MgClzl. 5mmol/L、dNTPs2. 5mmol/L、上述正反向引物各0.5mmol/L、lU化姐臟聚合酶，PCR 的運(yùn)行程序如下：預(yù)變性941：4111111;然后941：3〇3,561：4〇3,721：453,34個(gè)循環(huán)；最后 72°C繼續(xù)延伸10min，PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢。
[0048] (2)PCR產(chǎn)物純化
[0049] 上述PCR產(chǎn)物用上海生工生物工程有限公司的GelExtractionKit試劑盒進(jìn)行 純化，具體步驟如下：首先從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1. 5mL離屯、管，加 入400yL溶膠液，50-60°C水浴至膠徹底融化，加熱融膠時(shí)，每2min混勻一次，冷卻至室溫； 將離屯、柱放入收集管中，把混合液移至離屯、柱，室溫放置2min; 12000r/min離屯、Imin，此時(shí) DM被吸附到柱上；倒掉收集管中廢液，將離屯、柱放入同一個(gè)收集管中，加入700yL洗脫 液，12000r/min離屯、Imin;倒掉收集管中的廢液，12000r/min離屯、Imin;將離屯、柱放入一 預(yù)先準(zhǔn)備好的滅菌1. 5mL離屯、管中，加入40yL洗脫液或雙蒸水（抑> 7. 0)，室溫或37°C放 置2-3min(提高洗脫溫度至55-80°C有利于提高DNA的洗脫效率，可洗脫兩次。）；12000r/ min離屯、Imin，離屯、管中的液體即為回收的DM片段。
[0050] 3、利用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法檢測(cè)分子標(biāo)記
[0051] 將上述獲得的PCR產(chǎn)物直接送到北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，直接 從測(cè)序色譜圖（見圖4)上進(jìn)行基因型分析。
[0052] 實(shí)施例2本發(fā)明的分子標(biāo)記在不同豬群中的多態(tài)性分布檢測(cè)驗(yàn)證
[0053] 申請(qǐng)人在大白豬、長(zhǎng)白豬和梅山豬=個(gè)群體中檢測(cè)了豬ACADL基因兩處多態(tài)性分 布頻率分布頻率，檢測(cè)結(jié)果如表1所示：在第498bp處的A/T多態(tài)性分布，在中國地方豬品 種中A等位基因占主要優(yōu)勢(shì)，而在國外豬種中T等位基因占主要優(yōu)勢(shì)，中、外豬品種中存在 顯著差異。同時(shí)我們也檢測(cè)到：在第508bp處的A/G多態(tài)性分布，在中國地方豬品種中A等 位基因占主要優(yōu)勢(shì)，而在國外豬種中G等位基因占主要優(yōu)勢(shì)。中、外豬品種中也存在顯著差 異。
[0054] 表1ACADL基因第6內(nèi)含子兩SNPs的等位基因在不同品種中的分布結(jié)果 陽化引
[0056] 實(shí)施例3本發(fā)明克隆的分子標(biāo)記與豬脂肪沉積性狀的關(guān)聯(lián)分析及應(yīng)用
[0057] 1、單體型的構(gòu)建
[0058] 將上述利用PCR-直接測(cè)序法得到的所有的個(gè)體的兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)輸 入Haploview軟件（一種自由下載軟件），可W計(jì)算得到各個(gè)體的單倍型，同時(shí)計(jì)算位點(diǎn)之 間的成對(duì)連鎖不平衡程度，用標(biāo)準(zhǔn)化的連鎖不平衡系數(shù)D'表示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)位點(diǎn)間連鎖 不平衡系數(shù)D'等于1，即為完全連鎖不平衡。兩種單體型AA和TG占所有等位基因的頻率 分別為38. 6%和61. 4%，構(gòu)成3種單體型組合AA/AA，AA/TG，TG/TG。
[0059] 2、單體型組合與豬生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析
[0060] 用于關(guān)聯(lián)分析的試驗(yàn)豬群為308頭大白X梅山F2代資源群體，該生物材料 已經(jīng)發(fā)表，參見文獻(xiàn)Liuetal.AssociationofMYF5andMY0D1genepolymo;rphisms andmeatqualitytraitsinLargeWhiteXMeishanF2pigpopulations.Biochem Genet. 2008, 46:720-732 (血樣委托華中農(nóng)業(yè)大學(xué)豬遺傳育種農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室采集），采 用實(shí)施例1所建立的PCR-直接測(cè)序法進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，用SAS統(tǒng)計(jì)軟件（SASInsti化te Inc,Version8. 0)GLM程序進(jìn)行方差分析，分析豬RTL1基因3種不同單體型組合與豬禍體 和肉質(zhì)性狀的相關(guān)關(guān)系，所采用模型為： 陽061] Y；jk=Ji+Gi+Sj+Yk(+bijkXijk) +e；jk
[0062]YUk為性狀表型值，y為平均值，Gi為基因型效應(yīng)，SpYk為固定效應(yīng)，分別為性 另IJ、年度效應(yīng)，bi,k為屠宰體重或屠宰日齡的回歸系數(shù)，禍體性狀W屠宰體重為協(xié)變量，肉質(zhì) 性狀W屠宰日齡為協(xié)變量，euk為殘差效應(yīng)。結(jié)果列于表2。
[0063] 由表2可W看出：基因型不同時(shí)，肩部腰厚、6-7腰椎間腰厚、臀部腰厚和背最長(zhǎng)肌 肌內(nèi)脂肪含量等性狀存在顯著差異（P<〇. 05)平均背腰厚性狀存在極顯著差異（P<0. 01)， 單倍型TG/TG有利于降低脂肪含量，單倍型AA/AA是提高肌內(nèi)脂肪含量的優(yōu)勢(shì)基因型。
[0064] 表2豬ACADL基因第6內(nèi)含子單體型組合與脂肪性狀的統(tǒng)計(jì)分析表 陽0化]
[0066] 注：（1)、W上數(shù)值為最小二乘均值+標(biāo)準(zhǔn)誤；同行含有相同字母表示差異不顯 著，不同小寫字母表示差異顯著（P<〇. 05)，不同大寫字母表示差異極顯著（P<0. 01);基因 型效應(yīng)*表示P< 0. 05, **表示P< 0. 01。
[0067] 主要參考文獻(xiàn) W側(cè) 1.架貽宏，路寧，王基偉，等.輔酶A的生化功能和應(yīng)用[J].中國生化藥物雜 志，2003, 24(3) : 159-161.
