10 4,得到不同濃度的稀釋液；用無菌移液管分別取0. 2ml不同濃度的稀釋液涂布于肉 汁腺培養(yǎng)基平板上，每濃度涂平皿一個，重復(fù)3次，至于37°C溫箱中培養(yǎng)； (4) 純化 培養(yǎng)3-5d后，挑取不同形態(tài)的菌落在固體平板上劃線純化，直到分離得到單菌落； (5) 鏡檢 挑取單菌落固定在載玻片上，用革蘭氏染色法進行染色，干燥后，滴加香柏油，在高倍 鏡下觀察菌落形態(tài)； (6) 保存 挑取鏡檢時所用的單菌落接種于含有BPA液體培養(yǎng)基的S角瓶中，在37°C15化/min搖床中培養(yǎng)12h，至細菌長到對數(shù)期，薩取菌懸液接種于斜面培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)2d，在試 管中觀察到S型的菌種，再轉(zhuǎn)移到4°C的冰箱中斜面真空冷凍干燥保存，即得到連翅內(nèi)生細 菌LQ-A。
[0013] 所述革蘭氏染色法為，草酸錠結(jié)晶紫染色Imin,自來水沖洗，艦液染Imin,水洗， 95%的酒精脫色20s，水洗，番紅復(fù)染2min，水洗。
[0014] 所述的連翅內(nèi)生細菌LQ-A制備涂膜保鮮劑的方法，包括步驟如下：收集連翅內(nèi)生 細菌A發(fā)酵上清液，離屯、收集上清，0. 45ym濾膜過濾；然后按照濾液和質(zhì)量分數(shù)為1%的明 膠的體積比為2:1，將濾液添加到質(zhì)量分數(shù)為1%的明膠中，混合均勻后，即制備出涂膜保鮮 劑。
[0015] 所述連翅內(nèi)生細菌LQ-A的生物學(xué)鑒定，具體步驟如下： 1. 實驗材料 W上實驗所分離純化得到的連翅內(nèi)生細菌，該菌株編號標記為A 2. 培養(yǎng)基及化學(xué)試劑的配制 培養(yǎng)基：BPA培養(yǎng)基 配方：牛肉浸膏 3 g 蛋白腺 Sg 酵母浸出粉 Ig 葡萄糖 10 g 瓊脂 15-20 g 蒸饋水 1000 mL 化學(xué)試劑的配制 (1)0. 5mol/L邸TA(pH8.0) 186. 1g 邸TA-化甜20 20 g 化OH 加水定容至1000 mL(分裝后高壓滅菌備用）。
[001引 （2) 2XCTABDNA提取液（高壓滅菌備用） 2% (w：v)CTAB 50mmol / LTris-HCl 10mmol / L 化沈DTA 0. 7mol / L 化Cl (3)Imol/LTris-肥I(PH8. (U) 121.IgTris堿 42血 濃鹽酸 加水定容至1000mL(分裝后高壓滅菌備用）。
[0017] (4) 3mol/LNaAc(抑 5. 2) 408. 1gNaAc. 3肥0 加水定容至1000mL(分裝后高壓滅菌備用）。
[001引（5 )TE緩沖液（高壓滅菌備用） 10mmol/LTris-HCl1mmol/L邸TA(pH8.0) (6) 5xTBE電泳緩沖液膽液 54gTris堿 27.5g 棚酸 20 血 0. 5mol/L邸TA(pH8. 0) 加水定容至1000血。
[0019] (7)上樣緩沖液化X) 0. 25% 漠酪藍 0. 25% 二甲苯青FF 15% 聚薦糖 水溶液室溫保存。
[0020] (8 )氯仿：異戊醇，體積比24 :1。
[0021] (9 )酪：氯仿：異戊醇，體積比25 :24 :1。
[0022] (10) 75%乙醇：75血無水乙醇，用無菌去離子水定容至100血。
[002引 3.內(nèi)生菌活化 按照配方，配制BPA培養(yǎng)基； 將培養(yǎng)基、平皿、試管進行濕熱滅菌； (3)倒平板，待培養(yǎng)基凝固后，在超凈工作臺無菌環(huán)境下將A用劃線法接種于BPA平板 上，倒置，放在37 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到單菌落，拍照記錄菌落形態(tài)； 5.內(nèi)生菌鏡檢 取無油跡的干凈載玻片，滴一滴無菌蒸饋水，用接種環(huán)挑取少許菌體，于水滴邊緣輕輕 涂幾下.自然風(fēng)干，在火焰上通過幾次，固定涂片。用結(jié)晶紫初染2min，用水沖洗結(jié)晶紫液。 然后用艦液媒染Imin后用水沖洗，將片上的水甩干。再用95%乙醇脫色，最后用番紅液復(fù) 染2min，鏡檢。
[0024] 6.生物學(xué)鑒定 引物設(shè)計及合成 通用引物：27f:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3,； 1492r:5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3' ； 由上海英驗生物技術(shù)有限公司合成。
[00幼 提取基因組DNA 本發(fā)明采用CTAB法提取連翅內(nèi)生細菌的16srDNA，具體操作方法如下： (1)菌體培養(yǎng)：將目的菌接種于SmlBPB培養(yǎng)基中，于37°C，150r/min過夜培養(yǎng)（1化)， 獲得足夠的菌體。
