一種生物醫(yī)用鼠尾膠原蛋白的提取方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物醫(yī)用鼠尾膠原蛋白的提取方法。
【背景技術】
[0002]膠原蛋白是細胞外基質的主要組成成分，是動物體內(nèi)含量最多，分布最廣的蛋白質。膠原蛋白有著獨特的三股螺旋結構，并含有獨特的羥脯氨酸，具有良好的生物相容性和可生物降解性。與組織的形成、成熟、細胞間信息的傳遞以及關節(jié)潤滑、傷口愈合、鈣化作用、血液凝固和衰老等有著密切的關系。鼠尾膠原蛋白是I型膠原蛋白，I型膠原蛋白廣泛存在于動物的肌腱、皮膚、骨等組織中。I型膠原蛋白具有自組裝成纖維特性，可用于細胞培養(yǎng)及制作組織工程中的三維支架材料，使細胞在接近真實環(huán)境中生長。目前對于膠原的提取方法依然停留在傳統(tǒng)階段，如酸溶法、堿溶法、酶法、超聲法等，各有優(yōu)缺點。傳統(tǒng)方法不但提取率低，還容易破壞膠原蛋白的三股螺旋結構，降低其生物功能性。提取的膠原蛋白要用于生物醫(yī)藥方面，必須考慮到無菌性、生物相容性、免疫原性等問題。針對這些問題，至今未有生物醫(yī)用鼠尾膠原提取純化工藝的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了克服上述現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的為提供一種生物醫(yī)用鼠尾膠原蛋白的提取方法。
[0004]本發(fā)明的目的通過如下技術實現(xiàn):一種生物醫(yī)用鼠尾膠原蛋白的提取方法，包括以下步驟:
[0005](I)將無組織纖維、脂肪和多糖殘留的鼠尾腱，真空冷凍干燥備用；
[0006](2)凍干鼠尾腱經(jīng)低溫凍干粉碎至200?400目；
[0007](3)在冰水浴中將粉碎的鼠尾腱在醋酸溶液中溶脹，鼠尾腱與醋酸的固液比為I克:10mL?I克:120mL，期間不斷攪拌，防止凍結成塊，得到膠原溶脹液；
[0008](4)稱取胃蛋白酶加入到膠原溶脹液中，鼠尾腱與蛋白酶質量比為50: I?100: I，在4°C，48?74小時酶解，期間間歇性攪拌；
[0009](5)將黏稠的膠體溶液進行高速冷凍離心處理，收集上清液；在冰水浴中，用的3?6mol/L的NaCl溶液緩慢加入上清液中，不斷攪拌至溶液中白色的絮狀物不再析出，4°C沉淀10小時，去除上清液，絮狀溶液高速冷凍離心處理，收集沉淀；
[0010](6)用0.03?0.06mol/L的檸檬酸溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液；在冰水浴中，調(diào)節(jié)pH = 6.5，用的3?6mol/L的NaCl溶液緩慢加入上清液中，不斷攪拌至溶液中白色的絮狀物不再析出，4°C沉淀10小時，去除上清液，去除上清液，絮狀溶液高速冷凍離心處理，收集沉淀；
[0011 ] (7)用0.03?0.06mol/L的檸檬酸再次溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液，冰水浴中，調(diào)節(jié)PH = 6.5 ;溶液依次通過陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂進行脫鹽處理；
[0012](8)將脫鹽后的膠原蛋白溶液，-40至_20°C預凍2?4小時，然后真空冷凍干燥，凍干產(chǎn)品經(jīng)進一步處理得到含水率在3%以下的膠原蛋白微粉，滅菌、包裝，得到成品膠原蛋白粉末。
[0013]本發(fā)明還據(jù)有如下技術特征:
[0014]1、如上所述步驟(3)中醋酸溶液濃度為0.04?0.lmol/L,溶脹I?2小時。
[0015]2、如上所述步驟(4)中胃蛋白酶的酶活力1: 10000。
[0016]3、如上所述步驟(4) (5)和(6)中高速冷凍離心處理，溫度為4°C，轉速為8000?15000r/min，離心時間為15?30分鐘。
[0017]4、如上所述步驟(7)中依次通過732強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，D311大孔丙烯酸系弱堿陰離子交換樹脂。
[0018]5、如上所述步驟(7)進行脫鹽處理或用透析袋動態(tài)透析72小時，用硝酸銀檢測無沉淀析出，透析完成。
[0019]本發(fā)明所提供的膠原蛋白提取方法與現(xiàn)有技術相比，具有以下優(yōu)點:
[0020](I)、本發(fā)明從原料處理、提取過程、產(chǎn)品生成保證了試劑藥品和操作環(huán)境無菌，從而確保了提取的生物醫(yī)用膠原蛋白無菌無毒。
[0021](2)、本發(fā)明中采用控制原料預凍，真空冷凍干燥的方法可以保證原料的長期貯存，適于工業(yè)化生產(chǎn)。兩次冷凍干燥可以降低生物醫(yī)用材料的抗原性，大大提升應用安全性。
[0022](3)、本發(fā)明中所用的醋酸濃度低于傳統(tǒng)提取濃度，保證了膠原蛋白在酸性環(huán)境中三股螺旋結構的穩(wěn)定，從而保證膠原蛋白的生物功能性。
[0023](4)、本發(fā)明在提取后換用檸檬酸代替醋酸進行樣品的純化，比傳統(tǒng)方法提取的膠原蛋白，提高了其生物相容性，更適用于生物醫(yī)用材料。
