出人、小鼠、 大鼠、倉鼠、兔、山羊、驢、豬、牛、馬、雞、猴、黑猩猩等。
[0290] 為了獲得來源于不同物種的雜交瘤，B細胞的來源和除了 B細胞之外的其它細胞 的來源可適當?shù)剡x自，例如在上文"產(chǎn)生單克隆IgA抗體的方法"部分中描述的工序1中提 到的來源，并且進行組合。來源于不同物種的雜交瘤的來源例如可舉出人、小鼠、大鼠、倉 鼠、兔、山羊、驢、豬、牛、馬、雞、猴、黑猩猩等。
[0291] 藥物組合物
[0292] 本發(fā)明的藥物組合物包含本發(fā)明的單克隆IgA抗體。
[0293] 本發(fā)明的藥物組合物不受到特別限制，并且合適地用于治療例如腸內(nèi)疾病。本發(fā) 明的藥物組合物更優(yōu)選用于治療由腸內(nèi)細菌的異常增殖和/或腸內(nèi)細菌叢的病變引起的 腸內(nèi)疾病。腸內(nèi)細菌的異常增殖和/或腸內(nèi)細菌叢的病變?nèi)缭谏衔?單克隆IgA抗體"部 分中所述。
[0294] 由腸內(nèi)細菌的異常增殖和/或腸內(nèi)細菌叢的病變引起的腸內(nèi)疾病不受到特別限 制，例如可舉出炎癥性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、變態(tài)反應、哮喘、肥胖癥和自身免 疫性疾病等，其中，炎癥性腸病是優(yōu)選的。
[0295] 本發(fā)明的藥物組合物只要包含有效量的本發(fā)明的單克隆IgA抗體即可，例如， 考慮到例如目標腸內(nèi)疾病的類型、劑型、給藥方法、給藥對象、給藥對象的癥狀程度和通 過給藥實現(xiàn)的效果程度，可適當設(shè)置使l〇〇wt%藥物組合物中的本發(fā)明的抗體的含量在 0· 00lwt% 至 99. 99wt% 的范圍內(nèi)。
[0296] 本說明書中使用的術(shù)語"有效量"指使本發(fā)明的單克隆IgA抗體能發(fā)揮治療腸內(nèi) 疾病效果的量，或能實現(xiàn)上述期望的藥理學和/或生理學效果（腸內(nèi)疾病的治療效果）的 量。
[0297] 與本發(fā)明的單克隆IgA抗體一起，藥學上可接受的載劑或添加劑可被并入到本發(fā) 明的藥物組合物中。在此使用的詞語"藥學上可接受的載劑或添加劑"指可選的載劑、稀釋 劑、賦形劑（excipient)、懸浮劑、潤滑劑、佐劑、賦形藥（vehicle)、遞送系統(tǒng)、乳化劑、崩解 劑、吸收劑、防腐劑、去污劑、著色劑、香料或甜味劑?？墒褂靡阎妮d劑或添加劑。
[0298] 本發(fā)明的藥物組合物適用于治療腸內(nèi)疾病的方法，包括將該組合物給予患上述腸 內(nèi)疾病的個體。本發(fā)明的藥物組合物適用于腸內(nèi)疾病的預防方法，其中該預防方法包括將 該組合物給予還沒有發(fā)展成上述腸內(nèi)疾病的病狀或癥狀，但可能具有腸內(nèi)疾病的誘因的個 體。這些個體可用作本發(fā)明的藥物組合物的給藥對象。
[0299] 用作給藥對象的個體不受到特別限制，例如可舉出人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、倉鼠、 狗、貓、融鼠等。
[0300] 根據(jù)作為給藥對象的個體所患的腸內(nèi)疾病的類型、性別、種屬、年齡、一般狀態(tài) (generalconditions)、疾病的嚴重程度和期望的效果程度等，可適當?shù)卮_定藥物組合物 的劑量和給藥方法。劑量可被適當?shù)卦O(shè)置在〇. 〇〇lmg/kg/天至100mg/kg/天的范圍內(nèi)。 [0301] 給藥方法不受到特別限制。直接給藥到胃腸道中是優(yōu)選的。給藥方法的實例包括 經(jīng)口給藥、經(jīng)鼻給藥、粘膜給藥、經(jīng)腸道給藥等。
