctccatcc tcaacattat61 agctcggtca acaagcatgg ccacaactac ttcggggccg gctaatcgta ggggaaccgt121aatcgacgat aagctggtct ttgaaacgac cgaaggagtc gaggccatta cctccttcaa181tggcatgggc ataaaagagg atttactccg tggtatctat gcttacggat tcgaaaagcc241ttccgctata caacagcgag cggtaatgcc tatcatacag ggtcgagatg taattgcaca301agctcaaagt ggtacgggta agaccagcat gattgccctt acagtatgcc aggtagttga361tacttcggtg cgtgaagtcc aagcattaat actgtcacct actagagagc tggcgactca421gacagaaaag gtaattctgg caattggtga tcatataaat attcaagctc atgcatgcat481aggtggcaat tctgtcggtg aagatatacg gaaactagag catggtgtac acgtcgtcag541tggaactcca ggccgtgtgt gtgacatgat taaaaggcga agtttgcgaa ctcgagcaat
601 caagttactt attctcgatg aaagtgatga aatgttaggc agaggtttca aagatcagat661 atatgatgtc tacagatatc tgcctccgga cctacaggta tgcttgatat cagctaccct721 tccacatgaa attctcgaga tgacttccaa gtttatgact gaacctgtca agatcctagt781 gaaacgagat gaattgactc tggaggggat caagcagttc tttgtagccg tagagaagga841 agattggaag tttgatacac tctgtgacct ctatgacaca ctcacaataa cactggcggt901 gatattttgc aatacgaagc gtaaggtcga ctggttaagt gaaaaaatgc gaagcaacaa961 tttcacagtg tctgtaatgc acggagacat gccacagaag gagcgagatg ctattatgaa1021tgaatttcga tctggtgcaa cccgagtttt gattacaaca gatgtatggg caagagggct1081agatgttcaa caggtatcac ttgtaataaa ttatgaccta cctaataaca gagagctcta1141catacatcgc ataggaaggt ctggtcgatt tggtcgtaag ggagtagcta ttaattttgt1201aaagtccgac gacatcaaga ttctgagaga tattgagcag tattactcta cgcagataga1261tgaaatgcct atgaatgttg ctgatctaat ttaaaaaagg ggcatgattt cggatgggtt1321ttttgtgata gtttagggtt tttggccttt ccttaggctt aaaagggccc ctttaagtct1381gtcagtctga tcgtactagc tttttaaggg ccctttccgt cgctgaatag tctagtcagt1441gtgtcagtca gtcgatcgta gctagtcagt catgtgttaa taaaggttta gtcgttgtta1501aacgtcgccc ggttatatgc taagtcatgt ctaaaccacc catttcccgg cgcgctagct1561agtcagctat agtcagtcat cgttaaaaca taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa1621a(2)SEQ.ID.NO 2的信息(a)序列特征*長度405氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)序列描述SEQ.ID.NO 21 MATTTSGPAN RRGTVIDDKL VFETTEGVEA ITSFNGMGIK EDLLRGIYAY GFEKPSAIQQ61 RAVMPIIQGR DVIAQAQSGT GKTSMIALTV CQVVDTSVRE VQALILSPTR ELATQTEKVI121LAIGDHINIQ AHACIGGNSV GEDIRKLEHG