（IL);甘油 40g，KH2PO41. 36g，（NH4)2S046. 61g，MgCla? 6&0 0. 26g， CaCls0. 29g，巧樣酸 0. 42g，酵母粉 2g，5血微量元素B溶液狂nCl20.68g/L，MnCls? 4&0 0. 17g/L，H3BO360mg/L，CuCla? 2&0 0. 47g/L，NaMo〇4? 2&0 5mg/L，化Cl2? 4&0 3. 97g/L， C0CI2?6H2O0. 47g/L，肥1 10血/L)，其余為自來水。
[00創(chuàng)富集培養(yǎng)基（g/L);酵母粉1.0,蛋白腺5.0,甘油10,化Cl5.0, K2HPO45.8，MgS04? 7馬0 0? 2, CaC032. 0。
[0044] 固體培養(yǎng)基（g/L);在種子培養(yǎng)基中加入瓊脂15。
[0045] 2.本發(fā)明實(shí)施例中設(shè)及的微生物包括；由大連海域海泥中分離得到的混菌NHN8， 該混菌由保藏號(hào)為CGMCCNO. 10440的肺炎克雷伯氏菌化lebsiellapneumoniae)W3;保 藏號(hào)為CGMCCNO. 10439的肺炎克雷伯氏菌aUebsiellapneumoniae)Y1;保藏號(hào)為CGMCC NO. 10438的肺炎克雷伯氏菌化lebsiellapneumoniae)Y5組成?；炀鶱HN8中肺炎克雷伯 氏菌W3、Y1和Y5的自然菌體數(shù)的比例為208:17:82。肺炎克雷伯氏菌W3、肺炎克雷伯氏菌 Y1和肺炎克雷伯氏菌Y5 =株菌于2015年1月26日均保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中屯、（地址為；北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究 所，郵編100101)。
[0046] 3.微生物培養(yǎng)和發(fā)酵；
[0047] 種子培養(yǎng)；將裝有100血種子培養(yǎng)基的250血S角瓶用紗布和牛皮紙封口，于 121°C下滅菌20分鐘，冷卻后接入斜面所述微生物，于37°C、200r/min搖床中培養(yǎng)（約12 小時(shí)），W便獲得種子培養(yǎng)液。
[0048] 搖瓶發(fā)酵：將ImL培養(yǎng)12小時(shí)的種子培養(yǎng)液接種入含有l(wèi)OOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的 250血揺瓶中，37°C、200r/min搖床中培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行產(chǎn)物分析。
[0049] 發(fā)酵罐培養(yǎng)；將種子培養(yǎng)液按照體積比10%接種到含有化發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐 (工作體積5L)中，于37°C、氮?dú)馔?. 2vvm、攬拌轉(zhuǎn)速25化/min、流加5M化0H、維持發(fā)酵 液抑為7.0的條件下進(jìn)行發(fā)酵。
[0化0] 4.分析方法；
[0051] (1)采用高效液相色譜定性和定量分析發(fā)酵液中的各種有機(jī)酸、糖類和醇類等代 謝產(chǎn)物。
[0化2] 發(fā)酵液樣品預(yù)處理；將發(fā)酵液利用小型離屯、機(jī)100(K)r/min離屯、10分鐘，取上清 液，將上清液與氯仿按體積比1:1混合，lOOOOr/min再離屯、10分鐘，再取上清，用高純水稀 釋至合適的范圍，即為液相色譜檢測(cè)樣品。
[0化3] 儀器參數(shù)；液相色譜柱為AminexHPX-87H柱，柱溫65°C，流動(dòng)相為5mmol/L H2SO4,流速為0. 6血/min;檢測(cè)器為CTO-lOvp型折光示差檢測(cè)器，進(jìn)樣量為20yL。
[0化4] 發(fā)酵液各組分含量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到。
[005引 似甘油含量的測(cè)定；采用高艦酸鋼氧化法。向ImL的發(fā)酵液中加入lOmL7長(zhǎng)，滴加 2~3滴酪獻(xiàn)指示劑，加入1M化0H至粉紅色，加入10血高艦酸鋼，于避光環(huán)境中反應(yīng)5min后加入5血己二醇終止反應(yīng)，滴加化OH至變回原來的粉紅色，記錄化OH的用量，據(jù)此計(jì)算 甘油的濃度。
[0056] 做菌體濃度測(cè)定：分光光度法測(cè)定650nm下的光密度，W濁度表征細(xì)胞濃度。
[0化7]實(shí)施例1混菌篩選、菌株分離與鑒定 [0化引 1.混菌篩選
[0059] 在大連附近海域隨機(jī)采集藤壺、海藻、海綿和海泥樣品40份，在無菌超凈臺(tái)中，取 2g每份樣品（藤壺、海藻、海綿需先用無菌研鉢研磨成漿狀，海泥無需預(yù)處理），分別加入裝 有50mL富集培養(yǎng)基的250mLS角瓶中，瓶口用紗布和牛皮紙封口。37°C、200r/min搖床培 養(yǎng)24小時(shí)，獲得一級(jí)培養(yǎng)物；然后將ImL-級(jí)培養(yǎng)物接種到另一個(gè)含有種子培養(yǎng)基的=角 瓶中，同樣條件培養(yǎng)24小時(shí)，獲得二級(jí)培養(yǎng)物；同樣條件下進(jìn)行第=次富集。