[0302] 經(jīng)腸道給藥不限制于通過肛門給藥，例如在胃痿中，經(jīng)腸道給藥包括通過從個體 外插入到胃腸道中的管道等給藥。插入消化道中的位置不限于腸道，可舉出食道、胃、小腸 (包括十二指腸、空腸、回腸等）、大腸（包括盲腸、結(jié)腸、直腸等）等等。
[0303] 上述劑量的本發(fā)明的藥物組合物可以每天單一劑量或多次劑量的形式給藥。給藥 間隔可以是每天一次、每隔一天一次、每星期一次、每隔一星期一次、每隔2至3星期一次、 每個月一次或每隔2至3個月一次，只要能實現(xiàn)治療上述疾病的效果。
[0304] 經(jīng)口或經(jīng)腸道的組合物
[0305] 本發(fā)明的經(jīng)口或經(jīng)腸道的組合物包含本發(fā)明的單克隆IgA抗體。經(jīng)口或經(jīng)腸道的 組合物的應用實現(xiàn)了抑制腸內(nèi)細菌的異常增殖和/或腸內(nèi)細菌叢的病變的效果。腸內(nèi)細菌 的異常增殖和/或腸內(nèi)細菌叢的病變?nèi)缭谏衔?單克隆IgA抗體"部分中所述。
[0306] 在經(jīng)口或經(jīng)腸道的組合物中包含的單克隆IgA抗體的混合比率不受到特別限制， 并且可以根據(jù)經(jīng)口或經(jīng)腸道的組合物的形式、用法等進行適當?shù)卣{(diào)節(jié)，基于經(jīng)口或經(jīng)腸道 的組合物的總量，混合比率通?？梢允羌s0.OOlwt%至99wt%。
[0307] 作為本發(fā)明的經(jīng)口或經(jīng)腸道的組合物在其中使用的對象的個體不受到特別限制， 例如可舉出人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、倉鼠、狗、貓、融鼠等。
[0308] 如上所述，在本發(fā)明的經(jīng)口或經(jīng)腸道的組合物中包含的單克隆IgA抗體具有抑制 腸內(nèi)細菌的異常增殖和/或腸內(nèi)細菌叢的病變的效果，因此可具體用作控制腸道功能的組 合物、改善腸內(nèi)環(huán)境的組合物、使腸內(nèi)環(huán)境最優(yōu)化的組合物或者防止腸內(nèi)腐敗的組合物。
[0309] 只要在經(jīng)口或經(jīng)腸道的組合物能發(fā)揮效果的范圍內(nèi)，則本發(fā)明的經(jīng)口或經(jīng)腸道的 組合物的劑量不受到特別限制，并且可以根據(jù)攝取該經(jīng)口或經(jīng)腸道的組合物的個體的物 種、目標效果、實現(xiàn)效果的目標程度、其它多種條件等進行設(shè)置。具體地，該劑量可以轉(zhuǎn)換成 本發(fā)明的單克隆IgA抗體的量，通常是0. 001mg/kg/天至100mg/kg/天，該量可以每天一次 或幾次來攝取。
[0310] 如在上文"藥物組合物"部分中所述，經(jīng)腸道給藥不限于通過肛門給藥。例如，本 發(fā)明的腸內(nèi)組合物可與已知組分調(diào)配在一起，以用作腸灌洗液。
[0311] 本發(fā)明的經(jīng)口或經(jīng)腸道的組合物包含本發(fā)明的單克隆IgA抗體，其中本發(fā)明的單 克隆IgA抗體實現(xiàn)抑制腸內(nèi)細菌的異常增殖和/或腸內(nèi)細菌叢的病變的效果。在期望實 現(xiàn)這樣的效果的情況下，本發(fā)明的經(jīng)口或經(jīng)腸道的組合物可適當?shù)赜迷谑澄锘蝻暳系念I(lǐng)域 中。因此，本發(fā)明的經(jīng)口或經(jīng)腸道的組合物可用作食物組合物或飼料組合物。
