嗦甲酯氯巧2mg，0. 32mmol)，室溫反應(yīng) 12小時后，向反應(yīng)液加水50ml，乙酸乙醋提取（50mlX3)，飽和食鹽水（l〇(M)洗涂，干燥， 濃縮，殘留物柱層析分離純化，洗脫劑石油酸：乙酸乙醋（4 :1)。得黃色固體112mg(6-2-5)， 產(chǎn)率 83. 1%。古NMR(300MHz，DMSO-de) 5:2. 13(S,3H,-邸3)，2. 15-2. 21 (m, 4H,-邸2)，3. 3 2-3. 38 (m, 4H,-邸2)，3. 53(S,3H,-0邸3)，3. 64(S,3H,-0邸3)，5. 21(S,2H,-0邸2)，5. 35(S,2H, -0邸2)，6. 62 (S, 1H, 3-H)，6. 88 (S, 1H, 8-H)，6. 98 化甜，J= 9Hz, 3'，5' -H)，7. 95 化甜，J = 9Hz，2' ,6' -H)，12.32(s，lH，5-0H).ESI-MS:m/z501[M+H]\
[0094] 實施例14 5, 7-二徑基-2-(4-徑基苯基）-4H-色酬-甲基贓嗦基甲酸醋（1-2-5) 的制備
[0095]
[009引取6-2-5巧Omg, 0.lOmmol)加入到5ml二氯甲燒和5ml乙酸的混合溶液中，冰浴冷 卻下加入鹽酸（1ml)，室溫反應(yīng)2小時后，反應(yīng)液加入水20ml，乙酸乙醋提?。?0mlX3)，飽 和食鹽水（20ml)洗涂，干燥，濃縮，殘留物柱層析分離純化，洗脫劑石油酸：乙酸乙醋（4 : 1)。得黃色固體34mg(I-2-5)，產(chǎn)率82. 5%。古NMR(300MHz，DMS0-de) 5 :2. 12(s，3H，-CH3)，2 .14-2. 20 (m, 4H,-邸2)，3. 30-3. 36 (m, 4H,-邸2)，6. 60(S,1H, 3-H)，6. 86(S,1H, 8-H)，6. 92 (d, 2H，J= 9Hz，3' ,5' -H)，7.96(d，2H，J= 9Hz，2' ,6' 29(s，lH，5-0H).ESI-MS:m/ z413[M+田+。
[0097]按W上方法分別制備得到1-1-2、1-1-3、1-1-6、1-2-2、1-2-3和1-2-6,結(jié)構(gòu)式如 下：
[0098]
[0099] 實施例15燈盞乙素巧元胺基類衍生物對凝血時間的影響
[0100] 目前，抗血栓化合物的篩選常規(guī)方法是考察化合物抑制血小板聚集的活性和對凝 血時間的影響，本發(fā)明通過測定化合物對凝血時間的影響來考察各化合物抗血栓活性。
[0101] 具體方法：取健康雄性家兔，30mg/kg家兔體重的戊己比妥鋼生理鹽水溶液耳緣 靜脈注射麻醉，手術(shù)分離頸總動脈取血，收集于塑料離屯、管中，3. 8 %構(gòu)祿酸鋼水溶液抗凝 (血與抗凝劑體積比為9:1)。80化/min離屯、lOmin，制備富血小板血漿（Platelet-rich plasma,PRP)，3000;r/min離屯、lOmin，制備貧血小板血漿（Platelet-poorplasma，PPP)。
[0102] 將燈盞乙素巧作為對照組，燈盞乙素巧元胺基類衍生物作為實驗組，將樣品溶于 80% 乙醇中，配成初始濃度分別約為 1. 2mg/ml、0. 6mg/ml、0. 3mg/ml、0. 15mg/ml、0. 075mg/ ml的溶液。
[0103]PT(凝血酶原時間）的測定：
[0104] 原理：凝血活酶與巧離子混合物能使凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟福甘估w維蛋白 原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白凝塊，凝塊形成的時間與血漿中的外源性凝血因子含量呈負相關(guān)。
[0105] 方法：測試杯中加入溶媒或受試樣品PPP50^以在37°C預(yù)溫孔內(nèi)預(yù)溫 3min，將測試杯轉(zhuǎn)入測試通道，加入37°C預(yù)溫的誘導(dǎo)劑PT試劑100yL記錄PPP凝固的時 間。
[0106]APTT(活化部分凝血活酶時間）的測定：
