專利名稱：血清或血漿中微小rna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及血清或血漿中微小RNA的提取方法。
背景技術(shù)：
微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類全長為19 25個核糖核苷酸的非編碼 調(diào)控單鏈小分子RNA，由一段具有發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體剪切后生成，通過與目標(biāo) mRNA (messenger RNAjfHRNA)分子的3-端非編碼區(qū)域(3-UTR)互補配對使目標(biāo)mRNA分 子的翻譯受到抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后對靶基因的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控。根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(the microRNA database)的記載，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的miRNAs達(dá) 9500多個，研究證實很多miRNAs與疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，尤其值得的關(guān)注的是與腫瘤發(fā)生 發(fā)展密切相關(guān)。近來，一些研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs可以在血清或血漿中穩(wěn)定存在，并且許多疾病 患者的血清或血漿中的一些miRNAs的表達(dá)明顯與正常人不同，可以作為一種特異的疾病 標(biāo)志物進(jìn)行測定。Mitchell等發(fā)現(xiàn)miRNA-141在25例前列腺癌患者血清中均高表達(dá)，可 以達(dá)到60%的敏感性、100%的特異性，并且與前列腺特異性抗原(PSA)的表達(dá)水平有一定 的關(guān)系。近來Resnick等對卵巢上皮癌患者血清中的miRNAs也進(jìn)行了測定28例患者的 血清均在治療前收集，以正常未婚者作對照，結(jié)果顯示miR-21、miR-92、miR-93、miR-126、 miR-29b在患者中明顯高表達(dá)，而miR-155、miR-127、miR-99b則低表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)miR-21、 miR-92,miR-93在患者CA-125 (癌抗原-125)升高以前出現(xiàn)，所以預(yù)示著這3種miRNAs可 以作為癌基因治療靶點及卵巢上皮癌早期發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志物。各種腫瘤的臨床用藥均存在不 同程度的損傷肝功能的副作用，Wang等在小鼠肝損傷模型中發(fā)現(xiàn)一些在肝組織中高表達(dá)的 miRNAs，如miR-122、miR-192可以在小鼠血清中持續(xù)高表達(dá)，這些血清中的miRNAs在肝損 傷早期就可以檢測出來，所以他們提出miR-122、miR-192可以作為藥物性肝損傷的早期診 斷指標(biāo)。由于血清或血漿中miRNAs比較穩(wěn)定，且其具有潛在的疾病標(biāo)志物的巨大價值。對 于腫瘤患者診斷具有較好的敏感性及特異性，加上取材的相對無創(chuàng)性，顯示出了其作為腫 瘤標(biāo)志物的優(yōu)勢，但距臨床應(yīng)用還有一定距離。