[0312] 作為食物組合物，本發(fā)明的經(jīng)口或經(jīng)腸道的組合物專門適用于食物領(lǐng)域中。這樣 的食物組合物可被提供為表現(xiàn)出能控制腸道功能、改善腸內(nèi)環(huán)境、使腸內(nèi)環(huán)境最優(yōu)化、防止 腸內(nèi)腐敗等的食物組合物。
[0313] 作為上述食物組合物，除了普通的食品之外，可舉出包含有條件的特定保健用食 物的特定保健用食物、營養(yǎng)補充食物、功能性食物、醫(yī)療食物等。
[0314] 食物組合物的特定形式不受到特別地限制，例如可舉出：飲料，諸如軟飲料、碳酸 飲料、能量飲料、果汁飲料、乳酸飲料和乳飲料；冷凍甜食，諸如冰淇淋、冰凍果子露和刨冰； 蜜餞，諸如糖果、口香糖、巧克力、壓片糖果、零食蜜餞（snackconfectionery)、餅干、果凍、 果醬、奶油、燒烤蜜餞；面條，諸如蕎麥面、小麥面粉面條、粉絲、中華面和方便面；魚和牲畜 的加工食品，諸如蒲鋅（魚香腸）、火腿和香腸；乳制品，諸如經(jīng)加工的奶產(chǎn)品和經(jīng)發(fā)酵的奶 產(chǎn)品；油和脂肪的加工食品，諸如色拉油、天麩羅、人造黃油、蛋黃醬、起酥油、生奶油和調(diào)料 (dressing);調(diào)味品，諸如蘸醬和其它調(diào)味醬；和，湯、燉菜、沙拉、日常菜肴、米飯調(diào)味品、 腌菜、面包、谷類食品等等。特定保健用食物、營養(yǎng)補充食物、功能型食物等的形式可以是粉 末、顆粒、膠囊、錠劑、片劑、糖漿等。
[0315] 作為飼料組合物，本發(fā)明的經(jīng)口或經(jīng)腸道的組合物專門適用于飼料領(lǐng)域中。這樣 的飼料組合物可被提供為表現(xiàn)出能控制腸道功能、改善腸內(nèi)環(huán)境、使腸內(nèi)環(huán)境最優(yōu)化、防止 腸內(nèi)腐敗等的飼料組合物。
[0316] 只要能實現(xiàn)上述本發(fā)明的飼料組合物的效果，飼料組合物的特定形式就不受到特 別限制，并且可以是例如與常用飼料混合，可選地與能與常用飼料調(diào)配在一起的組分混合， 以獲得飼料組合物，還可以使用飼料組合物本身作為飼料。
[0317] 疾病的治療方法
[0318] 根據(jù)本發(fā)明的疾病的治療方法是腸內(nèi)疾病的治療方法，其中該方法包括：將有效 量的本發(fā)明的單克隆IgA抗體、本發(fā)明的藥物組合物或本發(fā)明的經(jīng)口的組合物給予患腸內(nèi) 疾病的人。
[0319] 患腸內(nèi)疾病的人可以是上文"藥物組合物"部分中提到的給藥對象。特定的給藥 方法和劑量也可以如上文"藥物組合物"部分中所述。
[0320] 實施例
[0321] 下面將對本發(fā)明進行更詳細地描述，但是本發(fā)明當然并不限于下面的實施例。
[0322] 實施例1 :抗體的制備
[0323] 1-1 :腸道粘膜固有層細胞的分離
[0324] 在長濱生物科學技術(shù)大學（NagahamaInstituteofBio-Scienceand Technology)的實驗設(shè)施中，將8周齡野生型C57BL/6小鼠（CLEAJapan,Inc.)飼養(yǎng)至20 周齡，在這一期間，小鼠可自由獲得食物和水。隨后，使用二氧化碳對小鼠實施安樂死，然后 進行剖腹手術(shù)以移出整個小腸。從移出的小腸樣品中移除結(jié)締組織和派伊爾氏淋巴集結(jié)之 后，縱向切開小腸，并在充滿PBS的10cm平皿中洗掉腸道內(nèi)容物。通過進一步更換PBS三 次至四次，對小腸進行充分清洗。