VHVVSGTPGR VCDMIKRRSL RTRAIKLLIL181DESDEMLGRG FKDQIYDVYR YLPPDLQVCL ISATLPHEIL EMTSKFMTEP VKILVKRDEL241TLEGIKQFFV AVEKEDWKFD TLCDLYDTLT ITLAVIFCNT KRKVDWLSEK MRSNNFTVSV301MHGDMPQKER DAIMNEFRSG ATRVLITTDV WARGLDVQQV SLVINYDLPN NRELYIHRIG361RSGRFGRKGV AINFVKSDDI KILRDIEQYY STQIDEMPMN VADLI將利用沙培6周的羅布麻幼苗，分別放入800mM的氯化鈉水溶液和蒸餾水處理2天，然后提取葉片和根的總RNA做Northern雜交，結(jié)果(圖1)表明鹽脅迫條件下，該基因在葉片和根的表達量大幅度增加。將羅布麻DNA解旋酶基因插入到表達載體pBI121的35S啟動子下游，構(gòu)建過量表達載體，利用改進的花粉管通道技術(shù)，導(dǎo)入陸地棉品種山農(nóng)豐抗棉6號，在卡那霉素篩選的基礎(chǔ)上，進行鹽池、鹽堿地篩選，在含鹽量0.5％鹽堿地中篩選出8株耐鹽堿棉花(圖2)，自交后代進一步篩選，結(jié)果獲得穩(wěn)定的耐鹽堿棉花品系山農(nóng)NO.3。在常規(guī)地膜覆蓋種植條件下，山農(nóng)NO.3可在含鹽量0.45％鹽堿地上正常出苗、開花、結(jié)鈴和吐絮，而山農(nóng)豐抗棉6號則不能出苗(圖3)。當利用水壓堿，降低鹽堿含量后，地膜覆蓋種植，山農(nóng)豐抗棉6號雖然可以出苗，但是，隨著棉花生長發(fā)育，土壤鹽堿含量上升而導(dǎo)致死亡，轉(zhuǎn)羅布麻DNA解旋酶基因棉花山農(nóng)NO.3則正常生長(圖4)。
根據(jù)上述技術(shù)，從鹽生植物羅布麻中克隆得到編碼DNA解旋酶基因APDH1，將該基因?qū)朊藁ㄖ?，過量表達提高了轉(zhuǎn)基因棉花的耐鹽性。如果利用該基因轉(zhuǎn)化小麥、玉米等其它非鹽生農(nóng)作物，將提高這些農(nóng)作物的耐鹽性，具有重要的經(jīng)濟效益和生態(tài)效益，因此該基因應(yīng)用前景廣闊。


圖1鹽脅迫誘導(dǎo)羅布麻DNA解旋酶基因APDH1表達量的變化。每個加樣孔為20ugRNA，與32P標記的APDH1基因3′端片段進行雜交，溴化乙啶染色的rRNA作為總RNA上樣標準。A，800mM的氯化鈉處理；B，蒸餾水處理；1，3，根；2，4，葉片。
圖2在0.5％鹽堿地進行篩選耐鹽堿轉(zhuǎn)基因植株。獲得8株耐鹽堿植株，雜草多為鹽地堿蓬。
圖3在0.45％鹽堿地常規(guī)地膜覆蓋條件下種植的山農(nóng)NO.3和山農(nóng)豐抗棉6號，下方對照山農(nóng)豐抗棉6號沒有出苗。
圖4在0.45％鹽堿地水壓堿條件下種植的山農(nóng)NO.3和山農(nóng)豐抗棉6號。左行山農(nóng)NO.3；右行山農(nóng)豐抗棉6號。
具體實施方式
實施例1羅布麻DNA解旋酶基因APDH1的克隆1.羅布麻幼苗的處理和總RNA的提取將利用沙培6周的羅布麻幼苗的處理，分別放入800mM的氯化鈉水溶液和蒸餾水處理2天，利用RNA easy Plant mini Kit(Promoga公司產(chǎn)品)試劑盒，分別提取鹽脅迫處理和蒸餾水處理羅布麻幼苗葉片的總RNA。
2.抑制差減文庫的構(gòu)建和篩選使用Clontech SMART PCR cDNA synthesis kit合成cDNA，以鹽脅迫處理幼苗葉片cDNA為tester，蒸餾水處理幼苗葉片cDNA作為driver，按照Clontech PCR-Select complementary DNA subtraction試劑盒提供的方法，構(gòu)建羅布麻鹽脅迫抑制差減cDNA文庫，對從差減文庫中篩選的陽性cDNA克隆進行酶切、PCR與逆向Northern斑點雜交鑒定、DNA測序以及核苷酸序列同源性比較，獲得一系列鹽誘導(dǎo)表達的cDNA序列。
3.基因的克隆利用BLAST軟件，對一系列鹽誘導(dǎo)表達的cDNA序列進行同源性比較，其中有一序列為DNA解旋酶基因的中間片段。然后，利用Clontech公司的SMARTRACE cDNAAmplication試劑盒，按照使用說明進行3′和5′序列的分離，結(jié)果獲得全長羅布麻DNA解旋酶基因序列4.序列的測定本工作上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司進行。
