一種牛cmya1肌肉特異性表達(dá)核心啟動子及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中的基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種牛CMYA1肌肉特異 性表達(dá)核屯、啟動子及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 1，CMYA1 基因研究進(jìn)展，不同物種CMYA1(Cardiomyopathyassociatedprotein 1，原發(fā)性屯、肌癥相關(guān)蛋白1)都含有5個高度保守的結(jié)構(gòu)域，分別為富含脯氨酸的區(qū)域、16 個氨基酸的重復(fù)序列（又叫Xin重復(fù)序列）、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)基序和核定位信號。 牛CMYA1 基因（CMYAlGeneID:509670)位于C虹omosome22 ;12549676 ~12558895bp，有 兩個外顯子一個內(nèi)含子，編碼1820個氨基酸，編碼區(qū)全長6272bp，推導(dǎo)出來的蛋白質(zhì)等電 點（Isoelectricpoint) :6. 4162,分子量（Mole州larwei曲t): 194814. 91g/mol。
[0003] CMYAl基因最早通過mRNA差異顯示技術(shù)在雞胚的房室溝中發(fā)現(xiàn)，又命名為XIRPl 或Xin基因。CMYA1蛋白定位于罔盤的粘附接頭和骨骼肌的肌腫結(jié)合點，在哺乳動物 中CMYA1基因存在兩個外顯子，第二個外顯子包含整個編碼蛋白區(qū)域CJuliaOttenet al.，2010)。雞（cXin)和小鼠（mXin)的氨基酸序列有46%的同源性，經(jīng)過預(yù)測骨骼肌特異 性CMYA1基因含有脯氨酸豐富區(qū)、16氨基酸重復(fù)單元、核酸定位信號和SH3結(jié)合基序。表達(dá) 譜分析顯示CMYA1基因于橫紋肌表達(dá)。而后通過構(gòu)建小鼠mXinP打祀載體成功的獲得了純 合的mXinP缺失小鼠模型，發(fā)現(xiàn)完全缺失mXinP基因的小鼠屯、肌層無序、屯、臟形態(tài)異常、 室中隔缺失、屯、臟舒張功能素亂、嚴(yán)重的生長遲緩和出生后死亡。mXinP在調(diào)節(jié)N-巧粘蛋 白（N-ca化erin)控制出生后的屯、臟生長和動物存活中起著必要的功能，進(jìn)一步證實CMYA1 基因在屯、臟形成發(fā)育中的重要作用。XinmRNA在肌損傷后12小時的肌肉組織中表達(dá)高升， 免疫組化分析證明Xin基因在肌衛(wèi)星細(xì)胞中表達(dá)。肌生成的轉(zhuǎn)錄分化因子MyoD、肌生因子 Myf-5和肌生增強因子ME巧有能力激活Xin。很多研究表明，CMYA1基因特異性表達(dá)于肌 肉組織中，因而CMYA1啟動子很有可能是肌肉特異性表達(dá)的，未發(fā)現(xiàn)有人對牛CMYA1基因的 啟動子進(jìn)行研究，本發(fā)明將為后續(xù)CMYA1肌肉特異性啟動子的利用奠定基礎(chǔ)。
[0004] 2,肌肉特異性表達(dá)啟動子，啟動子是位于基因5'端上游轉(zhuǎn)錄起始位點附近的一段 DNA序列，根據(jù)基因表達(dá)屬性的不同，可將啟動子分為組成型啟動子和特異型啟動子，前者 在所有組織中均能啟動基因表達(dá)，后者僅在一定發(fā)育時期的特定組織中啟動基因表達(dá)。在 最近幾年，人們分離了許多肌肉特異性啟動子，如肌肉肌酸激酶（MCK)、骨骼肌a-actin、 肌球蛋白重鏈（M州C)、生肌調(diào)控因子家族（MyoD、My巧、化f4和Myogenin)等肌肉特異性基 因的啟動子，進(jìn)而對該些啟動子對肌肉細(xì)胞的增殖、分化作用機理W及轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行深入 研究。啟動子的上游區(qū)域轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的種類、數(shù)量、排列順序?qū)M織特異性基因的轉(zhuǎn)錄活 性具有十分重要的作用。肌肉特異性啟動子中含有多種上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，主要有：M-CAT 元件、M邸-1元件、M邸-2元件、Trex/M邸-3元件、CACCC盒、SRE元件、MPEX元件、Pax3/7元 件。
[0005] 國內(nèi)也有一些研究者分離克隆了一些基因的啟動子，如小鼠MCK啟動子的克隆與 驗證，克隆得到小鼠MCK啟動子1355bp，并未做缺失篩選核屯、啟動子片段，也有研究者克隆 得到山羊MyoG基因啟動子1200bp，也未進(jìn)行啟動子缺失研究，獲得核屯、啟動子片段。雖然 一些肌肉特異性啟動子已經(jīng)獲得，但其活性與效率差異不一，片段長短也不一樣。很多研究 表明，啟動子的核屯、調(diào)控元件分布在啟動子的3'端非翻譯區(qū)，本發(fā)明W此為根據(jù)，固定3' 端，在啟動子5'端作缺失驗證，W求最終獲得較短的CMYA1肌肉特異性核屯、啟動子序列，方 便該肌肉特異性啟動子的利用。
