; Lee, Sun Hee; Rhee, Young Ha. Isolation and characterization of plant growth promoting endophytic diazotrophic bacteria from Korean rice cultivars. The Journal of Microbiology 48. 5，（Oct 2010): 559-65.)所述：將四種溶液混合均勻后，制成鐵載體檢測平板。將 活化的菌種點接在鐵載體檢測培養(yǎng)基上，在28°C下倒置培養(yǎng)，觀察平板上的顏色變化，若平 板上菌落周圍產(chǎn)生了橙色圈就證明產(chǎn)生了鐵載體。
[0032] 四種溶液的配方為： 溶液一 ：60.5 mg CAS溶解于50 mL水，10 mL三價鐵溶液（ImM FeCl36H20，10 mM HC1)， 兩者混合均勻，將72. 9 mg HDTMA (十六烷基三甲基溴化銨）溶解于40 mL水中，然后緩慢 攪拌加入以上混合溶液中，將上述深藍色混合溶液在121°C下高壓蒸汽滅菌20min，冷卻至 5(TC〇
[0033]溶液二：將 0? 3 g KH2P04,0. 5 gNaCl 及 1. 0 g NH4C1 溶解于 750mL 水中，再加入 30. 24 g PIPES (哌嗪-1，4-二乙磺酸)于以上鹽溶液中，用50% (w/w) K0H溶液調(diào)節(jié)pH至 6. 8,加入15g瓊脂粉，在121°C下高壓蒸汽滅菌20min，冷卻至50°C。
[0034]溶液三：100mL15X KB 培養(yǎng)基（蛋白胨 3. 2g，K2HP04 0? 115g，MgS04.7H20 0? 15 g， 丙三醇 1.5g)與 70mL 含有 2 g 葡萄糖、2 g 甘露醇、439 mg MgS047H20、ll mg CaCl2、1.17mg MnS04H20、l. 4mgH3B03、0. 04mgCuS045H20、l. 2mgZnS047H20、l. Omg Na2Mo042H20 的溶液混合，在 121°C下高壓蒸汽滅菌20min，冷卻至50°C。
[0035] 溶液四：30mL 10%的酪蛋白氨基酸溶液，過濾除菌。
[0036] 結(jié)果顯示，巨大芽孢桿菌（Sphingomonas wittichii)pp02平板上的菌落周圍能產(chǎn) 生較明顯的橙色圈，證明該菌能夠分泌鐵載體，促進植物對鐵的吸收（圖5 b)。 3、固氮能力檢測 根據(jù)參考文獻(張振粉，牧草內(nèi)生枯草芽孢桿菌的功能多樣性及16S rDNA鑒定 [D]，2010，蘭州，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)）所述，用阿須貝氏（Ashby)培養(yǎng)基測定巨大芽孢桿菌 riMicAii)pp02的固氮能力。將活化好的菌株接種到阿須貝培養(yǎng)基中，每 個菌株3次重復(fù)，以接種無菌水為對照，在28°C下恒溫培養(yǎng)，在第3天及第7天觀察其生長 狀況，其明顯渾濁的為陽性。
[0037] 結(jié)果顯不，巨大芽孢桿菌（riMicAii)pp02培養(yǎng)管菌液明顯渾池， 說明巨大芽孢桿菌（riMicAii)pp02具有較強固氮能力（圖5c)。
[0038] 實施例5: 巨大芽孢桿菌PP〇2在植物體內(nèi)的定殖能力鑒定 (1)取實施例1中所述的灌根侵染巨大芽孢桿菌PP〇2 3天的雜交狼尾草苗的根，經(jīng)表 面消毒，石英砂研磨，加無菌水混勻，100 u L涂布于LB固體培養(yǎng)基上，30°C，培養(yǎng)48h，觀察 菌落生長情況，并隨機挑取3個單克隆，搖菌，經(jīng)16SrDNA測序?qū)赀M行分子鑒定，以未侵 染的雜交狼尾草苗根作為對照。
[0039] 接種驗證試驗證明灌根處理三天，該巨大芽孢桿菌pp02就能夠在植物體內(nèi)定殖， 侵染效率為4. 9cfu/g植物根鮮重。
[0040] (2)取實施例1中所述的灌根侵染巨大芽孢桿菌PP02 3天的雜交狼尾草苗的根， 洗去蛭石，然后_20°C冰箱冷凍24h，再置于冷凍干燥機中干燥，用刀片法將根縱向剖開，掃 描電鏡觀察內(nèi)生菌定殖情況，拍照。 結(jié)果表明，侵染約7天，巨大芽孢桿菌pp02已大范圍定殖在根的皮層內(nèi)，少數(shù)定殖到了 維管束內(nèi)（圖6)。
[0041] 實施例6: 巨大芽孢桿菌PP〇2的耐鹽能力鑒定 (1) 取-70°C冷凍保存的巨大芽孢桿菌CGMCC 9415菌液，劃線接種于LB固體培養(yǎng)基 上，28°C恒溫箱中培養(yǎng)1820h，挑取單菌落接種于5mL的LB液體培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng) 1820h，得活化菌液； (2) 活化好的菌接種在NaCl濃度為0%、0. 5%、1%、1. 5%、3%、5%、7%、9%、11%的LB培養(yǎng)基 中，培養(yǎng)24小時后分光光度計測定菌液0D值（0D600)。