實施例2羅布麻DNA解旋酶基因APDH1的序列如下(1)SEQ.ID.NO 1的信息(a)序列特征*長度1621堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源羅布麻(f)序列描述SEQ.ID.NO 11 attcttgtgc gaaaaccttt cttatccacc ttatctatat ctctccatcc tcaacattat61 agctcggtca acaagcatgg ccacaactac ttcggggccg gctaatcgta ggggaaccgt121 aatcgacgat aagctggtct ttgaaacgac cgaaggagtc gaggccatta cctccttcaa181 tggcatgggc ataaaagagg atttactccg tggtatctat gcttacggat tcgaaaagcc241 ttccgctata caacagcgag cggtaatgcc tatcatacag ggtcgagatg taattgcaca301 agctcaaagt ggtacgggta agaccagcat gattgccctt acagtatgcc aggtagttga361 tacttcggtg cgtgaagtcc aagcattaat actgtcacct actagagagc tggcgactca421 gacagaaaag gtaattctgg caattggtga tcatataaat attcaagctc atgcatgcat481 aggtggcaat tctgtcggtg aagatatacg gaaactagag catggtgtac acgtcgtcag541 tggaactcca ggccgtgtgt gtgacatgat taaaaggcga agtttgcgaa ctcgagcaat601 caagttactt attctcgatg aaagtgatga aatgttaggc agaggtttca aagatcagat661 atatgatgtc tacagatatc tgcctccgga cctacaggta tgcttgatat cagctaccct721 tccacatgaa attctcgaga tgacttccaa gtttatgact gaacctgtca agatcctagt781 gaaacgagat gaattgactc tggaggggat caagcagttc tttgtagccg tagagaagga841 agattggaag tttgatacac tctgtgacct ctatgacaca ctcacaataa cactggcggt901 gatattttgc aatacgaagc gtaaggtcga ctggttaagt gaaaaaatgc gaagcaacaa961 tttcacagtg tctgtaatgc acggagacat gccacagaag gagcgagatg ctattatgaa1021tgaatttcga tctggtgcaa cccgagtttt gattacaaca gatgtatggg caagagggct1081agatgttcaa caggtatcac ttgtaataaa ttatgaccta cctaataaca gagagctcta
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2.基因鑒定取2μl PCR產(chǎn)物與pGEM-T easy Vector進行連接，方法按照Promega產(chǎn)品的說明進行，連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化DH5α細菌(購自上海生工生物工程公司)，轉(zhuǎn)化菌在含有氨芐青霉素和/IPTG/-Gal的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃倒置培養(yǎng)12-20小時，有的菌落為白色，有的變?yōu)樗{色。選取白色菌落，提取質(zhì)粒DNA，進行酶切和PCR鑒定。
3.表達載體構(gòu)建用Xba I和Sal I兩個限制性內(nèi)切酶將該基因從pGEM-T easy載體上切下，與相同限制性內(nèi)切酶酶切的pBI121載體進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α細菌，篩選方法如上述2描述的方法相同。
4.質(zhì)粒提取擴大繁殖連接正確的轉(zhuǎn)化DH5α細菌，利用堿裂解法提取大量質(zhì)粒DNA，供轉(zhuǎn)化。
5.遺傳轉(zhuǎn)化以山農(nóng)豐抗棉6號為受體，參照“提高棉花花粉管通道導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)化率的方法”(專利申請?zhí)枮?00410036058.8，
發(fā)明者沈法富, 韓秀蘭, 于元杰, 尹承佾 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)