一種重組胰島素及胰島素類似物前體純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及胰島素生產(chǎn)方法領(lǐng)域，特別涉及一種重組胰島素及胰島素類似物前體 純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是僅次于心血管和腫瘤的第三大致死疾病，2014年世界糖尿病患者已達(dá) 3. 87億，且每年呈加速上升數(shù)目。胰島素是治療糖尿病的特效藥，特別是晚期患者治療時(shí)， 沒有其它藥物可以代替，隨著糖尿病患者人群不斷擴(kuò)大及胰島素給藥方式的多樣化增加， 胰島素用量正迅速增加。在胰島素的發(fā)展過程中，動物胰島素由于免疫原性及瘋牛病和動 物口蹄疫等傳播性疾病的蔓延，臨床已逐漸淘汰；以甘精胰島素、門冬胰島素、賴脯胰島素、 地特胰島素及德谷胰島素為代表的重組胰島素類似物臨床上已得到廣泛應(yīng)用，并占據(jù)了絕 大部分胰島素市場。
[0003] 隨著重組DNA技術(shù)的進(jìn)展，利用微生物如大腸桿菌、畢赤酵母、釀酒酵母等發(fā)酵平 臺，獲得大量的表達(dá)胰島素前體成為現(xiàn)實(shí)，特別是巴斯德畢赤酵母，它以甲醇作為唯一碳源 并采用廉價(jià)的BSM培養(yǎng)基進(jìn)行高密度發(fā)酵，高效分泌表達(dá)重組蛋白，發(fā)酵成本低。但是在畢 赤酵母發(fā)酵過程中不僅會產(chǎn)生大量色素，而且發(fā)酵液中殘留的無機(jī)鹽含量非常高，電導(dǎo)率 值可達(dá)到40-50mS/cm，所以表達(dá)的胰島素前體在純化前，必須對發(fā)酵上清液進(jìn)行超濾換液 或適當(dāng)稀釋來降低電導(dǎo)，以便胰島素原可以結(jié)合層析填料而實(shí)現(xiàn)分離純化。
[0004] 眾所周知，常規(guī)胰島素前體純化方式為采用0. 5~1. 0M NaCl、pH值為2~4的酸 性緩沖液線性梯度洗脫，這種方式得到的人胰島素類似物前體溶液pH為酸性，且存在的大 量的Na +不僅能抑制酶的活性，而且還需要進(jìn)行更換緩沖液及除去金屬離子才能進(jìn)行后續(xù) 酶切反應(yīng)，延長生產(chǎn)周期，增加生產(chǎn)成本。
[0005] 專利CN1699412A中公開的使用常規(guī)的陽離子交換柱（SP-fast flow)純化胰島 素類似物前體（MIP)，但常規(guī)離子交換層析需對樣品大體積稀釋以降低鹽濃度或超濾脫鹽 處理后才能進(jìn)行純化分離，延長了生產(chǎn)周期，增加了生產(chǎn)設(shè)備的投入；該專利實(shí)施例4中 公開了應(yīng)用XAD-7疏水吸附填料（Sigma公司）分離純化-旋蒸除有機(jī)試劑-凝膠過濾 (Sephadex G25)除去色素和部分多糖，然后利用陽離子交換柱SP-Fast flow(Amersham Biosciences公司）除去多脂類等雜質(zhì)，收集的胰島素前體（MIP)純度90%以上，其所采用 的工藝步驟長、有機(jī)試劑消耗大、疏水吸附層析交換容量低、脫鹽步驟產(chǎn)率低，不適合大規(guī) 模的生產(chǎn)。
[0006] 專利CN101029077A公開了一種活性炭結(jié)合陽離子交換（填料為：SP550EC)、超濾 脫鹽的策略純化基因重組胰島素前體，在發(fā)酵液直接加入處理后的活性炭，經(jīng)過攪拌后離 心、上清再次經(jīng)活性炭過濾、透過液經(jīng)陽離子柱層析、超濾脫鹽、凍干獲得胰島素前體。該工 藝步驟也需要對上清液進(jìn)行透析除鹽，工藝步驟同樣繁瑣，不適合規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。
[0007] 專利CN 102816819 A通過將胰島素類似物前體蛋白依次采用離子交換和反相層 析方法純化，但該方案依舊存在前述層析填料不能耐受高鹽上樣，需要對樣品脫鹽處理，因 此提出的方案很難應(yīng)用于規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。
[0008] 綜上所述，重組表達(dá)的胰島素及胰島素類似物前體在純化制備過程中存在的常規(guī) 層析填料不能耐受高鹽上樣、常規(guī)疏水填料在層析中存在的無機(jī)鹽、有機(jī)試劑用量大、成本 高、污染嚴(yán)重的問題，所以純化工藝在策略上不得不增加降低鹽濃度的工藝步驟，如增加超 濾換液脫鹽、大體積稀釋等工藝步驟，這樣不僅增加設(shè)備投入，且很大程度的降低了胰島素 前體回收率，因此從畢赤酵母發(fā)酵的高鹽上清液中提取純化目的蛋白的方法是胰島素純化 制備工藝的難點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明針對現(xiàn)有重組胰島素前體及重組胰島素類似物前體純化制備工藝上的技 術(shù)不足，提出一種操作簡便、成本更低的制備工藝方法。