[0325] 與野生型C57BL/6小鼠一樣，還從表達在AID蛋白質(zhì)的N末端側(cè)引入突變的AID G23S的小鼠（AIDG23S小鼠）中收集小腸。這樣的AIDG23S小鼠可使用已知的方法產(chǎn)生， 例如在非專利文獻18中公開的方法。
[0326] 接著，將含有ImMEDTA的50mlPBS放入50ml的管子中。將清洗過的小腸切成 0. 5至lcm的長度，添加到管子中。在37°C搖動20分鐘，將小腸片段收集到濾網(wǎng)中，然后丟 棄PBS。進一步，將小腸片段放入如上所述的管子中。在劇烈搖動10秒之后，再次將小腸片 段收集到濾網(wǎng)中，然后以相同方式丟棄PBS。使用50mlPBS對小腸劇烈搖動10秒，重復兩 次。
[0327] 之后，將加熱至37°C的50ml消化酶溶液放入50ml的管子中，其中50ml消化酶溶 液使用500mlRPMI1640、25mlFCS(終濃度為5% )、2μ1 2-巰基乙醇（終濃度為55μM)、 〇. 75g膠原酶和5ml分散酶（終濃度為lU/ml)制得。使用剪刀將小腸片段進一步切成小 塊，并且添加到管子中。在37°C搖動60分鐘之后，使管子靜止10秒，以使小腸組織下沉。 然后將上清液轉(zhuǎn)移到新的50ml的管子中。這種使用消化酶液體進行消化的過程進行兩次。
[0328] 在消化過程中分離的上清液在4°C、1，500rpm離心5分鐘，丟棄上清液。得到的沉 淀物進一步被懸浮在lml含有2 %FCS的RPMI1640中。使懸浮液通過過濾器，以去除組織 部分，將得到的細胞懸浮液儲存在冰上。
[0329] 在上述的第二次酶反應進行60分鐘之后，以相同的方式回收細胞懸浮液。兩種細 胞懸浮液（即在第一次酶反應之后獲得的細胞懸浮液和在第二次酶反應之后獲得的細胞 懸浮液）合起來，得到的懸浮液用作腸道粘膜固有層細胞。
[0330] 產(chǎn)生IgA的雜交瘤的制備
[0331] 在"腸道粘膜固有層細胞的分離"部分中獲得的腸道粘膜固有層細胞與小鼠的骨 髓瘤NS1細胞融合，制備雜交瘤。在細胞融合之前進行NS1細胞的培養(yǎng)和維持。細胞融合 使用由STEMCELL Technologies提供的ClonaCell (注冊商標）-HY雜交瘤克隆試劑盒的試 劑，按照試劑盒的方案進行。
[0332] 然后，使獲得的雜交瘤在含甲基纖維素的培養(yǎng)基中生長，以按照試劑盒的方案進 行克隆。之后，從生長的雜交瘤中分離來源于每一個亞克隆的上清液。對包含在上清液中 的抗體，進行ELISA，以檢測產(chǎn)生的抗體是否是IgA，以測量上清液中的IgA的抗體滴度。然 后，分離產(chǎn)生IgA的雜交瘤克隆。因此，證實一共建立了 37個克隆。
[0333] 使用Isogenii(NipponGeneCo.，Ltd.)從每一個克隆中提取RNA，并且使用RNA 作為模板合成cDNA。然后，使用抗體Vh區(qū)域的7種引物（MH1至MH7)和Cα區(qū)域特異性引 物（IgAR)進行RT-PCR。表3示出這些引物的具體的堿基序列。
[0334] 表 3
[0335]
[0336] *在表中的堿基序列中，S表示G或C ;R表示A或G ;N表示A、C、G或T ;M表示A 或C;W表示A或T;以及，V表示G、C或A。
[0337] 對VDJ區(qū)域擴增的PCR產(chǎn)物進行直接測序，以分析突變和VDJ使用的數(shù)量。分析 顯示，獲得17種產(chǎn)生IgA的雜交瘤作為獨立的克隆。這些獨立的克隆被分別稱為Wl、W2、W3、W4、W6、W7、Wll、W14、W24、W27、W28、W30、W32、W34、W37、W43 和W47。
