MI-1640培養(yǎng)液（含10 %的FBS，青霉素100U/mL，鏈霉素100U/ mL, 0. 056%NaHC03，調(diào)節(jié)pH值至7. 4)，0. 22yn濾膜過(guò)濾滅菌后4°C保存。
[0029] 說(shuō)明：以下實(shí)施例中未作具體說(shuō)明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》（第三版）J.薩姆布魯克一書(shū)中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 進(jìn)行。
[0030] 實(shí)施例1
[0031] 草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80編碼基因fip-VV〇80的篩選和克隆
[0032] 將草菇所有基因序列在Pfam蛋白結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索，得到9084個(gè)分為2970 種的結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)信息，然后與灰蓋鬼傘、雙孢蘑菇、裂褶菌和糙皮側(cè)耳等不含有免疫調(diào)節(jié) 蛋白的食用真菌基因組的結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)相比對(duì)，發(fā)現(xiàn)草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-vvo和一個(gè)未 知蛋白具有相同的結(jié)構(gòu)域，并且它們的GO注釋（G0:0030246和G0:0002682)完全相同， GO注釋信息顯示這2個(gè)基因表達(dá)的蛋白都具有免疫調(diào)節(jié)功能。這個(gè)蛋白與草菇免疫調(diào)節(jié) 蛋白FIP-vvo的相似性達(dá)到95%。因此，從草菇基因組出發(fā)，通過(guò)生物信息學(xué)方法，發(fā)現(xiàn) 了一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的草葫免疫調(diào)節(jié)蛋白基因fip-vvo80。根據(jù)得到的fip-vvo80 基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物FIP-vvo80-F(NdeI5'-CATATGTCTACCGACITGA-3'）和 FIP-vvo80-R(EcoRI5'-CTTAAGTTAITCCACTGGGCA-3'），用基因克隆的方法克隆了 來(lái)源于菌株VolvariellavolvaceaV23(其ACCC保藏號(hào)為：50897)的草葫免疫調(diào)節(jié)蛋白 FIP-vvo80基因，DNA全序列分析結(jié)果表明，F(xiàn)IP-vvo80全長(zhǎng)339bp，其cDNA序列如SEQID NO. 2所示。
[0033] 實(shí)施例2
[0034] 重組草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-vvo80的制備
[0035] 將表達(dá)載體pET_28b(+)進(jìn)行雙酶切（EcoRI和Ndel)，同時(shí)將合成的編碼草菇 免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80的基因片段雙酶切（EcoRI和Ndel)，切出編碼成熟草菇免疫調(diào) 節(jié)蛋白FIP-VV〇80的基因片段與表達(dá)載體pET-28b(+)連接，獲得含有草菇免疫調(diào)節(jié)蛋 白FIP-vvo80基因的重組質(zhì)粒pET-FIP-vvo80并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，得到重組菌株 BL21-FIP-vvo80。
[0036] 分別吸取lmL含有重組菌株BL21-FIP-vvo80菌株和含有表達(dá)載體pET-28b(+)的 BL21菌株的37°C過(guò)夜搖好的新鮮菌液接種于100mL含有（50yg/mL)卡那霉素LB培養(yǎng)液 中，37°〇，250卬111/111111，211，00~0.3，加入 200 1^濃度為5011^/1111的1?丁6,25°〇，250卬111/ min，誘導(dǎo)培養(yǎng)4h后，離心收集菌體。然后用于超聲破碎（工作3s，間歇5s，工作電壓300W， 全程20-30min)，并離心收集上清。研宄結(jié)果顯示重組草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80的表達(dá) 量為436mg/L。SDS-PAGE結(jié)果表明，重組草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80在大腸桿菌中得到 了表達(dá)。所表達(dá)的草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80含量達(dá)到電泳純（圖1)。
[0037] 實(shí)施例3
[0038] 重組草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80的促細(xì)胞因子白介素IL-2分泌活性測(cè)定
[0039] 通過(guò)ELISA方法檢測(cè)重組免疫調(diào)節(jié)蛋白促進(jìn)人白血病細(xì)胞Jurkat細(xì)胞分泌白介 素（IL-2)的作用，以測(cè)定其免疫調(diào)節(jié)活性。
[0040] 將Jurkat細(xì)胞懸浮液倒入15mL離心管中，1000rpm/min，離心3min，去除上清。 加入2mL的RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%的FBS，青霉素100U/mL，鏈霉素100U/mL，0? 056% NaHC03，調(diào)節(jié)pH值至7. 4)重新懸浮細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
[0041] 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Jurkat細(xì)胞懸浮液稀釋至1X107細(xì)胞/mL，按每孔200yL接種 于96孔培養(yǎng)板，分別加上重組免疫調(diào)節(jié)蛋白和表達(dá)載體蛋白PBS溶液，使總蛋白終濃度為 10yg/mL。另設(shè)陰性對(duì)照組（只加細(xì)胞和培養(yǎng)液，PBS取代樣品）和陽(yáng)性對(duì)照組（只加PMA、 PHA、細(xì)胞和培養(yǎng)液，不加樣品）。每個(gè)樣品做3個(gè)平行孔。在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。