[0010] 本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟：
[0011] (1)發(fā)酵液前處理：發(fā)酵液經(jīng)酸調(diào)節(jié)pH，通過離心或過濾等獲得含胰島素前體或 胰島素類似物前體蛋白的上清液；所得發(fā)酵液電導(dǎo)率范圍在10-55mS/cm之間；
[0012] (2)平衡：用酸性平衡緩沖液平衡層析柱的柱床；
[0013] (3)上樣：將步驟（1)中的上清液上樣至步驟（2)中的層析柱，然后用步驟（2)中 的酸性平衡緩沖液沖洗未吸附的雜質(zhì)；
[0014] (4)洗脫：用洗脫緩沖液洗脫步驟（3)中的層析柱，得重組胰島素或胰島素類似物 前體的洗脫峰。
[0015] 所述步驟（1)發(fā)酵液前處理中，調(diào)節(jié)pH的酸可以是冰乙酸、鹽酸、硫酸、磷酸中的 一種或幾種，pH調(diào)節(jié)至2. 0-6. 0;所述上清液的電導(dǎo)率在10~55mS/cm之間；所述上清優(yōu) 選pH為3. 0-4. 0,優(yōu)選電導(dǎo)率為20~40mS/cm條件下上樣吸附。
[0016] 所述步驟（2)中所采用的層析柱中層析填料為Capto S、Capto MMC、Uni PMM S、 Uni MSP中的任何一種，裝填的高度為8-25cm，優(yōu)選8-15cm。其中Capto MMC為復(fù)合弱陽離 子交換配基，Capto S為復(fù)合強(qiáng)陽離子交換配基，UniPMMS和UniMSP是高交聯(lián)聚丙烯酸酯或 聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物為基質(zhì)的單分散聚合物填料。
[0017] 上述填料中Capto系列是新一代以高度交聯(lián)的瓊脂糖凝膠為基質(zhì)的新型填料； MMC為復(fù)合配基的陽離子交換基團(tuán)，S為復(fù)合配基的強(qiáng)陽離子交換基團(tuán)；其吸附過程具有耐 鹽特性，所以該配基可在高電導(dǎo)率下直接進(jìn)樣并且和蛋白結(jié)合在配基上。
[0018] Uni PMM S、Uni MSP是以聚苯乙稀/二乙稀苯或聚丙稀酸酯基質(zhì)新一代聚合物填 料，S、MSP表示其交換基團(tuán)為強(qiáng)陽離子交換基團(tuán)。Uni系列填料廣泛應(yīng)用于小分子有機(jī)物、 蛋白、多肽、核酸、天然產(chǎn)物和化學(xué)合成藥物的高效分析和分離純化過程中。聚苯乙烯/二 乙烯苯或聚丙烯酸酯基質(zhì)使其具有一定的疏水性，其吸附過程具有耐鹽特性，可在高電導(dǎo) 率下直接進(jìn)樣并且和蛋白結(jié)合在配基上。
[0019] 所述步驟（2)和步驟（3)中的酸性平衡緩沖液為甘氨酸-鹽酸緩沖液、鄰苯二 甲酸-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液、檸檬 酸-檸檬酸鈉緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液中的任一種；平衡酸性緩沖液濃 度為5~200mM，優(yōu)選10-100mM，更優(yōu)選20-50mM;緩沖液的pH為2. 0~6. 0,優(yōu)選范圍是 3. 0~4, 0〇
[0020] 所述步驟（4)中洗脫堿性緩沖液為甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液、 磷酸鹽緩沖液中的一種緩沖體系，洗脫堿性緩沖液的濃度范圍為5mM~200mM，優(yōu)選范圍 20-100mM ;pH 為 8. 0 ~10. 0,優(yōu)選 pH8. 0-9. 5。
[0021] 本發(fā)明對重組胰島素前體、胰島素類似物前體或其衍生物具有非常廣泛的適用 性，業(yè)內(nèi)專業(yè)人員可依據(jù)本發(fā)明而改進(jìn)或優(yōu)化胰島素或其類似物前體的制備方法，其純化 制備工藝對多種胰島素類似物前體均適用。
[0022] 本文所用的術(shù)語"重組"，指采用基因工程手段，應(yīng)用重組DNA或重組RNA的技術(shù)從 而獲得的蛋白質(zhì)。
[0023] 本文所用的術(shù)語"胰島素"指人胰島素、牛胰島素、豬胰島素等天然胰島素。
[0024] 本文所用的術(shù)語"胰島素類似物"指對天然胰島素進(jìn)行氨基酸位點(diǎn)突變、缺失或添 加，使其具有新的生理特性的一類胰島素，如甘精胰島素、門冬胰島素、賴脯胰島素、DesB 3° 胰島素等。