[0338] 通過以相同方式進行試驗，從G23S小鼠獲得10種獨立的產(chǎn)生IgA的雜交瘤克隆。 這些克隆被分別稱為Gl、G8、G9、G10、G12、G14、G15、G16、G18 和G19。
[0339] 1-2:IgA抗體的制備
[0340] 將在上述"產(chǎn)生IgA的雜交瘤的制備"部分中獲得的27個產(chǎn)生IgA抗體的雜交瘤 克隆大規(guī)模分別培養(yǎng)在含10%FCS的RPMI1640中，并且通過離心收集培養(yǎng)上清液。隨后， 使獲得的培養(yǎng)上清液通過〇. 22μm過濾器，然后進行硫酸銨沉淀和對PBS的透析，從而部分 純化27種單克隆IgA抗體（在下面的實施例中也被稱為前面加有克隆名稱的"單克隆IgA 抗體"）。
[0341] 在另一方法中，將在形成產(chǎn)生IgA的雜交瘤的部分中獲得的27種雜交瘤克隆的每 一種單獨腹腔內(nèi)注射到免疫缺陷小鼠中，該免疫缺陷小鼠飼養(yǎng)10天至21天，然后從小鼠收 集腹水。在收集的腹水進行硫酸銨沉淀之后，使用ro-io柱將緩沖液替換成PBS。從而部分 純化27種單克隆IgA抗體。
[0342] 使用ELISA，測量通過上述方法制備的27種單克隆IgA抗體的每一種的濃度。在 測量中，山羊抗小鼠IgA(SouthernBiotech)用作以2μg/ml的量涂敷至固層上的抗體，而 ALP標記的山羊抗小鼠IgA(SouthernBiotech)用作以0. 5μg/ml的量進行檢測的抗體。 小鼠IgAκ(ImmunologyConsultantsLaboratory)用作標準樣品。
[0343] 1-3 :腸內(nèi)固有細菌的制備
[0344] 將喂養(yǎng)在NagahamaInstituteofBio-ScienceandTechnology的實驗設(shè)施的 SPF室中的野生型小鼠的糞便懸浮在PBS中，將稀釋的懸浮液涂布在血瓊脂平板上，并且在 37°C培養(yǎng)48小時至72小時。之后，對獲得的克隆直接進行16SrRNA基因的PCR。得到的 PCR產(chǎn)物進行測序，以鑒定出每一菌落的細菌。以這樣的方式，克隆六種小鼠腸內(nèi)細菌。
[0345] 克隆的小鼠固有的腸內(nèi)細菌具體是如下六個細菌物種：Enterorhabdus mucosicola、Escherichiacoli、Staphylococcusaureus、Lactobacillusmurinus、 Enterococcusfaecalis、Pseudomonasfulva〇
[0346] 1-4 :對腸內(nèi)細菌的結(jié)合能力和特異性的研究
[0347] 在最佳條件下培養(yǎng)一共13種腸內(nèi)細菌（即上述六種固有腸內(nèi)細菌的克隆物種和 下面在市場上購買的細菌），并且通過離心收集細菌細胞：Escherichiacoli(DH5α菌株： 獲自Τ0Υ0Β0Co.，Ltd·)、Lactobacilluscasei(獲自ATCC)、Coprococcuseutactus(獲自 ATCC)、Blautiacoccoides(獲自ATCC)、Megamonashypermegale(獲自ATCC)、Eubacterium rectale(獲自ATCC)和Bifidobacteriumbifidum(獲自ATCC)。