[0107] 原理：待測血漿加入活化部分凝血活酶溶液，纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，測定凝 固所需的時間，即為待測血漿活化部分凝血活酶時間（APTT)。如果內(nèi)源性途徑有缺陷，凝固 時間即延長，并與單因子缺乏的程度成正比。同樣也與內(nèi)源性途徑所需因子的累積缺乏成 正比。
[0108] 方法：測試杯中溶媒或受試樣品lOiiL、加入PPP50iiL和預(yù)溫的APTT試劑 50 ]1以在37°C預(yù)溫孔內(nèi)預(yù)溫5min，將測試杯轉(zhuǎn)入測試通道，加入37°C預(yù)溫的誘導(dǎo)劑化CI2 試劑50yL記錄PPP凝固的時間。
[0109]TT(凝血酶時間）的測定：
[0110] 原理：待測血漿加入標定的凝血酶溶液，纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，測定凝固所 需的時間，即為待測血漿凝血酶時間（TT)。
[0111] 方法：測試杯中加入溶媒或受試樣品PPP50^以在37°(：預(yù)溫孔內(nèi)預(yù)溫 3min，將測試杯轉(zhuǎn)入測試通道，加入室溫的誘導(dǎo)劑TT試劑50yL記錄PPP凝固的時間。 [011引 FIB(纖維蛋白原）的測定：
[0113] 原理：定量測定纖維蛋白原是普遍使用的經(jīng)典方法，運種方法是在加入凝血酶后 測定稀釋血漿的凝集時間。
[0114] 方法：①：標準曲線的制備：將復(fù)溶后的定值血漿分別制成1:5、1:10、1:15、1:20、 1:30的稀釋血漿。取不同濃度的稀釋血漿各200ii^37°C預(yù)溫3分鐘，然后分別加入FIB 試劑100y以測定凝固時間，由血凝儀自動生成曲線并保存。②：測試杯中加入溶媒或受試 樣品10yLPPP50yL在37°C預(yù)溫孔內(nèi)預(yù)溫3min，將測試杯轉(zhuǎn)入測試通道，加入室溫的凝 血酶（FIB) 50yL記錄PPP凝固的時間或濃度。
[0115]W上所有實驗數(shù)據(jù)Wtx±S)表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗，具體實驗結(jié)果如表1 所示。
[0116] 表1部分化合物對凝血酶時間的影響情況
[0117]
[011引從W上數(shù)據(jù)可W看出，燈盞乙素巧元胺基類衍生物1-1-1、1-1-2、1-1-3、1-1-4、 1-1-5與1-1-6、1-2-4、1-2-5抗凝血活性要比燈盞乙素強，其中1-1-1、1-1-2、1-1-3、 1-1-4、1-1-5、1-1-6的TT、PT、APTT比燈盞乙素長，而FIB比燈盞乙素低。1-2-4、1-2-5的 TT、PT、APTT比燈盞乙素長，而FIB比燈盞乙素高。燈盞乙素巧元胺基類衍生物1-2-6抗凝 血活性與燈盞乙素活性相當，其TT、PT比燈盞乙素長，APTT比燈盞乙素短，F(xiàn)IB比燈盞乙素 局。
[0119] 實施例16燈盞乙素巧元胺基類衍生物體外PC12細胞氧化損傷模型的保護活性實 驗
[0120] 實驗原理：
[0121] 燈盞乙素對屯、腦缺血再灌注后損傷保護作用機制目前尚不清楚。有研究認為是屯、 腦組織缺血再灌注后，組織中的氧化自由基（R0巧大量產(chǎn)生，從而造成細胞的氧化損傷。分 化的PC12細胞在形態(tài)和功能上具有典型的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的特征，被廣泛用于研究神經(jīng) 元細胞死亡機制、神經(jīng)生長因子的作用機制、神經(jīng)用藥的療效和毒理作用等。&〇2是氧化自 由基（R0巧的主要成分之一，是一種常用的細胞氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑，廣泛用于誘導(dǎo)細胞調(diào)亡 模型的研究。