[0025] 本文所用的術(shù)語"前體"，指天然胰島素及突變后的胰島素，如人胰島素、豬胰島 素、牛胰島素、門冬胰島素、甘精胰島素、賴脯胰島素等未形成胰島素雙鏈結(jié)構(gòu)的前體蛋白。
[0026] 與傳統(tǒng)的提取純化方法相比，本發(fā)明具有明顯的技術(shù)效果：
[0027] (1)不需要對發(fā)酵液上清中過量的無機(jī)鹽采用稀釋、超濾換液等方法去除，該方法 中的層析柱能直接在高鹽條件下吸附、分離重組胰島素前體或類似物前體，一步收率85% 以上，純度90%以上的前體，并能除去絕大部分色素，由原來的多步工藝直接一步分離純 化，降低了工藝時(shí)間和設(shè)備投資成本；
[0028] (2)與親水性的疏水交換層析相比，不需使用大量的無機(jī)鹽做流動相；與非水相 疏水吸附相比，不使用大量的有機(jī)試劑，對環(huán)境污染小，成本更低；
[0029] (3)本發(fā)明中利用洗脫緩沖液洗脫的胰島素前體加入胰蛋白酶后可直接高效進(jìn)行 酶切反應(yīng)制備DesB 3°_胰島素，工藝連續(xù)性更好，操作步驟簡單，耗時(shí)短。
【附圖說明】
[0030] 圖1為實(shí)施例1中55mS/cm高鹽條件下利用Capto S柱分離純化胰島素前體的制 備圖和相應(yīng)胰島素前體洗脫峰的HPLC分析圖譜；
[0031] 圖2為實(shí)施例2中Capto MMC 55mS/cm高鹽條件下柱分離純化胰島素前體圖譜和 相應(yīng)胰島素前體洗脫峰的HPLC分析圖譜；
[0032] 圖3為實(shí)施例3中UniPMM S 55mS/cm高鹽條件下柱分離純化胰島素前體圖譜和 相應(yīng)胰島素前體洗脫峰的HPLC分析圖譜；
[0033] 圖4為實(shí)施例4中Uni MSP 55mS/cm高鹽條件下柱分離純化胰島素前體圖譜和相 應(yīng)胰島素前體洗脫峰的HPLC分析圖譜； 實(shí)施例
[0034] 本發(fā)明實(shí)施例公開了一種重組胰島素及胰島素類似物前體純化方法，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝，需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技 術(shù)人員來說是輕而易舉的，它們都被視為包括在本發(fā)明中。
[0035] 實(shí)施例1:利用本申請中的填料Capto S和對照填料SP-S印harose 6FF分離重組 人DesB3°胰島素前體
[0036] (1)發(fā)酵液前處理：發(fā)酵液來源于畢赤酵母發(fā)酵液，經(jīng)鹽酸調(diào)整pH為2. 0,離心 處理15min，8000g，4-10°C，收取離心上清液，測定電導(dǎo)率值55mS/cm;HPLC檢測上清純度 38%，含量3.511^/1111;
[0037] 為實(shí)驗(yàn)不同的電導(dǎo)率對純化結(jié)果的影響，將上述電導(dǎo)率為55mS/cm的發(fā)酵，用水 調(diào)節(jié)為40、20、10mS/cm的3份，分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0038] (2)設(shè)備/填料/緩沖溶液
[0039] 設(shè)備：AKTAPure Ml層析設(shè)備（美國GE公司），全波長紫外檢測器，流速范圍 0? 01_20ml/min〇
[0040] 層析柱：XK16/20柱，檢測波長：280nm。
[0041] 層析填料：填料1:本技術(shù)方案中的填料Capto S，柱床高度：8cm;柱體積20ml (自 行裝填）；填料2 :普通層析填料SP-Sepharose 6FF :柱長：8cm ;柱體積20ml ;
[0042] 進(jìn)樣體積：70~80ml，線性流速：300cm/h，體積流速：10ml/min。
[0043] 平衡緩沖液：100mM甘氨酸_鹽酸緩沖液，pH2. 0;
[0044] 洗脫緩沖液：200mM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，pH10. 0
[0045] (3)操作步驟
[0046]a.以平衡緩沖溶液平衡填料5個柱床體積，10ml/min，至UV基線走平或波動 ^ 10mAU ；
[0047] b. 10ml/min，進(jìn)樣 60 ~100ml;
[0048]c?以平衡緩沖溶液平衡填料5個柱床體積，10ml/min ;
[0049] d.以洗脫緩沖溶液洗脫，收集峰，HPLC檢測結(jié)果。
[0050] (4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0051