首先血清或血漿中miRNAs提取是關(guān)鍵的一 個步驟，現(xiàn)有一些miRNAs提取試劑盒可以用于血清或血漿中miRNAs提取，如美國Qiagen 公司的miRNeasy mini kit，但由于其價格比較貴而限制了其大規(guī)模應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種血清或血漿中微小RNA的提取方法，能有效富集血清或血漿中 微小RNA，提取效率與現(xiàn)有大公司的試劑盒相當(dāng)，而價格僅是它們的1/3以下，有利于血清 或血漿中微小RNA在臨床的驗證和推廣應(yīng)用。一種血清或血漿中微小RNA的提取方法，依次包括以下步驟(1)將血清或血漿樣本與RNA抽提試劑以體積比為1 1. 5 2. 5在第一離心管 內(nèi)震蕩混合后靜置，再向第一離心管中加入氯仿震蕩混合，并在4 6°C溫度下離心分離得
3到上層液體，為預(yù)分離樣品；由于所述的血清或血漿樣本通常是預(yù)先保存在-70°C以下的，因此在使用前需要 在冰上預(yù)先融解，然后分裝到第一離心管中，再與RNA抽提試劑混合；離心分離在4 6°C 溫度下進(jìn)行，可有效保持預(yù)分離樣品中微小RNA的穩(wěn)定性；為了去除預(yù)分離樣品中雜質(zhì)，重復(fù)所述的加入氯仿震蕩混合并在4 6°C溫度下 離心分離的操作至少一次；(2)將步驟(1)得到的預(yù)分離樣品收集在第二離心管中，并向第二離心管中加入 標(biāo)記有-Si-OH功能基團(tuán)的磁珠，混合均勻后靜置，使得所述的磁珠充分捕獲預(yù)分離樣品中 的微小RNA ；再將第二離心管置于磁性處理器上分離，移除管內(nèi)液體，這樣在第二離心管中 得到(僅剩下)捕獲有微小RNA的磁珠；(3)向經(jīng)步驟(2)分離后得到的裝有捕獲有微小RNA的磁珠的第二離心管中，加入 高鹽緩沖液混合均勻，并置于所述的磁性處理器上分離，移除管內(nèi)液體；再向第二離心管中 加入體積百分比為70 75%的乙醇，并置于所述的磁性處理器上分離，移除管內(nèi)液體，得 到洗滌后的捕獲有微小RNA的磁珠；由于經(jīng)過步驟(2)分離得到的磁珠不僅捕獲了大量微小RNA，還吸附了一些雜質(zhì)， 經(jīng)過高鹽緩沖液的洗滌和分離，有效除去這些雜質(zhì)，再采用無毒易揮發(fā)的乙醇進(jìn)一步洗滌 和分離，除去了高鹽緩沖液可能引入的雜質(zhì)；為了達(dá)到更好的洗滌效果，重復(fù)所述的加入高鹽緩沖液混合均勻，并置于所述的 磁性處理器上分離，移除管內(nèi)液體的操作至少一次；同樣，為了達(dá)到更好的洗滌效果，重復(fù)所述的加入體積百分比為70 75%的乙 醇，并置于所述的磁性處理器上分離，移除管內(nèi)液體的操作至少一次；(4)干燥步驟(3)得到的第二離心管中的磁珠，再向第二離心管中加入洗脫液，在 60 70°C的水浴下靜置，從磁珠上洗脫捕獲的微小RNA ；在60 70°C的水浴下洗脫，既可保證洗脫效率和效果，盡可能獲得大量的微小 RNA ；又可保證不破壞微小RNA的結(jié)構(gòu)，避免微小RNA變性，保證提取樣品的質(zhì)量。(5)將步驟(4)得到的第二離心管先在室溫離心，再置于所述的磁性處理器上分 離，吸取離心管內(nèi)液體進(jìn)行收集，即為含有微小RNA的提取樣品。通常，將收集的含有微小 RNA的提取樣品保存在-70°C以下待用。本發(fā)明中，所述的RNA抽提試劑優(yōu)選為trizol試劑，所述的trizol試劑方便易 得，可以從各種商業(yè)途徑購買獲得，如可從美國irwitrogen公司購得；同時，本發(fā)明中所述 的trizol試劑可高效富集血清或血漿中的微小RNA。本發(fā)明中，步驟(1)中血清或血漿樣本與RNA抽提試劑的體積比優(yōu)選為1 2，此 時富集微小RNA的效果最好。本發(fā)明中，所述的標(biāo)記有-Si-OH功能基團(tuán)的磁珠可以通過商業(yè)途徑購買得到，比 如美國Chemicell公司的SiMAG/MP-DNA或者geneMAG-RNA/DNA試劑盒中的磁珠。本發(fā)明 中，優(yōu)選采用直徑為Ium 2um的磁珠，與微小RNA結(jié)合具有最佳的結(jié)合效果，能更有效地 捕獲微小RNA。