[0122] 研究發(fā)現(xiàn)燈盞乙素對過氧化氨化2〇2)和谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細胞氧化損傷有顯著 的保護作用，能顯著改善PC12細胞氧化還原能力、抑制&〇2誘導(dǎo)的細胞膜憐脂酷絲氨酸外 翻、抑制&〇2誘導(dǎo)的DNA氧化斷裂、抑制caspase-3活性、促進Bd-2基因的mRNA表達、降 低細胞內(nèi)活性氧自由基（R0巧和Ca2+的濃度、穩(wěn)定線粒體膜電位等。研究廣泛認為燈盞乙 素可W提高腦缺血病理狀態(tài)下神經(jīng)細胞氧化還原的能力，防治腦缺血神經(jīng)細胞損傷。在燈 盞乙素的活性評價體系中常WPC12細胞為體外模型，W&〇2與PC12細胞作用模擬細胞的 氧化損傷，研究燈盞乙素巧元胺基類衍生物對PC12細胞擬缺血性損傷的保護作用。
[0123]M1T法是利用活細胞線粒體中存在的與NADP相關(guān)的脫氨酶能使外源性的漠化四 氮挫藍（MTT)還原，生成成難溶性的藍紫色結(jié)晶物（Formazan)并沉積在細胞中，死細胞無 此功能。二甲基亞諷值MS0)或S聯(lián)液（10%SDS-5%異下醇-O.Olmol/L肥1)能夠溶解細 胞中的紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長處測定其吸光值間接反映其活細胞數(shù) 量。
[0124] 操作方法：取同一代PC12細胞，消化后按5X104 ?血準種于96孔板中，每孔 100y以放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2地。將實驗分為空白對照組和電〇2損傷模型，每組設(shè)5個 復(fù)孔?？瞻讓φ战M為無血清的DMEM培養(yǎng)液。&〇2損傷模型組為選取400ymol，L1的H202 損傷時間1小時后，加入100yL受試藥物，考察受試藥物濃度分別為400ymol?L1 (高）、 200ymol?L1 (中）、100ymol?L1 (低）時對PC12細胞氧化損傷模型的保護活性。
[012引 MTT法檢測細胞活力：加入20yLMTT(5mg?血1)，置培養(yǎng)箱中解育地后避光加 入150yLDMS0,輕輕振搖10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標儀檢測在570nm處的吸光度 (0D值）。
[0126] 樣品WDMS0溶解，培養(yǎng)液稀釋至2. 5%，受試藥的終濃度為100ymol'L1，燈盞乙 素作為陽性對照；數(shù)據(jù)均W(取±s)表示，組間用t檢驗，實驗結(jié)果見表2。
[0127] 從W上活性數(shù)據(jù)可W看出，燈盞乙素巧元胺基類衍生物1-1-3、1-1-5、1-1-6對 &〇2誘導(dǎo)的PC12細胞氧化損傷的保護作用與燈盞乙素相當，在50iiM濃度下，其抑制率 分別為72. 16%、70. 89%、68. 75%，在25yM濃度下，其抑制率分別為49. 63%、47. 52%、 46. 28 %，燈盞乙素在50yM濃度和25yM濃度下的抑制率分別為79. 07 %、53. 01 %。其他衍 生物1-1-1、1-1-2、1-1-4、1-2-2也具有較強的氧化損傷保護作用，在50yM濃度下，其抑制 率分別為66. 23%、67. 15%、64. 77%、63. 52%，在25yM濃度下，其抑制率分別為44. 17%、 45. 32%、43. 18%、42. 36%。
[012引表2PC12細胞氧化損傷抑制率及其水溶性檢測結(jié)果
[0129]
[0130] 實施例17燈盞乙素巧元胺基類衍生物溶解性測定
[0131] 藥物溶解性等理化性質(zhì)可W影響藥物的吸收及其生物利用度，燈盞乙素由于其水 溶性醋溶性差、體內(nèi)容易代謝而影響了其生物利用度，為了考查燈盞乙素巧元胺基類衍生 物在水中的溶解度，采用紫外分光光度法測定。
[0132] 取燈盞乙素及其巧元胺基類衍生物各Img，用少量甲醇溶解，然后加甲醇定容至 100ml容量瓶中，即得化合物10yg/ml的標準溶液。
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