[0026] (2)取10血菌液，分裝于1. 5血離屯、管中，1200化/min，2min，收集菌體，倒去上清 液，注意吸干培養(yǎng)基。
[0027] (3)加950mlTE緩沖液，重懸菌體，并加入100iil10%SDS(使用前于37°C預(yù)熱）， 混勻避免核酸酶和機械振蕩對DNA的降解，于37°C溫浴比，在冰上加5yL蛋白酶KUOmg/ 血），于37°C溫浴比。
[002引 （4)加入150yLCTAB/化Cl溶液，混勻后65°C溫浴SOmin后，再加入等體積的酪/ 氯仿/異戊醇（25/24/1)。
[0029] (5)充分混勻，放置lOmin，1200化/min離屯、lOmin，用槍慢慢吸取離屯、后的上清， 再加入等體積的氯仿/異戊醇（24/1)。
[0030] (6 )重復(fù)步驟5 )的操作。
[0031] (7)充分混勻，放置lOmin，12000;r/min離屯、lOmin。
[0032] (8)取出上清，加入0. 6~0. 8倍體積的異戊醇，混勻，室溫靜置30min后，12000r/ min離屯、2min。
[003引 （9)棄去上清，向沉淀中加入ImL70%乙醇洗涂，12000;r/min離屯、2min，倒掉上清， 倒置吸水紙自然驚干，加入50yLTE緩沖液溶解DNA，于-20°C冰箱保存。
[0034] 連翅內(nèi)生細菌的ISsrDNA檢測，具體步驟如下： (1)制膠：在電泳槽模板邊緣一側(cè)安置梳子，并使其與模板底部有1cm左右的空隙，稱 取0.225g瓊脂糖粉，加入25mLIxTAE緩沖液，在微波爐中加熱使之冷卻至不燙手為止 (60°C左右）充分混勻后，緩緩倒入膠膜內(nèi)。檢查一下梳子的齒下或齒間是否有氣泡。
[0035] (2)加樣：待凝膠完全冷卻后（于室溫放置30-45min)，小屯、移去梳子，將凝膠放人 電泳槽內(nèi)，加入IxTAE緩沖液于電泳槽內(nèi)，淹沒膠約Icm深。取10yL基因組DNA溶液與 IyL上樣緩沖液混勻，用微量移液器加入梳孔內(nèi)，加入3yLDL15000Marker作為DNA分 子量標準。
[0036] (3)電泳：插入電極，調(diào)至電壓于80V，穩(wěn)壓電泳約40min。當指示緩沖液距離前 沿1cm時，關(guān)閉電源。
[0037] (4)照相：在紫外透射儀裝置上觀察，并照相（圖4)。
[0038] 擴增 采用提取基因組做模板，借助引物進行PCR擴增，并用0. 9%的瓊脂糖凝膠電泳分析，從 圖4中可W看出提取的基因組DNA的PCR產(chǎn)物的條帶，證明了成功的擴增出了含有目的基 因的片段。
[0039]PCR反應(yīng)在PCR儀上完成，本實驗W細菌通用引物進行PCR擴增。
[0040] 基因擴增反應(yīng)體系（50yL)如下：
PCR反應(yīng)條件按照W下程序進行：94 °C預(yù)變性5min，94 °C變性1.5min，55 °C退火Imin，72 °C延伸I. 5min,然后進行35個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 °C延伸10min, 4 °C保存。 [00川 PCR產(chǎn)物的電泳檢測，具體操作步驟如下： (1)凝膠的制備：稱取0. 225g瓊脂糖，置于立角瓶中，加入25血TAE緩沖液，放入微 波爐中加熱至瓊脂糖全部溶解，取出搖勻。混勻后倒入插好梳子的電泳板中。室溫靜置約 30min,使凝固完全。將電泳板放入電泳槽中，小屯、拔去梳子，準備上樣。
[0042] (2 )加樣：1 0yLPCR反應(yīng)液加1yLDNA上樣緩沖液和1yL核酸染料，混勻后 上樣，加入3yLDL2000Marker作為DNA分子量標準。
[0043] (3)電泳：電壓 80V，40min。
[0044] (4)成像：將凝膠置于凝膠成像儀中拍照。
[0045] 測序 將PCR擴增產(chǎn)物送去測序公司測序，獲得未知菌株ISsrDNA的基因序列。LQ-A菌株ISsrDNA基因序列如沈QIDN0:3。
[004引NCBIblast序列檢索，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，具體步驟： (1) 登陸B(tài)last主頁：http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/; (2) 填寫表單信息，提交任務(wù)； (3) 查找與目的菌相似度高的基因序列； (4) 采用Mega5. 0軟件鄰位連接法進行聚類分析，進行1000次的相似度重復(fù)計算，構(gòu)建 內(nèi)生細菌系統(tǒng)發(fā)育樹進行種屬歸類，結(jié)果其屬于枯草芽抱桿菌; 相關(guān)實驗 一、連翅內(nèi)生細菌LQ-A的抑菌作用試驗，具體步驟如下： 1.