本發(fā)明中，所述的磁性處理器為內(nèi)部設(shè)有磁鐵的裝置，可設(shè)有各種形狀的支架，其 具有磁力并可分離磁珠。當(dāng)含有磁珠的反應(yīng)體系放置在磁性處理器上時，在磁力的作用下，溶液中本來相對均勻分布的磁珠集中在磁極方向，從而達(dá)到分離磁珠的目的。本發(fā)明中，所述的高鹽緩沖液為5mol/L硫氰酸胍，也可以直接使用美國 Chemicell公司的geneMAG-RNA/DNA試劑盒中的Wash-Buffer I。從成本方面考慮，優(yōu)選所 述的高鹽緩沖液為5mol/L硫氰酸胍。本發(fā)明中，所述的洗脫液優(yōu)選為無RNA酶的雙蒸滅菌水，或經(jīng)過DEPC處理的雙蒸 滅菌水，保持提取樣品中微小RNA的完整。所述的無RNA酶的雙蒸滅菌水可以從各種商業(yè)途徑購買到，如北京百泰克生物技 術(shù)有限公司；所述的經(jīng)DEPC處理的雙蒸滅菌水的制備方法如下去離子水經(jīng)0. 焦碳酸 二乙酯(Diethylpyrocarbonate，DEPC)過夜處理后，再經(jīng)高溫高壓滅菌制備而成。經(jīng)DEPC 處理的雙蒸滅菌水中RNA酶失活。本發(fā)明中，用Trizol試劑和氯仿提取血清或血漿樣本中總RNA，得到預(yù)分離樣品； 然后采用標(biāo)記有-Si-OH功能基團(tuán)的磁珠來捕獲預(yù)分離樣品中的微小RNA，并用磁性分離器 從預(yù)分離樣品中分離得到捕獲有微小RNA的磁珠；對捕獲有微小RNA的磁珠進(jìn)行簡單的洗 滌除去雜質(zhì)后，干燥捕獲有微小RNA的磁珠，并采用洗脫液加熱洗脫捕獲在磁珠上的微小 RNA，最后通過磁性分離器分離，得到富集微小RNA的提取樣品。采用本發(fā)明方法提取血清或血漿中微小RNA，提取效率與現(xiàn)有大公司的試劑盒相 當(dāng)，而價格僅是它們的1/3以下(如Qiagen公司的miRNeasymini kit價格為人民幣2864 元，可以提取50份樣品，即每個樣品提取需要57. 28元；而本發(fā)明提取每個樣品只需要人民 幣15元左右)，有利于血清或血漿中微小RNA在臨床的驗證和推廣應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明可有效富集血清或血漿中微小RNA，因此，采取本發(fā)明方法，可以快速、有 效、低成本地提取血清或血漿中微小RNA。用本發(fā)明方法從每200 μ 1血清或血漿提取的微 小RNA就足夠用于檢測6個以上微小RNA，因此，本發(fā)明方法提取成本比較低，有利于候選疾 病標(biāo)志物微小RNA的大規(guī)模臨床驗證和后續(xù)的臨床應(yīng)用。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于此。實施例1血清中微小RNA的提取一種血清中微小RNA的提取方法，其具體步驟如下將預(yù)先保存于-70°C冰箱的血清樣本放在冰上融化，等融化后取200 μ 1血清樣本 到標(biāo)記好的1. 5ml的①號離心管中，然后加400 μ 1的trizol試劑，震蕩混合后靜置8 10 分鐘；然后再向①號離心管加入100μ 1氯仿，震蕩混合后放入離心機，12000g/min，4°C條 件下離心15分鐘；從離心機里拿出①號離心管，吸取上層白色液體到1.5ml的③號離心管 中；向③號離心管中加入100μ 1氯仿，震蕩混合后放入離心機，12000g/min，4°C條件下離 心15分鐘；從離心機里拿出③號離心管，吸取上層白色液體，為預(yù)分離樣品；將預(yù)分離樣品收集在1. 5ml的②號離心管中，并向②號離心管中加入50 μ 1美國 Chemicell公司的geneMAG-RNA/DNA試劑盒中的磁珠，磁珠的直徑為2um，混合均勻后室溫 靜置8 10分鐘；將②號離心管置于磁性處理器上分離，移除管內(nèi)液體，在②號離心管中得 到捕獲有微小RNA的磁珠；