[0024](5)、本發(fā)明簡化了生產(chǎn)工藝，結合多種酸溶法、酶解法提升了成品的提取率。提取率達到75?80%，純度達到98%以上，提取率有了顯著的提高，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0025]￠)、本發(fā)明提取的生物醫(yī)用鼠尾膠原蛋白可制成注射膠原，可取代常規(guī)整容中的硅膠等填充物，對疤痕組織進行填充性修復。對現(xiàn)有血管支架材料進行膠原修飾，可確保移植血管完全無血液漏出血管壁，進一步促進細胞和其它結締組織成分在移植血管表面生長增殖，充當移植修復的臨時支架。膠原精制而成的人工角膜，為盲人提供了更大希望。膠原縫線吸收好，是手術中的新材料。
【附圖說明】
[0026]圖1為膠原蛋白的傅里葉紅外光譜分析。
[0027]圖2為膠原蛋白的紫外光光譜分析。
[0028]圖3為膠原蛋白的圓二色譜分析。
[0029]圖4為膠原蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳分析；
[0030]其中，a為本發(fā)明所獲得的膠原蛋白，b為索萊寶蛋白marker。
【具體實施方式】
[0031]下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0032]實施例1
[0033]生物醫(yī)用鼠尾膠原蛋白的提取
[0034]一種生物醫(yī)用鼠尾膠原蛋白的提取方法，步驟如下:
[0035](I)取新鮮鼠尾1kg，置于1: 1000新潔爾滅液內(nèi)浸泡1min?15min，取出后用生理鹽水反復沖洗5次以上；分離鼠尾腱，去除鼠尾腱殘留的組織纖維等。NH4C1_生理鹽水溶液浸泡24h，4°C保持低速攪拌24h，中間換兩次液去除殘留的脂肪和多糖。去離子水沖洗5次，-20°C預凍4h，真空冷凍干燥備用；所述鼠尾來自于成年海貍鼠、各品系大鼠鼠尾或各品系小鼠鼠尾。
[0036](2)凍干鼠尾腱經(jīng)低溫凍干粉碎至200?400目；
[0037](3)在冰水浴中將鼠尾腱在0.06mol/L的醋酸溶液中溶脹2小時，期間不斷攪拌，防止凍結成塊；
[0038](4)、取14克胃蛋白酶加入到膠原溶脹液中，酶活力1: 10000，在4°C，74h酶解，期間間歇性攪拌；
[0039](5)將黏稠的膠體溶液用高速冷凍離心機4°C、12000r/min、離心30分鐘，收集上清液。在冰水浴中，用的4mol/L的NaCl溶液鹽析，4°C沉淀10小時，去除上清液，絮狀溶液用高速冷凍離心機4°C、12000r/min、離心30分鐘，收集沉淀；
[0040](6)、用0.06mol/L的檸檬酸溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液；冰水浴中，用50g/L的Na2HPO4標定pH = 6.5，用3mol/L的NaCl溶液鹽析，4°C沉淀10小時，去除上清液，絮狀溶液用高速冷凍離心機4°C、12000r/min、離心30分鐘，收集沉淀；
[0041](7)、用0.06mol/L的檸檬酸溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液，冰水浴中，用50g/L的Na2HPO4標定pH = 6.5 ;溶液依次通過732強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，D311大孔丙烯酸系弱堿陰離子交換樹脂，進行脫鹽處理。
[0042](8)、將脫鹽后的膠原蛋白溶液，_40°C預凍2小時，進而在真空冷凍干燥機中冷凍干燥，凍干產(chǎn)品經(jīng)進一步處理可得到膠原蛋白微粉(含水率在3%以下)，鈷60輻照滅菌、包裝，得到成品膠原蛋白粉末，純度達到98%以上。
[0043]實施例2
[0044]一種生物醫(yī)用鼠尾膠原蛋白的提取方法，步驟如下:
[0045](I)、取新鮮鼠尾lkg，置于1: 1000新潔爾滅液內(nèi)浸泡1min?15min，取出后用生理鹽水反復沖洗5次以上；分離鼠尾腱，去除鼠尾腱殘留的組織纖維等。NH4C1_生理鹽水溶液浸泡24h，4°C保持低速攪拌24h，中間換兩次液去除殘留的脂肪和多糖。去離子水沖洗5次，_40°C預凍2h，真空冷凍干燥備用；
[0046](2)、凍干鼠尾經(jīng)低溫凍干粉碎至200目；
[0047](3)在冰水浴中將粉碎的鼠尾腱在醋酸溶液中溶脹，鼠尾腱與醋酸的固液比為I克:100mL，醋酸溶液濃度為0.04mol/L，溶脹2小時，期間不斷攪拌，防止凍結成塊，得到膠原溶脹液；
[0048](4)稱取胃蛋白酶加入到膠原溶脹液中，鼠尾腱與蛋白酶質量比為50: 1，在4°C，胃蛋白酶的酶活力I: 10000，48小時酶解，期間間歇性攪拌;
[0049](5)、將黏稠的膠體溶液用高速冷凍離心機4°C、8000r/min、離心30分鐘，收集上清液。在冰水浴中，用的6mol/L的NaCl溶液鹽析，4°C沉淀10小時，去除上清液，絮狀溶液用高速冷凍離心機4°C、8000r/min、離心30分鐘，收集沉淀；
[0050](6)、用0.06mol/L的檸檬酸溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液；冰水浴中，用50g/L的Na2HPO4標定pH = 6.5，用3