[0042] 結(jié)果顯示，巨大芽孢桿菌pp02耐鹽能力較強，NaCl濃度在1. 5%以下時對于其生 長幾乎沒有影響，在NaCl濃度3~5%時，pp02的生長雖然受到了部分抑制，但是仍能維持正 常的生長代謝，培養(yǎng)24h時菌體濃度0D可達2. 5左右（圖7)。
[0043] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種巨大芽抱桿菌pp02(Bacillusmegateriumpp02 )，于2014年7月4號在中 國微生物保藏中心保藏，保藏號CGMCC9415。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種巨大芽孢桿菌pp02,其特征在于，所述巨大芽孢桿菌 pp02來源于象草。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種巨大芽孢桿菌pp02,其特征在于，所述巨大芽孢桿菌 PP〇2是按如下方法從象草中分離培養(yǎng)得到的： (1) 取自江蘇省農(nóng)科院試驗田的象草蘇牧2號，取根部經(jīng)表面消毒殺滅供試材料表面 微生物，加適量石英砂研磨，加無菌水混勻，涂布于LB固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h; (2) 挑取單菌落在LB固體培養(yǎng)基上反復(fù)劃線純化，直到得到純系菌株為止； (3) 將純系菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)18h，取菌液加入質(zhì)量濃度為50%的 甘油中，混合后置于_70°C冰柜中冷凍保存； (4) 將所得的純系菌株，通過雜交狼尾草苗接種試驗驗證其促生長活性后，鑒定，并保 存菌種，其中一株分離純化所得的內(nèi)生細菌命名為PP〇2。
4.權(quán)利要求1所述的一種巨大芽孢桿菌pp02在促進植物生長中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種巨大芽孢桿菌pp02在促進植物生長中的應(yīng)用，其特征 在于，所述巨大芽孢桿菌PP02在促進鹽脅迫條件下植物的生長中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種巨大芽孢桿菌pp02在促進植物生長中的應(yīng)用，其 特征在于，所述植物為雜交狼尾草。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種巨大芽孢桿菌pp02在促進植物生長中的應(yīng)用，其特征 在于，所述促進植物生長的驗證方法為： 將雜交狼尾草種子消毒，置于1/2MS培養(yǎng)基，25°C暗培養(yǎng)48小時催芽，將催芽后的種 子播種于裝滿蛭石的盆缽中，苗長至10天左右，用PP〇2發(fā)酵原液灌根，侵染3天后，開始并 每隔四天澆6mg/mL鹽水，20天后測量苗高并稱鮮重。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種巨大芽孢桿菌pp02,其特征在于，所述巨大芽孢桿菌 PP〇2能在植物體內(nèi)定殖。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種巨大芽孢桿菌pp02,其特征在于，所述巨大芽孢桿菌 PP〇2能在象草或雜交狼尾草體內(nèi)定殖。
10.權(quán)利要求1所述的一種巨大芽孢桿菌PP〇2,其特征在于，所述巨大芽孢桿菌pp02 能夠分泌植物生長激素吲哚乙酸，具有有固氮能力，并能夠產(chǎn)鐵載體。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種源于象草的巨大芽孢桿菌及其用途，屬于應(yīng)用微生物技術(shù)領(lǐng)域。所述菌為象草內(nèi)生菌巨大芽孢桿菌pp02，分類名為巨大芽孢桿菌pp02(Bacillus megaterium pp02)，于2014年7月4號在中國微生物保藏中心保藏，保藏號CGMCC 9415；該菌株具有產(chǎn)鐵載體、固氮、產(chǎn)IAA的特性，IAA產(chǎn)量達10.57μg/mL，且在植物根部定殖能力強，耐鹽能力強，在5%NaCl（50g/L）培養(yǎng)基中能生長，是一種優(yōu)良的植物促生內(nèi)生菌菌株；利用該菌株侵染雜交狼尾草，能顯著提高植株的耐鹽能力，促進其生長，植株地上部鮮重、干重、植株高度顯著增加；該菌株的發(fā)現(xiàn)對于雜交狼尾草微生物肥料研制，促進其在鹽堿邊際土地植物的生長發(fā)育有重要的開發(fā)應(yīng)用前景。CGMCC No.941520140704
【IPC分類】A01N63-00, C12R1-11, A01P21-00, C12N1-20
【公開號】CN104762228
【申請?zhí)枴緾N201510010884
【發(fā)明人】孫建中, 李霞, 耿小燕, 梅傳生, 蔣建雄, 高璐, 傅蕾
【申請人】江蘇大學(xué)
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年1月9日