將上述得到的②號離心管從磁性處理器中取出，向②號離心管中加入500μ 1 geneMAG-RNA/DNA試劑盒中的Wash-BufferI，混合均勻后室溫靜置2 3分鐘，再將②號離 心管置于磁性處理器上分離，移除管內(nèi)液體，重復(fù)Wash-Buffer I洗滌操作一次；將②號離 心管從所述的磁性處理器中取出，向②號離心管中加入500μ 1體積百分比為70%的乙醇， 混合均勻后室溫靜置2 3分鐘，再將②號離心管置于所述的磁性處理器上分離，移除管內(nèi) 液體，重復(fù)乙醇洗滌操作一次，得到洗滌后的捕獲有微小RNA的磁珠；將②號離心管放入真空離心機抽濾，等②號離心管內(nèi)磁珠干燥后，向②號離心管 中加入40 μ 1無RNA酶的雙蒸滅菌水，放到水浴箱，60°C靜置10分鐘，從磁珠上洗脫捕獲的 微小RNA ；將②號離心管從所述的水浴箱中取出放到離心機，室溫8000g/min離心1分鐘； 將②號離心管從離心機取出置于磁性處理器上，吸取管內(nèi)液體，即為含有微小RNA的提取 樣品。將得到的含有微小RNA的提取樣品收集在新的離心管，作好標(biāo)記保存于-70°C冰箱中 待用。實施例2本發(fā)明與其它方法提取血清中微小RNA的效果對比對比例1將預(yù)先保存于-70°C冰箱的血清樣本放在冰上融化，等融化后取200 μ 1到標(biāo)記好 的1. 5ml①號離心管中，然后加400 μ 1 trizol，震蕩混合后靜置8 10分鐘；然后再加入 100 μ 1氯仿，震蕩混合后放入離心機，12000g/min，4°C條件下離心15分鐘；從離心機里拿 出①號離心管，吸取上層白色液體到③號離心管中，加入100 μ 1氯仿，震蕩混合后放入離 心機，12000g/min，4°C條件下離心15分鐘；從離心機里拿出③號離心管，吸取上層白色液 體到②號離心管中，加入2倍上層液體體積異丙醇，混合均勻后放在-20°C冰箱過夜(大概 16-18小時)；然后12000g/min，4°C條件下離心10分鐘；倒掉液體，加入1毫升預(yù)冷的75% 乙醇，12000g/min, 4°C條件下離心10分鐘；倒掉液體，等自然干燥后重溶于10 μ 1無RNA酶 水，作好標(biāo)記保存于-70°C冰箱中待用。對比例2采用美國Qiagen公司的miRNeasy mini kit試劑盒。操作步驟如下將預(yù)先保存 于_70°C冰箱的血清樣本放在冰上融化，等融化后取200 μ 1血清樣本到標(biāo)記好的1. 5ml① 號離心管中，然后向①號離心管中加400 μ 1試劑盒中的裂解液，震蕩混合后靜置8 10分 鐘；然后再加入100μ 1氯仿，震蕩混合后放入離心機，12000g/min，4°C條件下離心15分鐘； 從離心機里拿出①號離心管，吸取上層白色液體到③號離心管中，加入100 μ 1氯仿，震蕩 混合后放入離心機，12000g/min，4°C條件下離心15分鐘；從離心機里拿出③號離心管，吸 取上層白色液體到②號離心管中，加入1. 5倍體積的純乙醇混合均勻；吸取700μ 1到試劑 盒自配的柱子上，8000g/min，15°C條件下離心15秒；倒掉底部液體，再加剩余樣品，在同樣 條件下離心；倒掉底部液體，加700 μ 1 RffT到柱子，8000g/min，15°C條件下離心15秒；倒 掉底部液體，加500 μ 1 RPE到柱子，8000g/min，15°C條件下離心15秒；倒掉底部液體，加 500 μ 1 RPE到柱子，8000g/min，15°C條件下離心2分鐘；柱子轉(zhuǎn)移到④號離心管，12000g/ min，15°C條件下離心1分鐘；加無RNA酶水40 μ 1，把柱子轉(zhuǎn)移到⑤號離心管中，8000g/ min, 15°C條件下離心1分鐘，作好標(biāo)記保存于_70°C冰箱中待用。熒光定量PCR檢測將采用實施例1與對比例1和2的方法得到的含微小RNA的提取樣品分別經(jīng)過熒光定量PCR(PCR為Polymerase Chain Reaction的簡寫，即為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))檢測進(jìn)行比 較。