[0060] 采用搖瓶發(fā)酵對(duì)上述獲得的各樣品的富集菌液進(jìn)行篩選，具體方法如下；將富集 菌液分別接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mLS角瓶中，瓶口用紗布和牛皮紙封口，37 °C、 2(K)r/min搖床中進(jìn)行種子培養(yǎng)12小時(shí)，然后將種子培養(yǎng)液接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的 250mL=角瓶中，同樣條件培養(yǎng)24小時(shí)。用高效液相色譜分析檢測(cè)發(fā)酵液中1，3-丙二醇的 濃度，從中選出產(chǎn)量較高的16組混菌。
[0061] 將上述16組混菌種子培養(yǎng)液分別進(jìn)行=次重復(fù)發(fā)酵，選出來自海泥、發(fā)酵性能穩(wěn) 定、且產(chǎn)量最高的混菌，40g/L甘油濃度下培養(yǎng)2化的發(fā)酵液中1，3-丙二醇濃度為16. 95g/ 以質(zhì)量轉(zhuǎn)化率為46. 70 %，將此混菌命名為NHN8。
[0062] 2.園株分罔與鑒走
[0063] 將混菌NHN8用稀釋涂布法涂布于固體種子培養(yǎng)基的平面皿上，37°C恒溫培養(yǎng)24 小時(shí)，得到3種不同形態(tài)的單菌落，菌落形態(tài)分別表現(xiàn)為無泡、平滑呈乳白色（圖1A);有 泡、氣泡大而單一（圖1B);有泡、氣泡小而致密（圖1C)。然后各挑取長(zhǎng)勢(shì)良好菌落5株， 轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基中，37°C、200r/min搖床中進(jìn)行種子培養(yǎng)12小時(shí)，再將種子培養(yǎng)液接入裝 有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL=角瓶中，同樣條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)24小時(shí)，并分析檢測(cè)發(fā)酵液 中PD0濃度，從中選出產(chǎn)量最高的菌株。
[0064] 5株菌落形態(tài)表現(xiàn)為無泡、平滑呈乳白色的菌株中產(chǎn)量最高的一株菌命名為W3， 2化發(fā)酵液中PD0濃度為9. 59g/L;5株菌落形態(tài)表現(xiàn)為有泡、氣泡大而單一的菌株中產(chǎn)量 最高的一株菌命名為Y1，2化發(fā)酵液中PD0濃度為1. 58g/L;5株菌落形態(tài)表現(xiàn)為有泡、氣泡 小而致密的菌株中產(chǎn)量最高的一株菌命名為Y5,2化發(fā)酵液中PD0濃度為6. 73g/L。
[0065] 分別將W3、Y1和Y5進(jìn)行染色鏡檢，均為桿狀細(xì)菌，革蘭氏陰性菌；接著對(duì)其 進(jìn)行16SrDNA測(cè)序鑒定，結(jié)果表明W3、Y1、Y5皆屬于克雷伯氏菌屬的肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiellapneumoniae)，保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中屯、，編號(hào)分別為CGMCC NO. 10440、CGMCCNO. 10439 和CGMCCNO. 10438。W3、Y1 和Y5 的 16SrDNA序列分別為序列 表中的序列1、2和3。
[0066] 實(shí)施例2混菌NHN8的批次發(fā)酵
[0067] 將實(shí)施例1中獲得的混菌饑的8(其中含有的S種細(xì)菌的菌體數(shù)比例為W3:Y1:Y5 =208:17:82)接入裝有100血種子培養(yǎng)基的250血S角瓶中，瓶口用紗布和牛皮紙封口， 37°C、200r/min搖床中進(jìn)行種子培養(yǎng)12小時(shí)，獲得種子培養(yǎng)液；然后把種子培養(yǎng)液按照 10 %體積比接種到裝有化發(fā)酵培養(yǎng)基的化發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基提前經(jīng)蒸汽滅菌后冷卻。 在37°C、250r/min、氮?dú)馔?. 2vvm、維持抑為7. 0條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵過程中，每 隔1或2小時(shí)取發(fā)酵液，用高艦酸鋼氧化法測(cè)定甘油濃度，用分光光度法測(cè)定菌體0D，并將 發(fā)酵液于1000化/min離屯、10分鐘，取上清進(jìn)行高效液相色譜分析。
[0068] 發(fā)酵結(jié)果如圖2所示，混菌NHN8發(fā)酵6小時(shí)便將40g/L的甘油消耗完，1，3-丙二 醇濃度達(dá)到20. 96g/l，生產(chǎn)強(qiáng)度為3. 49g/(L.h)，摩爾轉(zhuǎn)化率為0. 69mol/mol;副產(chǎn)物己醇 為1. 77g/l，乳酸為0. 84g/l，己酸為1. 95g/l，班巧酸為0. 81g/L。可見本發(fā)明的混菌饑的8 能夠高效地生產(chǎn)1，3-丙二醇，且副產(chǎn)物較少，無2, 3- 了二醇檢出。
[0069] 實(shí)施例3單菌W3的批次發(fā)酵
[0070] 按照實(shí)施例2所述的方法，將實(shí)施例1中獲得的單菌W3接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 小時(shí)，獲得種子培養(yǎng)液，然后把種子培養(yǎng)液按照10%體積比接種到