[0006] 本發(fā)明對CMYA1基因及其啟動子區(qū)域進(jìn)行了綜合分析，考慮啟動子在基因組中的 位置特點，發(fā)現(xiàn)在CMYA1基因第一外顯子第一個堿基上游1135bp及下游20bp區(qū)域，不含保 守序列"TATA"框和"CAAT"盒，含有保守序列"GC"盒，含有肌肉特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件 SRE元件，MEF-1元件巧-box)，MEF-2元件，TreX元件和化x3/7元件。SRE元件的核屯、序列 為5' -CC[A/T]GG-3'，即血清應(yīng)答元件，已知a-actin、肌球蛋白輕鏈（MyLC)、肌營養(yǎng)障礙 基因（dystrophin)和早期生長應(yīng)答因子-1(earlygrowthresponse-1,Egr-l)的啟動子 中均存在SRE元件。MEF-1元件巧-box)的核屯、序列為5'-CANNTG-3'，其主要存在于生肌 調(diào)控家族因子MyoD、My巧、Myogenin和MRF4基因中，它們在骨骼肌生長和發(fā)育過程中起著 至關(guān)重要的作用。MEF-2元件，其核屯、序列為5'-[CA]TAAAAAT-AAC[CA]-3'，該元件存在 于肌球蛋白輕鏈2A基因的啟動子增強子區(qū)域。富含A/T基序的MEF-2順式作用元件可與 ME巧因子結(jié)合，ME巧因子是MADS-box超家族蛋白一員，是哺乳動物生肌調(diào)控基因MyoD的 重要下游調(diào)控因子。TreX結(jié)合序列為 5'-[G/C/T] [A/G/C]NGAT[A/G]G[G/C/T] [G/C/T]-3'， TreX元件被證明在骨骼肌和屯、肌中對MCK基因啟動子的表達(dá)至關(guān)重要?；痻3/7元件，其核 屯、序列為5' -GTAAC-3'，與反式作用因子化x3和化巧復(fù)合物結(jié)合?；疿3/7元件主要存在 于生肌調(diào)控因子MRF基因的啟動子上游調(diào)控區(qū)域，起始MRF基因的表達(dá)，在胚胎的骨骼肌發(fā) 育中起關(guān)鍵性作用。因此，本發(fā)明獲得的CMYA1啟動子，其特征如下：全長片段115化P，位 于CMYA1基因第一外顯子第一個堿基上游1135bp及下游20bp，不含保守序列"TATA"框和 "CAAT"盒，含有保守序列"GC"盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提出一種牛CMYA1肌肉特異性表達(dá)核屯、 啟動子及制備方法。
[0008] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采取W下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0009] 一種牛CMYA1肌肉特異性表達(dá)核屯、啟動子，該核屯、啟動子的基因序列為SQ2。
[0010] 一種牛CMYA1肌肉特異性表達(dá)核屯、啟動子的制備方法，包括步驟如下：
[0011] (1)牛CMYA1肌肉特異性啟動子的克隆，
[0012] 在NCBI上比對牛CMYA1全基因序列在染色體的位置，并找到第一外顯子，根據(jù)啟 動子在基因序列的位置特點，克隆第一外顯子第一個堿基上游1135bp及下游20bp序列，得 到總共1155bp的啟動子基因序列SQ1 ;
[0013] (2)構(gòu)建祀GFP-1-CMYA1啟動子載體并驗證上述啟動子只在肌肉細(xì)胞中特異性表 達(dá)，
[0014] ①設(shè)計用于擴(kuò)增該片段的PCR上下游引物，上游引物5'端添加酶切位點 化〇1燈〔646)，保護(hù)堿基為CCG，下游引物5'端添加酶切位點化ndlll，（AAGCTT)，保護(hù)堿基 為CCC，PCR擴(kuò)增出該片段；
[0015] ②然后構(gòu)建祀GFP-1-CMYA1啟動子載體，分別轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞、牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞 和牛成纖維細(xì)胞，驗證出該啟動子只在肌肉細(xì)胞中特異性表達(dá)；
[0016] (3)篩選核屯、啟動子，
[0017] ①先進(jìn)行啟動子缺失片段設(shè)計，共設(shè)計缺失引物8對，上游引物5'端添加酶切位 點化〇1，下游引物5'端添加酶切位點化ndlll，擴(kuò)增出相應(yīng)的啟動子缺失片段，并分別命名 為P1，P2,P3,P4,P5,P6,P7和P8,分別構(gòu)建載體pGL3-Basic-CMYAl啟動子缺失片段載體， 與P化-TK載體分別共轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，pGL3-Basic為陰性對照，pGL3-Control為陽性對 昭. y>、、》