[0042] 吸出細(xì)胞培養(yǎng)液于1. 5mL離心管中，1000rpm/min，離心3min，收集上清。根據(jù) ELISAKIT96THumanIL-2試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行白介素2的檢測(cè)。
[0043] 加入100yL樣品、陰性對(duì)照組（只加細(xì)胞和培養(yǎng)液，PBS取代樣品）和陽(yáng)性對(duì)照 組（只加PMA、PHA、細(xì)胞和培養(yǎng)液，不加樣品）上清，同時(shí)取標(biāo)準(zhǔn)品人IL-2,分別稀釋至終濃 度為31. 52、125、250、500pg/mL作為陽(yáng)性對(duì)照和制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用PBS做陰性對(duì)照，加每個(gè) 樣品做2個(gè)平行孔。
[0044] 放于37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90min，小心吸出上清液，每孔350yL洗滌液洗滌4次，倒 置濾紙上，盡量空干液體，最后一次拍干。
[0045] 每孔加入100yL生物素化抗體工作液，放于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60min。洗滌液洗 板同上。
[0046] 每孔加入100yL酶結(jié)合物工作液，放于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min。洗滌液洗板同 上。
[0047] 每孔加入100yL顯色液，放于37°C培養(yǎng)箱中暗反應(yīng)10-20min。
[0048] 每孔加入100yL終止液，立即放入酶標(biāo)儀，于450nm測(cè)定吸光值并記錄讀數(shù)，5min 內(nèi)完成此步操作。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品中IL-2含量。
[0049] 研宄結(jié)果表明1yg重組免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80促進(jìn)人白血病細(xì)胞Jurkat細(xì)胞 分泌白介素2 (IL-2)含量在68. 404pg。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80,其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQID NO. 1所示。
2. -種編碼如權(quán)利要求1所述的草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80的基因，其特征在于： 所述基因的cDNA序列如SEQIDNO. 2所示。
3. -種含如權(quán)利要求1所述的草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80的重組載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-woSO的重組載體，其特征在于： 所述重組載體為pET-28b(+)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80的重組載體，其特征在于： 將草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80基因插入到pET-28b(+)上的EcoRI和NdeI限制性酶切位 點(diǎn)之間，得到重組載體pET-FIP-vvo80。
6. -種含如權(quán)利要求1所述的草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80的重組菌株。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80的重組菌株，其特征在于： 所述重組菌株為BL21-FIP-vvo80〇
8. -種草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80的制備方法，包括： (1) 采用權(quán)利要求3或4的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到重組菌株； (2) 培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80的表達(dá)； (3) 超聲破碎獲取所表達(dá)的草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種草葫免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-vvo80的制備方法，其特征在于： 所述步驟（1)中的宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-vvo80及其制備方法，蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。制備方法包括：(1)采用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到重組菌株；(2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-vvo80的表達(dá)；(3)超聲破碎獲取所表達(dá)的草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-vvo80。根據(jù)本發(fā)明的對(duì)機(jī)體具有免疫調(diào)節(jié)作用的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白及其基因序列，可以制備出提高人體免疫力的保健食品，防治由于免疫力下降所導(dǎo)致的疾病的危害。
【IPC分類(lèi)】C12N15-31, C12N15-70, C12R1-19, C12N1-21, C07K14-375
【公開(kāi)號(hào)】CN104817635
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510217508
【發(fā)明人】王瑩, 鮑大鵬, 汪瀅, 王榮, 唐利華, 茅文俊, 周陳力, 龔明, 李燕, 萬(wàn)佳寧
【申請(qǐng)人】上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開(kāi)日】2015年8月5日
【申請(qǐng)日】2015年4月30日