[0348] 具體地，將每一種細菌物種懸浮在0. 05M Na2C0#l沖液中，并且使用每一個細菌溶 液單獨涂敷ELISA平板。在通過已知方法進行封閉之后，單獨添加上述27種單克隆IgA抗 體（濃度為1. 4μg/ml)，以測量這些單克隆IgA抗體針對13種腸內(nèi)細菌的結(jié)合能力和特異 性。然后，根據(jù)已知的ELISA法，檢測細菌和抗體之間的結(jié)合。用于檢測的抗體與上面的相 同。
[0349] 圖1示出了結(jié)果。結(jié)果顯示，在27種單克隆IgA中，22種單克隆IgA(來源于野 生型小鼠的Wl、W3、W4、W6、W7、Wll、W14、W24、W27、W30、W32、W34、W43 和W45 單克隆IgA抗 體；來源于G23S小鼠的Gl、G9、G10、G12、G14、G15、G18和G19單克隆IgA抗體）與兩種以 上腸內(nèi)細菌物種結(jié)合。
[0350] 隨后，通過改變所使用的抗體的濃度，進行實驗來對比上述單克隆IgA抗體針對 腸內(nèi)細菌的結(jié)合強度。具體地，使用上述ELISA的測量方法來進行實驗。使用的單克隆IgA 抗體是W27、G15和G19單克隆IgA抗體。W2單克隆IgA抗體用作陰性對照。
[0351]使用的腸內(nèi)固有細菌是Staphylococcus aureus、Escherichia coli和 Enterococcus faecalis〇
[0352] 圖2示出了結(jié)果?？芍?，W27單克隆IgA抗體以濃度依賴的方式最有效地與幾種 腸內(nèi)細菌結(jié)合。
[0353] 使用W27單克隆IgA抗體、W27單克隆IgA抗體結(jié)合分泌因子的W27SC3F單克隆 IgA抗體、Wl1單克隆IgA抗體、W34單克隆IgA抗體、W43單克隆IgA抗體和G15單克隆IgA 抗體進行相同的實驗。W2單克隆IgA抗體用作陰性對照。
[0354] 如下制造W27SC3F單克隆IgA抗體。首先，從約1cm的野生型小鼠的小腸片段中 提取RNA。通過由Invitrogen生產(chǎn)的SuperscriptIII，使用RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應以獲 得cDNA。使用cDNA作為模板，并且使用兩種引物（EcoRISCF:5'-gaattcaccatgaggctcta cttg-3'，SEQIDN0:69 和FlagSC3R:5'-ctcgagtcacttgtcgtcatcgtctttgtagtccccggga tt-3'，SEQIDN0:70)，通過PCR擴增多聚免疫球蛋白受體的細胞外結(jié)構(gòu)域。在擴增中，將 FLAG標簽的堿基序列添加到反向引物中，從而可以使用抗FLAG抗體來檢測其蛋白在細胞 中的表達。擴增的DNA堿基序列編碼在SEQIDN0:71中示出的氨基酸序列。將FLAG標簽 的序列添加到C末端（mSC3F-FLAG)。
[0355] 獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性酶處理，并且被克隆到pcDNA3. 1 (+)載體（Invitrogen) 中。下面，將完成的表達載體稱為"pcDNA3.1(+)/mSC3F"。由Escherichiacoli制備 pcDNA3. 1 (+) /mSC3F的質(zhì)粒DNA，并且使用Nucleofector(ΑΜΑΧΑ)轉(zhuǎn)染到產(chǎn)生W27單克隆抗 體的雜交瘤中。然后使用G418進行選擇。根據(jù)上述從雜交瘤回收單克隆IgA抗體的方法， 從由此選擇的雜交瘤獲得W27SC3F單克隆IgA抗體。