[0018] ②轉(zhuǎn)染24小時后，裂解C2C12細(xì)胞，用PR0MEGA公司生產(chǎn)的雙巧光素酶報告基因 系統(tǒng)檢測試劑盒檢測CMYA1啟動子活性，篩選出CMYA1核屯、啟動子，該核屯、啟動子序列長度 47化P，基因序列為SQ2 ;
[0019] ⑨使用C2C12細(xì)胞和牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗，證明該核屯、啟動子依然保留著 其在肌肉細(xì)胞中特異性表達(dá)的性質(zhì)；
[0020] 而且，所述步驟（3)篩選核屯、啟動子的第①步中的8對缺失引物如下面的表1所 示，
[0021] 表1.CMYA1啟動子缺失片段引物設(shè)計
[0022]
【主權(quán)項】
1. 一種牛CMYA1肌肉特異性表達(dá)核心啟動子，其特征在于：該核心啟動子的基因序列 為SQ2。
2. -種牛CMYA1肌肉特異性表達(dá)核心啟動子的制備方法，其特征在于：包括步驟如 下： (1) 牛CMYA1肌肉特異性啟動子的克隆， 在NCBI上比對牛CMYA1全基因序列在染色體的位置，并找到第一外顯子，根據(jù)啟動子 在基因序列的位置特點，克隆第一外顯子第一個堿基上游1135bp及下游20bp序列，得到總 共1155bp的啟動子基因序列SQ1 ; (2) 構(gòu)建pEGFP-1-CMYAl啟動子載體并驗證上述啟動子只在肌肉細(xì)胞中特異性表達(dá)， ① 設(shè)計用于擴(kuò)增該片段的PCR上下游引物，上游引物5'端添加酶切位點 Xhol(CTCGAG)，保護(hù)堿基為CCG，下游引物5'端添加酶切位點Hindlll，（AAGCTT)，保護(hù)堿基 為CCC，PCR擴(kuò)增出該片段； ② 然后構(gòu)建PEGFP-1-CMYA1啟動子載體，分別轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞、牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞和牛 成纖維細(xì)胞，驗證出該啟動子只在肌肉細(xì)胞中特異性表達(dá)； (3) 篩選核心啟動子， ① 先進(jìn)行啟動子缺失片段設(shè)計，共設(shè)計缺失引物8對，上游引物5'端添加酶切位點 Xhol，下游引物5'端添加酶切位點Hindlll，擴(kuò)增出相應(yīng)的啟動子缺失片段，并分別命名為 Pl，P2,P3,P4,P5,P6,P7和P8,分別構(gòu)建載體pGL3-Basic-CMYAl啟動子缺失片段載體，與 pRL-TK載體分別共轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，pGL3-Basic為陰性對照，pGL3-Control為陽性對照； ② 轉(zhuǎn)染24小時后，裂解C2C12細(xì)胞，用PR0MEGA公司生產(chǎn)的雙熒光素酶報告基因系 統(tǒng)檢測試劑盒檢測CMYA1啟動子活性，篩選出CMYA1核心啟動子，該核心啟動子序列長度 477bp，基因序列為SQ2 ; ③ 使用C2C12細(xì)胞和牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗，證明該核心啟動子依然保留著其在 肌肉細(xì)胞中特異性表達(dá)的性質(zhì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的牛CMYA1肌肉特異性表達(dá)核心啟動子的制備方法，其特征在 于：所述步驟（3)篩選核心啟動子的第①步中的8對缺失引物如下面的表1所示， 表1.CMYA1啟動子缺失片段引物設(shè)計
e
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種牛CMYA1肌肉特異性表達(dá)核心啟動子及其制備方法，本發(fā)明首先克隆牛CMYA1基因啟動子全長片段1155bp，并構(gòu)建pEGFP-1-CMYA1啟動子載體，轉(zhuǎn)染小鼠C2C12成肌細(xì)胞、牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞及牛成纖維細(xì)胞，證實該載體的肌肉特異性表達(dá)；然后對CMYA1啟動子進(jìn)行缺失研究，共設(shè)計CMYA1啟動子缺失片段8條，分別構(gòu)建載體pGL3-basic-CMYA1啟動子缺失片段載體，然后轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，通過驗證，最終獲得CMYA1核心啟動子，基因序列為SQ2。本發(fā)明CMYA1啟動子在肌肉細(xì)胞中特異性表達(dá)，且啟動活性很高，人們可以利用這一特性對肌肉的發(fā)育，分化進(jìn)行研究。
【IPC分類】C12N15-113, C12N15-10
【公開號】CN104774838
【申請?zhí)枴緾N201510162705
【發(fā)明人】郭宏, 丁向彬, 劉新峰, 李新, 劉仲偉
【申請人】天津農(nóng)學(xué)院
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年4月8日