熒光定量PCR采用美國ABKAppliedbiosystems)公司用于檢測miR-191的成套試劑 盒，包括TaqMan MicroRNA Assays,TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 和TaqMan Universal PCR Master Mix，No AmpErase UNG，采用 TAGMAG 探針法。具體步驟如下A :miR-191 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑及用量IOOmmol/L dNTPs 0.15ulMultiscribe 反轉(zhuǎn)錄酶(RT enzyme) :lul10X 反轉(zhuǎn)錄緩沖液(10氺RT buffer) :1· 5ulRNA 抑制劑(RNase Inhibitor) :0· 19ul反轉(zhuǎn)錄引物(RTprimers) :2ul含微小RNA的提取樣品(sample) :2ul無核酸酶的水(Nuclease-free water) 8. 2ul反應(yīng)體系15ul/管。反應(yīng)程序:16°C · 30分鐘；420C · 30分鐘；85°C · 5分鐘；4°C保存。B :miR-191熒光定量PCR檢測TaqMan 2*Universal PCR Master Mix :10ul.Nuclease-free water :7ulPrimer+probe Iul反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2ul反應(yīng)體系20ul/管，2次重復(fù)。反應(yīng)程序50°C· 2 分鐘，95°C · 10 分鐘-----95°C · 15 秒；60°C · 60 秒循環(huán) 40次。PCR檢測結(jié)果見表l，Ct值的含義是每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的熒光域 值(threshold)時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。熒光域值(threshold)采用30000。即Ct值越低說明 起始miR-191含量越高。表 1 從表1可見，本發(fā)明方法的提取效果與世界上最公認(rèn)的美國Qiagen公司的試劑盒 (對比例2)效果接近，而明顯優(yōu)于其它方法(對比例1)。實施例3血清中微小RNA的提取的重復(fù)性實驗將預(yù)先保存于_70°C冰箱的血清樣本放在冰上融化，等融化后取200 μ 1到標(biāo)記好 的1. 5ml離心管中，采用與實施例1相同的方法提取微小RNA。重復(fù)三次，得到的含微小RNA的提取樣品分別記為樣本1，樣本2，樣本3。對三次重復(fù)實驗提取得到的樣本1，樣本2和 樣本3進(jìn)行熒光定量PCR分析，結(jié)果如表1所示。其中，熒光定量PCR檢測條件和步驟同實施例2相同，重復(fù)檢測三次，檢測結(jié)果如 表2所示。熒光域值(threshold)采用30000。表 2 從表2中可見，采取本發(fā)明方法提取血清中微小RNA具有非常好的重復(fù)性。實施例4血漿中微小RNA的提取將預(yù)先保存于-70°C冰箱的血漿樣本放在冰上融化，等融化后取200 μ 1血漿樣本 到標(biāo)記好的1. 5ml的①號離心管中，接下來的實驗步驟同實施例1。另外，熒光定量PCR檢測條件和步驟同實施例2相同，重復(fù)檢測二次，檢測結(jié)果如 表3所示。熒光域值(threshold)采用30000。表3
實施例4 (Ct值)miR-19127.7527.94從表3中可見，采取本發(fā)明方法提取血漿中微小RNA也具有非常好的效果。實施例5血清中微小RNA的提取本實施例中除了把Wash-BufferI換成5mol/L硫氰酸胍，其它實驗步驟同實施例 1。另外，熒光定量PCR檢測條件和步驟與實施例2相同，重復(fù)檢測二次，檢測結(jié)果如 表4所示。熒光域值(threshold)采用30000。表 4 從表4中可見，采取5mol/L硫氰酸胍為洗滌液提取血清中微小RNA也具有非常好 的效果。
權(quán)利要求