[0356]而且，所使用的腸內(nèi)固有細菌是Enterococcus faecalis、Staphylococcus aureus、Escherichia coli和Pseudomonas fulva。
[0357] 圖3示出了結(jié)果。這一實驗還表明，W27單克隆IgA抗體以濃度依賴的方式最有 效地與每一種腸內(nèi)細菌結(jié)合。
[0358] 1-5 :使用單克隆IgA抗體對細菌進行的蛋白印記分析
[0359] Escherichiacoli(DH5α;可在市場上購買）、Escherichiacoli(來自小鼠腸 道內(nèi)容物的克隆菌株）、Pseudomonasfulva、Staphylococcusaureus和Eubacterium rectale用作腸內(nèi)細菌，并且每一種腸內(nèi)細菌都在適于每一種細菌物種的條件下，在10ml LB或最佳培養(yǎng)基中進行震蕩培養(yǎng)。在通過離心收集細菌細胞之后，將它們懸浮在含1 % NP-40的PBS中，在冰上進行聲處理，并且在冰上靜止30分鐘。然后通過離心獲得懸浮液。 將SDS緩沖液（含2-ME)添加到上清液中，并且通過在95°C進行10分鐘熱處理，來進行蛋 白變性。進行8%SDS-PAGE，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至過濾器。在封閉之后，進行蛋白印記法， 以通過Odyssey(LI-C0R)檢測信號，在該蛋白印記法中，使用W27、W30和W45單克隆IgA抗 體（2μg/ml)進行反應，然后使用山羊抗小鼠IgA(1μg/ml)(SouthernBiotechnology)和 IR800抗山羊IgG(0. 2μg/ml) (Rockland)進行反應，并且如果需要，使用經(jīng)標記的抗山羊 IgG進行反應。
[0360] 圖4示出了結(jié)果。結(jié)果顯示，W27、W30和W45單克隆IgA抗體與所有上述的細菌 提取物結(jié)合。因此，實驗結(jié)果暗示W(wǎng)27、W30和W45單克隆IgA抗體識別腸內(nèi)細菌的組成蛋 白質(zhì)之一為抗原。進一步，顯示該組成蛋白質(zhì)的分子量是約45kDa至50kDa。
[0361] 進一步，以與上述相同的方式，使用Eubacteriumrectale、Blautia coccoides、Coprococcuseutactus、Megamonashypermegale、Lactobacilluscasei和 Bifidobacteriumbifidum進行實驗。所使用的單克隆IgA抗體是W27。圖4示出了結(jié)果。 結(jié)果顯示，W27單克隆IgA抗體不與除了Eubacteriumrectale之外的其它細菌的提取物 中的蛋白質(zhì)結(jié)合。
[0362] 1-6 :對各種單克隆IgA抗體的氨基酸序列的分析
[0363] 在通過上述方法獲得的單克隆IgA抗體中，使用已知方法，來分析被證實與兩種 以上腸內(nèi)細菌結(jié)合的五種單克隆IgA抗體的氨基酸序列，即W27、W30、W34、W43和W11單克 隆IgA抗體。
[0364] 使用已知方法來分析氨基酸序列。具體地，進行5'RACE和3'RACE反應，以獲得 全長的喊基序列。根據(jù)In-Fusion(注冊商標）SMARTerTMDirectionalcDNA文庫構(gòu)建試 劑盒（Clontech)的程序，進行RACE法。對于重鏈，使用試劑盒中包括的引物和上述引物的 組合來進行序列分析。對于輕鏈，使用以下引物的組合來進行序列分析。
[0365] CkR:5'-