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種與豬脂肪沉積性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，其核苷酸序列如下所示： GTGGAAAATGGAATGAAAGGATTTGTTAAGGGGCGAAAGCTACATAAAATAGGACTAAAAGCTCAGGTAAG CCATAATATAAATTTGTATTTATAATATAACTTACAATATAAATTGTTTGTAAATATAATTCATATTTATTATTTA TTAATAAATTGAGTCTACTCATTACGTTTCCTGTATAGAATTACATATAGCACAATCGTACCTTCCTTCCTATGCTG GATTCTTAAAATATGCTTTTCAGTAATGATAGTGGTATTTCATTGTTTATGCAACTGTGGTCAGCAATGGAAGTGAA TCAGTGTTTTGAAAATCTGCTTTAGAAGTGGCAACATTAACTGCATGCTAATAGACCCTCTAGTTATGAAATGGATG AAAAAAATATGAAATAAGAACAGAAAATATTTTTTCTACTATTTGGTAATTTTTTCATTACCAAAAAGAAAAGCATG TTTTATTTGATAGGCATTAGAAATCCTTAATCCTCAATACCTWCAGAACTGGRCAGTATTAGAGCTAGAATGATAAT GTATTGCAGTGGGAAAGTCACTTTTGGAATCAGTGGGAAATGGGTTTGAATCCCTGGTTTACCACTTACGAGTTGTG TTCATTAACCACTCCAACTTGGTTTTCAGTTTTGTTTTATTTTGTTTTTAATGGAAATAATATTAGTCTCATCAGGT TATTGG 上述序列中498bp處的W是A或T，508bp處的R是A或G。2. 擴(kuò)增如權(quán)利要求1所述遺傳標(biāo)記的引物對(duì)，其特征在于，該引物對(duì)的序列如下所示： 正向引物：GTGGAAAATGGAATGAAAG， 反向引物：CCAATAACCTGATGAGACT。3. -種豬脂肪沉積性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 從豬耳組織中提取基因組DNA，根據(jù)豬ACADL基因序列設(shè)計(jì)引物對(duì)，該引物對(duì)的序列如 權(quán)利要求2所示，用權(quán)利要求2所示的引物對(duì)在豬基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純 化、克隆測(cè)序，獲得如權(quán)利要求1所示的核苷酸序列。4. 權(quán)利要求1所述的遺傳標(biāo)記在豬脂肪沉積性狀檢測(cè)中的應(yīng)用。5. 權(quán)利要求2所述的引物對(duì)在豬脂肪沉積性狀檢測(cè)中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于家畜分子標(biāo)記制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及與豬脂肪沉積性狀相關(guān)的SNP遺傳標(biāo)記及應(yīng)用。從豬ACADL基因中克隆獲得一種作為分子標(biāo)記應(yīng)用的豬脂肪沉積性狀的基因片段，其核苷酸序列如附圖3所示，在序列的第498bp處有一個(gè)A/T的堿基替換，第508bp處有一個(gè)A/G的堿基替換，這兩處突變位點(diǎn)的等位基因頻率在中外豬種中存在顯著的差異。本發(fā)明還公開了該分子標(biāo)記的制備方法以及其在脂肪沉積性狀多態(tài)性檢測(cè)中的應(yīng)用，為豬的標(biāo)記輔助選擇提供了一個(gè)新的標(biāo)記。
【IPC分類】C12N15/10, C12Q1/68, C12N15/11
【公開號(hào)】CN105200146
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510705036
【發(fā)明人】喬木, 武華玉, 梅書棋, 彭先文, 吳俊靜, 雷彬, 宋忠旭, 孫華, 李良華, 劉貴生, 李明波, 董斌科
【申請(qǐng)人】湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
【公開日】2015年12月30日
【申請(qǐng)日】2015年10月27日