一種血清或血漿中微小RNA的提取方法，其特征在于，依次包括以下步驟(1)將血清或血漿樣本與RNA抽提試劑以體積比為1∶1.5～2.5在第一離心管內(nèi)震蕩混合后靜置，再向第一離心管中加入氯仿震蕩混合，并在4～6℃溫度下離心分離得到上層液體，為預(yù)分離樣品；(2)將步驟(1)得到的預(yù)分離樣品收集在第二離心管中，并向第二離心管中加入標(biāo)記有 Si OH功能基團(tuán)的磁珠，混合均勻后靜置；再將第二離心管置于磁性處理器上分離，移除管內(nèi)液體，在第二離心管中得到捕獲有微小RNA的磁珠；(3)向經(jīng)步驟(2)分離后得到的裝有捕獲有微小RNA的磁珠的第二離心管中，加入高鹽緩沖液混合均勻，并置于所述的磁性處理器上分離，移除管內(nèi)液體；再向第二離心管中加入體積百分比為70～75％的乙醇，并置于所述的磁性處理器上分離，移除管內(nèi)液體，得到洗滌后的捕獲有微小RNA的磁珠；(4)干燥步驟(3)得到的第二離心管中的磁珠，再向第二離心管中加入洗脫液，在60～70℃的水浴下靜置，從磁珠上洗脫捕獲的微小RNA；(5)將步驟(4)得到的第二離心管先在室溫離心，再置于所述的磁性處理器上分離，吸取離心管內(nèi)液體進(jìn)行收集，即為含有微小RNA的提取樣品。
2.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的RNA抽提試劑為trizol試劑。
3.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(1)中，第一離心管內(nèi)震蕩混合的 血清或血漿樣本與RNA抽提試劑的體積比為1 2。
4.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的磁珠的直徑為1 2μπι。
5.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的高鹽緩沖液為5mol/L硫氰酸胍。
6.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的洗脫液為無RNA酶的雙蒸滅菌 水，或經(jīng)過DEPC處理的雙蒸滅菌水。
7.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(1)中，重復(fù)所述的加入氯仿震蕩 混合并在4 6°C溫度下離心分離的操作至少一次。
8.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(3)中，重復(fù)所述的加入高鹽緩沖 液混合均勻，并置于所述的磁性處理器上分離，移除管內(nèi)液體的操作至少一次。
9.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(3)中，重復(fù)所述的加入體積百分 比為70 75%的乙醇，并置于所述的磁性處理器上分離，移除管內(nèi)液體的操作至少一次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種有效富集血清或血漿中微小RNA的提取方法，用Trizol和氯仿預(yù)分離樣品中微小RNA，然后通過標(biāo)記有-Si-OH功能基團(tuán)的磁珠的方法捕獲預(yù)分離樣品中的微小RNA，用磁性分離器分離磁珠及樣品；經(jīng)過簡單的洗滌干燥后，加無RNA酶水后通過水浴箱加熱洗脫，進(jìn)一步通過磁性分離器分離即可。本發(fā)明的方法可用于候選疾病標(biāo)志物微小RNA的大規(guī)模驗證和臨床應(yīng)用時的微小RNA的提取。本發(fā)明方法能高效富集血清或血漿中微小RNA，不僅方便快捷，且價格低廉。
文檔編號C12N15/10GK101914526SQ20101025390
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月13日
發(fā)明者凌志強, 毛偉敏, 牟瀚舟, 鄭智國 申請人:浙江省腫瘤醫(yī)院